李 鰲 孫宏偉 崔 彥

英國研究者 Nicholson 等[1]基于磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)分析基礎(chǔ)于1999年首次提出代謝組學(xué)這一概念。代謝組學(xué)研究擁有組學(xué)研究的“終點(diǎn)”之稱，近年來迅猛發(fā)展、被生命科學(xué)家寄予厚望，目前被用作發(fā)掘多種疾病包括腫瘤的診斷、治療相關(guān)代謝標(biāo)志物，闡釋病理狀態(tài)或揭示機(jī)體接受有關(guān)診療后的生物學(xué)表現(xiàn)，并用于評(píng)價(jià)藥物毒性、揭示其作用機(jī)制和藥物相關(guān)基因功能等研究[2]。本文將就代謝組學(xué)的特點(diǎn)、基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展做一綜述。

一、代謝組學(xué)的特點(diǎn)與研究方法

代謝組學(xué)(metabolics)主要應(yīng)用于探究相對(duì)分子質(zhì)量很小(<150)的分子物質(zhì)，后者多為糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝過程的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物，這些小分子物質(zhì)不僅能夠說明細(xì)胞內(nèi)部的生理代謝變化，也表現(xiàn)出細(xì)胞接受環(huán)境污染物和藥物等外界因素的影響[1，2]。相關(guān)研究涉及各個(gè)領(lǐng)域，分析技術(shù)也不斷升級(jí)并逐漸完善。目前研究方法主要分為兩類：(1)基于磁共振的起源技術(shù)：其具有不破壞樣本的基礎(chǔ)上快速準(zhǔn)確分析的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是不夠靈敏。(2)色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：包含氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用和質(zhì)相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)[3]。GC- MS技術(shù)發(fā)展至今，已建立了全面的代謝庫，因其對(duì)氣體性小分子較敏感，分辨率高，在識(shí)別氣性揮發(fā)性小分子中已作為首選技術(shù)[4]。LC- MS適用于熱不穩(wěn)定、不易揮發(fā)且相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)[5]。代謝產(chǎn)物經(jīng)過檢測、分析與鑒定后，需進(jìn)行后期數(shù)據(jù)分析處理，分析方法包括主成分分析(PCA)、非線性映射(NLM)、聚類分析(HCA)等非監(jiān)督法(unsupervised method)，并聯(lián)用監(jiān)督方法(supervised method)最小二乘法(PLS-DA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等方法，其中應(yīng)用最多的是 PCA聯(lián)合 PLS-DA進(jìn)行代謝物質(zhì)的鑒定分析[6]。

二、代謝組學(xué)在創(chuàng)傷修復(fù)與應(yīng)激中的研究

Sara等[7]進(jìn)行熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)研究，代謝組數(shù)據(jù)顯示肝臟糖原分解和糖異生升高，脂肪酸合成上調(diào)，肝臟代謝過程中的糖原切割葡萄糖-1-磷酸(G1P)中間體升高，包括葡萄糖-6-磷酸(G6P)和葡萄糖；脂肪酸除了肉豆蔻酸和棕櫚油酸酯升高外，大部分脂肪酸水平均下調(diào)或未改變；作為肝臟主要能源的氨基酸，除了半胱氨酸外，在熱應(yīng)激狀態(tài)下表現(xiàn)下調(diào)。Kalkhof等[8]收集傷口液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，最終鑒定出超過600種蛋白，其中60個(gè)與傷口愈合過程相關(guān)、18種蛋白質(zhì)參與體內(nèi)平衡和血液凝固(傷口愈合階段Ⅰ)、35種蛋白質(zhì)與炎癥或防御反應(yīng)相關(guān)(傷口愈合階段Ⅱ)、19種與蛋白水解和重塑(傷口愈合階段Ⅲ和Ⅳ)相關(guān)，此外，還包括4種調(diào)控細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。研究結(jié)果顯示，金屬蛋白酶MMP-8和MMP-9、氧化應(yīng)激標(biāo)志物髓過氧化物酶(MPO)等可用作潛在傷口愈合的標(biāo)志物。

