湯思敏，朱 健，林曉敏，周 韜，周 燈，黃 超，王 平，焦文清，梁穎宜

（1.中南林業(yè)科技大學 環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.稻米品質安全控制湖南省工程實驗室，湖南 長沙 410004）

砷（As）分布廣泛且具有致癌性，被認為是世界上最危險的化學物質之一[1]。水體As 污染主要來源于自然源與人為源，如長期的地球化學變化與礦物礦石釋放；冶金、陶瓷、染料和農業(yè)制藥廠等的工業(yè)廢水排放[2-4]。在天然水中發(fā)現(xiàn)的兩種主要As 形態(tài)為As（V）砷酸鹽與As（III）亞砷酸鹽，它們的存在取決于pH 和氧化還原條件[5]。由于現(xiàn)今As 污染日益嚴重并對人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成不利影響，As 污染已成為世界上最為關注的環(huán)境污染問題之一[6-8]。

由于As 污染的治理比較困難，迄今為止，有許多傳統(tǒng)技術被用于去除水中的砷，包括浮選，凝聚-沉淀，吸附，離子交換，膜過濾和電化學處理氧化還原、化學沉淀、過濾等，但因成本高、選擇性低、能耗高等缺點限制了它們的進一步應用[9-11]。生物吸附被普遍認為是一種行之有效的水體As 污染去除方法[12]。自20 世紀90年代，生物質被用于去除水體重金屬。生物吸附不僅受生物量的類型或化學組成的影響，而且受外界物理化學因素和溶液化學的影響[13]。近年來，微生物作為生物吸附劑的應用比其他種類的生物吸附劑受到了更多的關注。已有研究報道了活菌和死菌與水體環(huán)境As 的去除作用，但無生命的生物質往往是首選的，因為此種生物吸附劑可以在極端pH 值下重復使用，用于連續(xù)處理有毒污染物，此外，由于不需要使用生長介質，死菌生物質具有較好的成本效益和安全性[14]。

縱觀微生物修復水體重金屬污染的研究，國內外關于細桿菌屬Microbacterium去除水體中重金屬的研究主要集中于Cr、Cu 等元素，而關于該菌屬去除水體As3+的研究鮮有報道[15-17]。本研究為了評價細桿菌屬去除水溶液中As3+的可行性，優(yōu)化了該菌的生長條件與As3+吸附條件，并通過吸附動力學與等溫吸附試驗研究了該菌對As3+的吸附行為，通過SEM-EDX 與FTIR 分析分析了該菌對水體As3+的吸附機理，以期為As 污染的微生物修復提供必要的修復材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 耐As 細菌的分離

從湖南婁底冷水江礦區(qū)采集土樣，于4 ℃冰箱保存。稱取10.0 g 土樣放入100 mL 錐形瓶中并加入100 mL 無菌水，120 r/min 震蕩2 h，取出靜置15 min。用移液槍吸取200 μL 上清液，采用稀釋涂布法[11]接種在As3+濃度為100 mg/L 的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。挑選形態(tài)不同的單菌落進行分離劃線，純化后逐步遞增固體平板濃度，篩選出高耐As 菌株。

1.2 耐As 細菌的鑒定

通過16S rRNA 基因測序，引物為27F：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′- TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。由生工生物工程（上海）股份有限公司完成耐As 菌株的分子生物學鑒定。鑒定結果在NCBI中進行BlAST分析，用MEGA7.0 軟件系統(tǒng)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 耐As 菌株A4 的生長條件優(yōu)化

1.3.1 菌株A4 的生長曲線

配置200 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，將培育至對數(shù)生長期的菌株以2%的接種量接入錐形瓶中，每隔2 h 用紫外可見分光光度計（島津 UV2600）測定其OD600值分別培養(yǎng)直至48 h，設置3 個平行樣，并以未加菌處理為對照（下同）。

1.3.2 不同因素對菌株A4 生長的影響

將高耐砷菌株A4 接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h 后離心取濕菌體于80℃烘干至恒質量，再研磨磨細成菌粉待用。

1.4 耐As 細菌的鑒定

配置200 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，將培育至對數(shù)生長期的菌株以1%的接種量接入錐形瓶中，控制pH 值：5.0、6.0、7.0、 8.0、9.0；轉速：90、120、150、180、210 r/min； 溫度：20、25、30、35、40℃；無機鹽：0、0.25、0.50、0.75、1%，每個處理3 個重復，培養(yǎng)24 h，用紫外分光光度計測定其OD600值。

1.5 菌株A4 菌粉對As3+吸附條件的正交優(yōu)化

采用正交設計優(yōu)化菌粉對As3+的最佳吸附條件。選擇菌粉投加量（g/L）、時間（h）、pH 值與溫度（℃）4 個指標各作3 個水平進行正交試驗L9（34），具體設計見表1。

通過正交試驗設計方案（表1）開展菌粉對As3+的吸附試驗。5 000 r/min，1 h 離心后取上清液，并用原子熒光光度計（吉天儀器 AFS-8220）測定濾液中As3+濃度。每個處理3 個重復，并以不加菌處理作為對照。

As3+的吸附量計算公式如下：

式中：q為菌粉對As3+的吸附量，mg/g；m為吸附質質量，g；C0為水中原有As3+濃度，mg/L；Ce為處理后水中剩余As3+濃度，mg/L。

表1 正交試驗設計Table 1 Design of orthogonal test

1.6 最佳條件下菌株A4 對As3+的吸附動力學

按正交試驗得到的吸附最佳菌粉投加量、pH值、溫度于120 r/min 振蕩10、20、30、60、90、120、150、180 min 后離心過濾，收集上清液，待測。

