李滿金 蘭策介 李春曉

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家 重點實驗室，北京市蟲媒病與自然疫源性疾病重點實驗室，北京100071)

蚊蟲傳播瘧疾、登革熱、黃熱病、寨卡等多種蟲媒傳染病，給全球公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了巨大威脅(Weaveretal., 2004; Weaver, 2005; Weaveretal., 2010)。21世紀(jì)以來，基因編輯技術(shù)開始應(yīng)用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域，包括蚊媒研究領(lǐng)域。最初，基因修飾主要通過基于真核轉(zhuǎn)錄因子的鋅指核酸內(nèi)切酶(Zinc finger nuclease, ZFN)(Porteusetal., 2005; Urnovetal., 2005)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)(Moscouetal., 2009; Christianetal., 2010)兩種技術(shù)，然而這兩種技術(shù)由于效率較低且設(shè)計復(fù)雜等局限性并沒有得到大范圍的應(yīng)用。近年來開發(fā)的第3代人工核酸內(nèi)切酶基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠靶向特異性的修改目的基因，包括基因插入、敲除和修飾(Horvathetal., 2010)。并且由于其編輯效率高、特異性強、操作簡單且成本低，被認(rèn)為是最具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點編輯工具。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的提出與發(fā)展歷程

1987年，日本Nakata團隊在參與堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化過程的K12大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)一系列串聯(lián)間隔重復(fù)序列(Ishinoetal., 1987)。此后大量微生物基因組被測序，間隔重復(fù)序列被廣泛發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌和古細(xì)菌中，到2000年Mojica團隊證實超過40%的細(xì)菌和古細(xì)菌中存在該序列(Mojicaetal., 2000)。2002年，正式提出CRISPR這一概念(Jansenetal., 2002)，證實了保守的毗鄰CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)，并歸納了3種不同的CRISPR系統(tǒng)(類型Ⅰ-Ⅲ)(Haftetal., 2005)。專家推測CRISPR基因座中的間隔序列(Spacer)可能參與微生物的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)病毒防御機制(Bolotinetal., 2005；Mojica, 2005；Pourceletal., 2005)。2007年，Barrangou等(2007)首次實驗證明Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的作用。到2013年，張鋒團隊和Church實驗室(Congetal., 2013; Malietal., 2013b)前后實現(xiàn)了嗜熱鏈球菌和化膿性鏈球菌中的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中的基因編輯。這兩篇文獻(xiàn)發(fā)表后將CRISPR/Cas9系統(tǒng)在真核生物中的應(yīng)用推進(jìn)新的階段，并在當(dāng)年被《Science》雜志評為頂級十項科學(xué)突破之一，之后CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛用于各種實驗?zāi)Ｐ?，至此將基因編輯技術(shù)的研究與應(yīng)用推向了新的領(lǐng)域。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與作用機理