另有研究表明，小鼠肌腱損傷1周后，代謝產(chǎn)物和中間體的13C富集，糖酵解和乳酸合成通量以及三羧酸循環(huán)活性均顯著增加，受傷4周后糖酵解和乳酸生成增加；使用丙氨酸脫氫酶激酶抑制劑(DCA)處理1周及4周后乳酸生產(chǎn)均減少，傷口黏液、損傷肌腱的黏膜堆積和異位鈣化減少，表明乳酸對(duì)于肌腱修復(fù)的重要性，可作為傷口修復(fù)的新靶點(diǎn)[9]。Jonscher等[10]進(jìn)行搭載飛船(space transportation system -135)小鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肝臟脂滴中視黃醇含量明顯減少，代謝組及基因組分析mRNA和代謝物變化，發(fā)現(xiàn)視黃醇丟失與過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)介導(dǎo)的通路激活以及肝星狀細(xì)胞激活有關(guān)；結(jié)果還顯示脂肪酸如ω-3脂肪酸、二十二碳六烯酸顯著增加，膽汁酸如戊二酸上調(diào)、甘氨膽酸顯著下調(diào)；代謝組學(xué)研究表明，長時(shí)間空間環(huán)境暴露對(duì)肝臟造成進(jìn)行性應(yīng)激性損害。Zheng等[11]將30只大鼠隨機(jī)分為創(chuàng)傷腦損傷(TBI)組和假手術(shù)實(shí)驗(yàn)組，收集實(shí)驗(yàn)最初24h內(nèi)大鼠血液樣品進(jìn)行GC/ MS測量以評(píng)估急性TBI誘導(dǎo)的代謝變化，鑒定出血漿中45種代謝物，急性腦損傷組的脯氨酸、磷酸、β-羥基丁酸、半乳糖、肌酸酐、L-纈氨酸、亞油酸和花生四烯酸等發(fā)生顯著變化，通過單變量和多變量統(tǒng)計(jì)分析表明，上述8種血漿中的代謝物可作為 TBI診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，輻射暴露損傷小鼠的大部分代謝物在輻射暴露后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有不同程度減少，包含三羧酸循環(huán)(TCA)中間代謝物(富馬酸、琥珀酸和氧戊二酸)、支鏈氨基酸(L-亮氨酸，L-異亮氨酸)、瓜氨酸和馬尿酸等，而一小部分代謝物包括草酸、磷酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸和飽和游離脂肪酸(肉豆蔻酸和棕櫚酸)在輻射處理組中顯著升高；這些代謝物在輻射暴露后尿液中的相應(yīng)變化顯示出劑量與時(shí)間的相關(guān)性；比較輻射組與對(duì)照組，尤其是在高劑量組，除了少量存在于尿液樣本中的代謝產(chǎn)物之外，代謝產(chǎn)物水平整體下調(diào)，進(jìn)一步分析表明，泌尿代謝物排泄水平可以用來評(píng)估核暴露的輻射劑量，并能揭示與輻射損傷有關(guān)的代謝紊亂[12]。Cheng等[13]通過過氧化氫(H2O2)處理肝癌細(xì)胞以模擬氧化應(yīng)激，隨后進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中1,6-二磷酸果糖(G6PD)以及1,7-二磷酸七庚酮(S-1,7-BP)的水平顯著升高，G6PD活性缺乏降低二磷酸七庚酮的形成，推論二磷酸七庚酮是磷酸戊糖途徑氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中生成，結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后顯著增加了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)的表達(dá)并降低了ATP和NAD+的水平。Fuhrmanna等[14]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧16h和72h后谷氨酸、α-酮戊二酸和異檸檬酸的水平降低；慢性缺氧導(dǎo)致檸檬酸鹽顯著增加，而馬酸鹽卻減少，表明在慢性缺氧條件下復(fù)合物Ⅱ活性降低，電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(ETF)升高，并且ETF-泛醌氧化還原酶的變化影響了線粒體呼吸功能。上述一系列研究表明，應(yīng)激可以對(duì)生物體在細(xì)胞和分子水平的代謝產(chǎn)生影響，最終表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物的變化，通過研究細(xì)胞及代謝組學(xué)變化，可以直觀了解闡述應(yīng)激對(duì)于生命活動(dòng)的影響及作用機(jī)制。

三、代謝組在疾病研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮了越來越重要的作用，已廣泛用于各種生物體不同功能狀態(tài)和疾病的研究[15]。Li等[16]采用超高效液相色譜-四重飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF/MS)技術(shù)相結(jié)合，收集150例嚴(yán)重阻塞性冠心病(CHD)患者和150例血管造影正常對(duì)照的血樣研究組學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)105例CHD患者的代謝物發(fā)生顯著改變，代謝組學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)棕櫚酸、亞油酸、4-吡哆酸、磷脂酰甘油、肉毒堿和石膽酸這6種代謝物與CHD具有強(qiáng)相關(guān)性。另一項(xiàng)基于GC/ TOFMS對(duì)30例2型糖尿病患者和30例健康對(duì)照者的非靶向血清代謝前瞻性研究分析，應(yīng)用多變量數(shù)據(jù)分析識(shí)別代謝物，結(jié)果有54種代謝物被鑒定出來，其參與氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和核苷酸的代謝途徑，其中龍膽酸、檸檬酸、琥珀酸、2-羥基丁酸和3-羥基-1-脯氨酸在內(nèi)的的代謝物與2型糖尿病之間高度相關(guān)，認(rèn)為可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[17]。