以目前應(yīng)用最廣泛的發(fā)現(xiàn)于化膿型鏈球菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)為例，CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括3個部分：特異性的CRISPR相關(guān)RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA)、反式激活的crRNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)、CRISPR相關(guān)的核酸內(nèi)切酶9(CRISPR associated sequences 9, Cas9)(Hsuetal., 2014)。此外，之后的研究人員將包含靶向指導(dǎo)序列的crRNA融合到tracrRNA中，構(gòu)建出的單鏈導(dǎo)向RNA(Single guide RNA, sgRNA)，可以代替crRNA-tracrRNA復(fù)合體，指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶定向切割雙鏈DNA(Jineketal., 2012)?？傮w來說，CRISPR-Cas反應(yīng)包括3個階段(Bondy-Denomyetal., 2015; Mohanrajuetal., 2016; van Houteetal., 2016; Shmakovetal., 2017)。第1階段稱為適應(yīng)階段，Cas1-Cas2蛋白復(fù)合物切除目標(biāo)DNA序中的原型間隔子(Protospacer)，并將其插入 5′ 末端的CRISPR重復(fù)序列之間產(chǎn)生一個新的間隔子。第2階段為表達(dá)和加工階段，CRISPR序列與新的間隔子一起轉(zhuǎn)錄為前體crRNA(Pre-crRNA)，并由特殊的Cas9加工成成熟的crRNA。第3階段為干擾階段，crRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合體識別原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)前的靶點序列，激活Cas9中的HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生切割功能，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double-DNA strand breaks, DSBs)，再借助機體的非同源末端連接(Nonhomologous end joining, NHEJ)或同源修復(fù)(Homologous-directed repair, HDR)等自我修復(fù)方式，從而實現(xiàn)基因組的定點插入、敲除或修飾(Jackson, 2002)。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在蚊媒研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)后，由于其簡單方便的操作方法和低廉的成本而得以迅速推廣使用。尤其是，2013年在真核生物細(xì)胞中成功應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，使得這一強大的基因編輯技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域的各種生物中。目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、特別是臨床醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如尋找潛在藥物靶點、治療由已知遺傳因素導(dǎo)致的疾病等。迄今為止，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于果蠅(Renetal., 2014; Seboetal., 2014; Gratzetal., 2015; Portetal., 2016)、家蠶(Wangetal., 2013; Maetal., 2014; Maetal., 2017)、蝴蝶(Lietal., 2015; Markertetal., 2016; Zhangetal., 2016)等昆蟲。具有高度特異性和靈活性的CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被應(yīng)用于媒介蚊蟲，給蚊媒防治策略的開展提供更多的可能。Kistler等(2015)首先利用埃及伊蚊Aedesaegypti證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有在蚊蟲中產(chǎn)生位點特異性突變的能力，并建立了幾個基因組位點穩(wěn)定突變的種系。他們研究了注射不同比例Cas9蛋白和sgRNA混合物后對基因的編輯效率，提出注射400 ng/μL的重組Cas9蛋白可以產(chǎn)生最高的突變率；同時他們還研究了不同注射比例對胚胎存活率的影響，發(fā)現(xiàn)注射333 ng/μL的重組Cas9蛋白蚊蟲胚胎存活率為46.1%～63.3%，而注射500 ng/μL的胚胎存活率只有18.6%；隨后，通過注射sgRNA和長度為200 bp的單鏈寡脫氧核苷酸(Single-stranded DNA oligodeoxynucleotide, ssODN)并檢測G0、G1代產(chǎn)生的插入缺失和ssODN插入的比例，表明了非同源末端連接修復(fù)發(fā)生的可能性高于同源修復(fù)，證明了CRISPR/Cas9通過不同的修復(fù)機制產(chǎn)生不同類型的突變的能力。這項研究對CRISPR/Cas9在蚊蟲中的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的探索，使以前無法進(jìn)行基因編輯的非模式生物的相關(guān)研究有了新的可能。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在蚊蟲表型修飾及篩選中的應(yīng)用

Dong等(2015)針對共同表達(dá)眼部特異性紅色熒光蛋白(Red fluorescence protein, RFP, DsRed)和增強型藍(lán)綠色熒光蛋白(Enhanced cyan fluorescent protein, ECFP)的埃及伊蚊中的ECFP進(jìn)行CRISPR基因敲除，通過注射Cas9和兩個靶向ECFP基因不同區(qū)域的sgRNA復(fù)合物，最終得到G1的編輯效率為5.5%，得到2～27個堿基的插入缺失。該研究的編輯效率不同于之前研究報道中的超高效率，說明在埃及伊蚊中，CRISPR/Cas9的編輯效率存在較大的差異，可以進(jìn)一步改善靶點位置的選擇，優(yōu)化sgRNA的設(shè)計。這項研究使得我們能夠利用簡單的視覺篩選系統(tǒng)篩選突變體，快速視覺篩查系統(tǒng)的使用非常重要，因為無法預(yù)知我們的CRISPR / Cas9構(gòu)建體是否起作用。Liu等(2018)首次在白紋伊蚊Aedesalbopictus中使用CRISPR/Cas9技術(shù)，靶向敲除了酪氨酸羥化酶(Kynurenine hydroxylase, Kh)和多巴胺色素轉(zhuǎn)化酶(Dopachrome conversion enzyme, Yellow)兩個基因，在G1的蛹和成蟲中可以觀察到眼睛和身體色素沉著缺陷，表明成功地產(chǎn)生了高度可遺傳突變，從而證明了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可以在白紋伊蚊中應(yīng)用，作為基因組學(xué)分析和生物學(xué)研究的有效工具。同年，在白化按蚊Anophelesalbimanus、科魯齊按蚊An.coluzzii和福涅斯特按蚊An.funestus中成功應(yīng)用了CRISPR/Cas9技術(shù)(Lietal., 2018)。他們通過靶標(biāo)眼部特異性基因White protein(三種按蚊基因轉(zhuǎn)錄本ID：AALB006905-RA、ACOM037804-RA、AFUN003538-RA，來自Vectorbase數(shù)據(jù)庫)產(chǎn)生馬賽克效應(yīng)，證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在先前基因編輯技術(shù)效率低或無法編輯的物種中也擁有較高的效率。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在控制病原感染蚊蟲研究中的應(yīng)用