Zhao等[18]采用超高效液相色譜-四重飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC- Q- TOF/ MS)技術(shù)分析75例原發(fā)性高血壓以及健康對(duì)照者的尿液代謝產(chǎn)物，根據(jù) PLS-DA模式識(shí)別分析，篩選出其間存在顯著差異的物質(zhì)，涉及的代謝途徑為氨基酸代謝、脂肪酸代謝類固醇激素、生物合成和氧化應(yīng)激等，其中包括L-蛋氨酸在內(nèi)的10種代謝物可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。另有研究者應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)研究分析乳腺癌和健康對(duì)照組的血漿樣品，發(fā)現(xiàn)血漿中不同濃度的代謝物達(dá)1269種，分析認(rèn)為乳腺癌患者的這些異常代謝物主要通過合成必需生物分子提供所需能量和構(gòu)建細(xì)胞生長所需構(gòu)架起作用，并發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用[19]。Fukumoto等[20]應(yīng)用氣相色譜/三重四極桿質(zhì)譜法對(duì)鱗狀細(xì)胞癌和黑色素瘤進(jìn)行血清代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)118種差異代謝物，在鱗狀細(xì)胞癌組中具有顯著差異的代謝物是甘油、4-羥基苯甲酸、癸二酸、巖藻糖和辛二酸，在黑素瘤組中，這些代謝物是谷氨酸、癸二酸、辛二酸、4-羥基苯甲酸和苯丙氨酸，主成分分析顯示可以將這兩種皮膚惡性腫瘤群體與健康志愿者群體區(qū)分開來。Chen等[21]采用1H核磁共振光譜與拉曼光譜相結(jié)合分析高分化與低分化鼻咽癌細(xì)胞之間的代謝情況，篩選出18種特征代謝物，包括丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸牛磺酸和蘇氨酸在內(nèi)的8種氨基酸在高分化和低分化鼻咽癌細(xì)胞間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wang等[22]通過UHLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)分析肺腺癌細(xì)胞的代謝改變，發(fā)現(xiàn)尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、二磷酸腺苷(ADP)、蘋果酸、丙二酰輔酶A、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、輔酶A等在內(nèi)的22種代謝物表達(dá)異常，涉及核苷酸代謝、尿素循環(huán)、三羧酸循環(huán)和甘油磷脂代謝等途徑異常。大量研究表明，代謝組學(xué)技術(shù)在多種疾病研究中的廣泛應(yīng)用正在大范圍揭示一系列疾病的病理生理機(jī)制。

四、代謝組學(xué)在藥物研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在評(píng)價(jià)藥物毒性、揭示其作用機(jī)制和藥物相關(guān)功能中具有獨(dú)特作用，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于各種藥物研究[2,4]。Wu等[23]采用使用模式識(shí)別分析，研究當(dāng)歸四逆湯的相關(guān)作用，發(fā)現(xiàn)模型和對(duì)照組之間可以明確分離；當(dāng)歸四逆湯在干預(yù)血瘀過程中調(diào)節(jié)了9種代謝產(chǎn)物，認(rèn)為滋補(bǔ)血液對(duì)溫暖經(jīng)絡(luò)的作用有關(guān)，同時(shí)表明，當(dāng)歸四逆湯對(duì)血瘀綜合征的干預(yù)作用可能涉及調(diào)節(jié)花生四烯酸、甘油磷脂、膽汁酸生物合成和丙酮酸代謝等途徑。Ryu等[24]應(yīng)用順鉑處理小鼠，然后對(duì)其血液及尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)丙氨酸、葡萄糖、甘氨酸、胍基乙酸鹽、乙酸鹽和乳酸的尿濃度顯著升高，而尿液代謝物中檸檬酸鹽和馬尿酸鹽的濃度在順鉑處理后上顯著降低，通過血清和尿1H NMR OPLS-DA與血清生化及腎臟組織病理學(xué)改變的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)尿液1H NMR分析可用于預(yù)測/篩選順鉑腎毒性的可靠指標(biāo)。