在斯氏按蚊An.stephensi中首次利用高效Cas9介導(dǎo)的基因驅(qū)動技術(shù)進(jìn)行種群修飾，通過該系統(tǒng)基因修飾的雄性和雌性后代表現(xiàn)出高頻率的同源修復(fù)(Gantzetal., 2015)。隨后，實驗人員將一個約17 kb的構(gòu)建體從其插入位點復(fù)制到其同源染色體上，在該基因修飾品系與野生型蚊蟲雜交后，99.5%的后代帶有雙重抗瘧原蟲效應(yīng)基因和標(biāo)記基因。Dong等(2018)利用CRISPR/Cas9技術(shù)破壞了岡比亞按蚊中的纖維蛋白原相關(guān)蛋白1(Fibrinogen-related protein 1, FREP1)基因序列，該蛋白是一種激動劑，參與瘧原蟲對媒介蚊蟲的生物學(xué)反應(yīng)，影響蚊蟲對瘧原蟲的易感性和蚊蟲自身的適應(yīng)性。產(chǎn)生基因突變后的蚊蟲不但對瘧原蟲感染產(chǎn)生明顯抑制作用，而且對蚊蟲的吸血行為、繁殖能力、卵的孵化率、化蛹時間和壽命長短等方面均有影響。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在蚊蟲發(fā)育繁殖代謝研究中的應(yīng)用

Hammond等(2016)將CRISPR輔助的基因驅(qū)動系統(tǒng)應(yīng)用于瘧疾媒介蚊蟲岡比亞按蚊，針對3個基因(基因轉(zhuǎn)錄本ID：AGAP005958-RA、AGAP011377-RA、AGAP007280-RA，來自Vectorbase數(shù)據(jù)庫)開展研究，這些基因參與蚊蟲產(chǎn)卵和胚胎發(fā)育的不同階段，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向破壞了這些基因后雌蚊會產(chǎn)生不育表型，并將每個基因的基因座插入CRISPR/Cas9基因驅(qū)動構(gòu)建體，可在91.4%～99.6%的子代中觀察到相應(yīng)表型，并在4代內(nèi)快速入侵該種群，造成種群數(shù)量大幅度減少。通過在埃及伊蚊中設(shè)計microRNA-309(miR-309)的特異性sgRNA，開發(fā)了針對microRNA(miRNA)的基因組突變技術(shù)。實驗中注射的胚胎大約有51.5%的存活率，證明使用CRISPR/Cas9技術(shù)可以有效地破壞miR-309基因位點，并且在存活的胚胎中編輯效率達(dá)到了64.1%。CRISPR/Cas9產(chǎn)生的miR-309突變體的卵巢未能發(fā)育出正常的初級卵泡，表明miR-309在雌蚊卵巢卵泡發(fā)育中起關(guān)鍵作用(Zhangetal., 2016)。Lin等(2017)通過CRISPR/Cas9技術(shù)對miR-277位點產(chǎn)生突變，并通過CRISPR輔助的單鏈寡聚脫氧核苷酸介導(dǎo)的同源修復(fù)，明確了miR-277缺失與叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O，F(xiàn)OXO)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間存在關(guān)聯(lián)，證明了miR-277在FOXO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起到關(guān)鍵作用，從而影響了雌蚊繁殖功能和脂質(zhì)代謝。這些研究都為種群數(shù)量的控制提供了新的思路。