另有研究者通過對(duì)肝癌細(xì)胞使用新型潛在抗癌藥物Natrin培養(yǎng)后進(jìn)行代謝組學(xué)研究，主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)揭示了肝癌細(xì)胞代謝受到Natrin作用影響，13種代謝物被鑒定為與Natrin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡高度相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，部分代謝物對(duì)應(yīng)了鞘脂代謝、脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝和糖鞘脂代謝等5種代謝途徑，證明了Natrin的抗癌活性[25]。Yang等[26]用高脂飲食誘導(dǎo)血脂異常大鼠模型，中藥黃精提取物(polygonatum kingianum，P.kingianum )灌胃14周，隨后使用超高效液相色譜/質(zhì)譜法對(duì)血清、尿液和肝臟樣品中的代謝物進(jìn)行分析，分別鑒定出19、24和38種潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，涉及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成以及色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、淀粉、甘油磷脂、花生四烯酸、亞油酸、煙酸、煙酰胺和鞘脂的代謝；研究發(fā)現(xiàn)黃精提取物通過調(diào)節(jié)血清、尿液和肝臟樣品中的內(nèi)源性代謝物來減輕高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血脂異常，認(rèn)為其有望成為治療血脂異常和相關(guān)疾病的脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑?？v觀國內(nèi)外有關(guān)藥物毒性實(shí)驗(yàn)和新藥研發(fā)熱點(diǎn)問題，代謝組學(xué)技術(shù)以其高敏感度、準(zhǔn)確性和直觀反映細(xì)胞生命活動(dòng)的特性而提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。

五、代謝組學(xué)在失重醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

基于代謝組學(xué)分析技術(shù)的高通量、高分辨率、高敏感度等特點(diǎn)，也拓展應(yīng)用于航天航空失重醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。Xu等[27]在模擬微重力環(huán)境中飼養(yǎng)大鼠14天誘導(dǎo)抑郁模型，隨后采用主成分分析和正交偏最小二乘判別法尋找大鼠尿液內(nèi)源性差異代謝產(chǎn)物，多變量統(tǒng)計(jì)分析顯示微重力處理的大鼠和對(duì)照大鼠的尿代謝譜之間存在明顯分離，其中檸檬酸、草酸琥珀酸、肌酸、脯氨酸、苯乙酰甘氨酸、5-羥基吲哚乙醛、琥珀膽堿、脫氧尿苷、3-羥基馬尿酸、谷氨酰胺和5-羥色氨酸等表達(dá)明顯下調(diào)，而吲哚-模型組中3-乙醛、黃尿酸、?；撬帷⑷蜞?、馬尿酸、5-羥基吲哚乙酸、2-苯基乙醇葡糖苷酸、2-異丙基-3-氧代琥珀酸和腎上腺素水平顯著升高，這些生化改變涉及色氨酸、精氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸代謝以及能量代謝，這為鑒別空間和重力引發(fā)的抑郁具有重要臨床意義。Michaletti等[28]應(yīng)用UHPLC-HRMS技術(shù)分析失重環(huán)境培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境下糖酵解加速，主要與戊糖磷酸途徑相關(guān)；蘋果酸脫氫酶減少誘導(dǎo)蘋果酸-天冬氨酸穿梭逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致ATP合成失調(diào)；脂肪酸β-氧化被抑制，促進(jìn)甘油三酯生成和甘油梭減少；微重力促發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化型谷胱甘肽和抗氧化酶顯著降低；結(jié)論認(rèn)為失重環(huán)境抑制成骨細(xì)胞功能，損害線粒體能量潛能和細(xì)胞能量狀態(tài)。上述研究結(jié)果表明，代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)促進(jìn)航天航空失重醫(yī)學(xué)發(fā)展具有重要意義，這方面的應(yīng)用尚有限，有待深入研究。

六、展 望

綜上所述，代謝組學(xué)研究經(jīng)歷了快速的技術(shù)進(jìn)步，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，為詮釋生命現(xiàn)象、探尋疾病機(jī)制、研發(fā)藥物、發(fā)現(xiàn)生物學(xué)標(biāo)志物等，提供了強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，展現(xiàn)了嶄新的理論視角。代謝組學(xué)研究方興未艾，因數(shù)據(jù)采集時(shí)間和數(shù)據(jù)大小等因素，尚難以在高通量條件下執(zhí)行單細(xì)胞代謝組學(xué)，技術(shù)穩(wěn)定性和代謝物覆蓋度等亦需進(jìn)一步完善。隨著代謝組學(xué)相關(guān)研究的不斷深入以及環(huán)節(jié)升級(jí)與完善，有望成為指導(dǎo)人類疾病診斷和治療的有效手段。