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在蚊蟲種群控制中的應(yīng)用

性別是蚊蟲防控中的重要考慮因素，蚊蟲傳播疾病是通過叮咬受感染的個體獲得病毒，病毒在體內(nèi)復(fù)制一段時間再叮咬傳播另一宿主，而只有雌蚊在交配后才會產(chǎn)生吸血行為進(jìn)而使卵巢和卵發(fā)育繁殖后代，如何使雌蚊數(shù)量減少，或影響雌蚊發(fā)育，是控制蚊蟲種群數(shù)量的重要切入點。針對埃及伊蚊的雄性決定因子Nix基因進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯，該基因主要影響蚊蟲向雄性轉(zhuǎn)化(Basuetal., 2015)。進(jìn)一步對Nix基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)Nix編碼一個潛在的剪接因子，其缺失可產(chǎn)生雙性和無性別分化兩種選擇性剪接，從而導(dǎo)致雄蚊很大程度上雌性化(Halletal., 2015)。該研究將雌蚊轉(zhuǎn)變成無害的雄蚊，從而為控制蚊蟲的數(shù)量提供了新的思路和策略。Hammond等(2017)在岡比亞按蚊中首次發(fā)現(xiàn)了第1個功能性CRISPR/Cas9性別紊亂系統(tǒng)。在被測試的4個岡比亞按蚊基因修飾品系中，所有品系均表現(xiàn)出強烈的性別比差異，雄性后代的比例可到達(dá)86.1%～94.8%，孵化率在83.6%～93.2%之間。針對調(diào)控岡比亞按蚊性別分化的另一基因雙性基因(Anopheles gambiae doublesex，Agdsx)開展研究(Kyrouetal., 2018)，Agdsx的兩個轉(zhuǎn)錄體dsx-雌性(AgdsxF)和dsx-雄性(AgdsxM)分別控制兩個方向的性別分化。不同于AgdsxM，AgdsxF中包含雌性特異性的5號外顯子，以CRISPR/Cas9靶向破壞4號內(nèi)含子和5號外顯子的交接序列從而阻止功能性AgdsxF的形成，但不會影響雄性的發(fā)育或生育能力，使后代出現(xiàn)等位基因純合突變的雌蚊表現(xiàn)出雙性或不育表型。隨后，在實驗室種群中構(gòu)建AgdsxF基因驅(qū)動系統(tǒng)，結(jié)果表明在7～11代內(nèi)雌蚊表現(xiàn)出雙性或不育表型，覆蓋率可達(dá)100%，并且伴隨著蚊卵的減少，種群數(shù)量快速減少最終導(dǎo)致整個種群崩潰。

Li等(2017)建立多個穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的埃及伊蚊株系，使利用CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的一致性和效率得到顯著改善，開發(fā)了基于Cas9基因驅(qū)動(Gene drive, GD)的埃及伊蚊新型種群控制技術(shù)。在岡比亞按蚊(Hammondetal., 2016)和斯氏按蚊(Gantzetal., 2015)中也實現(xiàn)了基因驅(qū)動技術(shù)。這些結(jié)果為進(jìn)一步發(fā)展Cas9介導(dǎo)的基因驅(qū)動技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，既可以用于構(gòu)建攜帶抗病原效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)基因蚊蟲，也可以用于生成能夠滲入整個野生種群基因的基因驅(qū)動系統(tǒng)，例如雄性決定因子Nix基因。這些研究為今后瘧疾等蚊媒疾病的防治、蚊蟲種群數(shù)量控制提供了一種新的方法。

2.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在蚊蟲中的其他應(yīng)用

Basu等(2015)除了對上文描述的Nix性別決定基因進(jìn)行編輯之外還對埃及伊蚊的5個有關(guān)DNA修復(fù)，RNAi的基因(kmo、lig4、ku70、loqs、r2d2)進(jìn)行了CRISPR/Cas9基因編輯，發(fā)現(xiàn)在G1胚胎中的基因編輯率高達(dá)90%。在研究中，他們還發(fā)現(xiàn)在基因組不同位置編輯效率不同，從而進(jìn)一步設(shè)計了40條不同靶點的sgRNA來評估不同位點的編輯效率，為利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行蚊蟲基因編輯、提高編輯效率提供了一條新的思路。Itokawa等(2016)首次報道了在致倦庫蚊Culexquinquefasciatus抗性品系中使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除了細(xì)胞色素P450基因(CYP9M10)，研究證明突變幼蟲擬除蟲菊酯抗性下降了100倍以上。盡管這些物種可能不適合進(jìn)行胚胎顯微注射，但通過實驗比較各種編輯技術(shù)的效率，CRISPR/Cas9盡管有某些缺點和限制，但其仍然有較高的編輯效率，新型的編輯技術(shù)將大大推進(jìn)非模式昆蟲的相關(guān)問題研究，并有助于拓展我們在該領(lǐng)域的知識。

3 討論與展望

CRISPR/Cas9基因編輯工具已在媒介蚊蟲基因組修飾的研究工作中發(fā)揮著巨大作用，這種工具可用于更深層次的研究靶標(biāo)基因的插入/缺失、倒位、重復(fù)、多態(tài)性等多種問題，并有助于研究蚊蟲和病原體的相互作用，以其高效率的靶標(biāo)特異性和簡單低成本的優(yōu)勢迅速替代了ZFN和TALEN等原先的基因編輯工具，在修飾媒介蚊蟲的基因組研究中占據(jù)主要位置。但由其所產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)、基因驅(qū)動種系所帶來的生態(tài)問題等也不容忽視。

目前已在多個研究中報道了有關(guān)脫靶效應(yīng)的問題(Fuetal., 2013; Malietal., 2013a；Pattanayaketal., 2013)，而且由于蚊蟲基因組相對較大，所以存在的潛在脫靶序列數(shù)量增加，可能需要更精確的靶點選擇。針對脫靶問題，不少學(xué)者也提出了解決辦法，比如對Cas9蛋白進(jìn)行突變構(gòu)建一個切口酶，再設(shè)計2個sgRNA對位點上下游同時進(jìn)行切割，通過兩次識別提高準(zhǔn)確性降低脫靶效應(yīng)(Ranetal., 2013)。一種新型高保真Cas9蛋白(SpCas9-HF1)，比原先的Cas9蛋白具有更低的脫靶率(Kleinstiveretal., 2016)。還有很多研究者開發(fā)一系列軟件和相關(guān)網(wǎng)站來預(yù)測可能的脫靶位點，如Digenomeseq軟件(Kimetal., 2015)、ZiFit、CRISPR Design等網(wǎng)站，但由于許多蚊蟲種類缺乏完整的基因組，因此無法將這些工具應(yīng)用于所有蚊種。

此外，有關(guān)于借助同源修復(fù)而產(chǎn)生的基因驅(qū)動策略中也存在嚴(yán)重問題(Esveltetal., 2014; Uncklessetal., 2017)。為了獲得有效的基因驅(qū)動，我們必須確保是通過HDR而不是NHEJ來修復(fù)序列，這在某些種類的蚊蟲中可能具有挑戰(zhàn)性，從而會導(dǎo)致超出預(yù)期水平的不良后果。釋放到環(huán)境中的基因修飾的品系可能會對生態(tài)系統(tǒng)造成不良影響，例如修飾后的蚊蟲在自然環(huán)境中的存活率，對食用轉(zhuǎn)基因蚊蟲幼蟲的捕食性昆蟲和魚類的影響以及消滅媒介蚊蟲后引起的生態(tài)失衡等問題(Reeganetal., 2017)。而且由于其“無痕”的修飾方式，到目前為止我們還沒有方法可以在現(xiàn)場條件下檢測編輯導(dǎo)致突變的蚊蟲，并且無法將其與發(fā)生自然突變的蚊蟲進(jìn)行鑒別(Ledford, 2015)。

世界各地的研究者們都有機會充分利用CRISPR/Cas9這一基因編輯技術(shù)來拓展自身的研究領(lǐng)域，特別是在媒介蚊蟲的控制方面。CRISPR系統(tǒng)的創(chuàng)造性是無限的，自從這一系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)以來，人們不斷的深入挖掘其更多的可能，不斷拓展其功能和應(yīng)用范圍，基因編輯技術(shù)變得更加高效和便捷。隨著CRISPR系統(tǒng)在蚊蟲中的應(yīng)用的成熟，我們?nèi)孕璨粩嗯μ岣咴摷夹g(shù)的特異性和效率，開發(fā)更多的方法使其更多的適用于各種蚊蟲種系甚至其他非模式生物, 從而達(dá)到控制蚊蟲種群、阻斷蚊媒體內(nèi)病毒的復(fù)制與傳播、防治甚至消除蚊媒疾病的目的。