1.7 最佳條件下菌株A4 對As3+的等溫吸附

按正交試驗得到的最佳吸附時間、pH 值、溫度，加入菌粉以配制10 mg/ L、50 mg/ L、100 mg/ L、200 mg/ L、400 mg /L、500 mg/ L 濃度的溶液，于120 r/min 振蕩后離心過濾，收集上清液，待測。

1.8 菌株A4 對As3+的吸附機理

收集吸附溶液As 后的菌粉，于80 ℃烘干24 h，用研磨磨細樣品后，進行SEM-EDX分析與FTIR分析。

1.9 數(shù)據(jù)計算與分析

吸附動力學研究通過準一階動力學與準二階動力學進行擬合；吸附等溫研究通過Langmuir 與Freundlich 模型進行擬合。

式中：K1和K2為吸附速率常數(shù)，Qe與Qt為平衡溶液As3+濃度與時間t時溶液As3+濃度（mg/g）。

式中：Qe與Qm分別為菌粉對As3+吸附量與最大吸附量，mg/kg；Ce為吸附平衡溶液中As3+濃度，mg/L；KL、KF與n均為吸附常數(shù)。

使用Excel 2016 處理試驗數(shù)據(jù)，Origin 9.0 繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 耐砷菌株的鑒定

從土樣中篩出23 種菌株，其固體平板的最小抑菌濃度為40 mmol/L。進一步提高固體平板的As3+濃度至53 mmol/L，最終只有4 株菌株能繼續(xù)生長。選取其中一株菌命名為A4，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行鑒定，將所得序列在NCBI 網站進行序列同源性比較，用MAGE X 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。耐As 菌株與多株Microbacterium的序列相似性達到99%，可確定耐As 菌株為細桿菌屬Microbacterium。通 過16S rRNA 基 因 測 序， 引 物 為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

圖1 耐As 菌株的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.1 Phylogenetic tree of arsenic resistant strain

2.2 菌株A4 生長曲線

菌株A4 的生長曲線見圖2。由圖可知，0 ～ 10 h 為菌株A4 生長的遲緩期，10 ～30 h 為生長對數(shù)期，30 ～44 h 為穩(wěn)定期，44 h 后進入衰亡期。

2.3 菌株A4 生長條件優(yōu)化

圖2 菌株A4 生長曲線Fig.2 Growth curve of bacterial strain A4

溫度、pH 值、NaCl 濃度、轉速對菌株A4 生長的影響見圖3。可以看出，當無機鹽濃度低于0.25%時，菌株A4 生長良好，而當無機鹽高于0.25%時菌株生長量急劇下降，菌株A4 生長最適無機鹽濃度為0.25%。當轉速低于180 r/min 時，菌株A4 生長隨轉速增加呈逐漸升高的趨勢，高于180 r/min 時生長量反而下降，菌株A4 生長最適轉速為180 r/min。菌株A4 在pH 值為7.0 ～9.0的范圍內都能生長，pH 值高于7，菌株生長量明顯提升，說明菌株A4 更適合在中性以及弱堿性的環(huán)境下生長。此外，菌株A4 生長最適溫度為30℃，但在溫度為20 ～40℃時皆能生長。

2.4 菌株A4 對As3+吸附條件的正交優(yōu)化

圖3 不同條件下菌株A4 的OD600 值Fig.3 OD600 value of bacterial strain A4 under different conditions

正交試驗結果表明（表2），各因素不同水平下的變化趨勢范圍為IIA＞IA＞IIIA、IIB＞IB＞IIIB、IIIC＞IIC＞IC和ID＞IID＞IIID，表明在各因素所選定范圍中，菌株A4 所制菌粉吸附溶液中As3+的最佳條件為A2B2C3D1，即菌粉投加量為0.02 g/L、吸附時間為2 h、pH 值為8.0 和溫度為20 ℃，此條件下菌粉對As3+的吸附量為128 mg/g。各因素的極差范圍在25 ～147，其中溫度最大，說明其對菌粉吸附As3+的影響最大。

2.5 菌株A4 對As3+的吸附動力學研究

菌株A4 對As3+的吸附動力學特征如圖4 所示。隨著吸附時間的延長，菌株A4 從10 min 到120 min 對的吸附量顯著增加，120 min 達到吸附平衡。由表3 可知，準一級動力學相關系數(shù)R2（0.989）大于準二級動力學相關系數(shù)R2（0.953），說明菌株A4 對As3+的吸附過程符合一級動力學方程，所以菌株A4 最大吸附量為132.5 mg/g。

2.6 菌株A4 對As3+的等溫吸附研究

圖2 所示為菌株A4 對As3+吸附的L 型（圖5 a）和F 型（圖5 b）吸附等溫線。隨著外源添加As3+濃度的增加，菌株A4 對As3+的吸附量呈逐漸上升的趨勢。由Langmuir 方程擬合可知，菌株A4 對As3+的最大吸附量達114.6 mg/g，吸附常數(shù)KL值為0.016。KL可以表示吸附劑的吸附能力，在0 ～1 之間有利于吸附，KL在0 ～1 之間說明A4 對As3+的吸附容易進行。由Freundlich 方程擬合可知，吸附常數(shù)KF與n分別為5.65 和0.52。一般認為，n的數(shù)值在0 ～0.5 之間易于吸附，n為0.52說明吸附過程易進行。由圖可知，Langmuir 方程所得R2（0.99）優(yōu)于Freundlich 方程所得R2（0.94），所以A4 對As3+的吸附更符合Langmuir 等溫吸附方程，其吸附以單分子層吸附為主。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 The results of the orthogonal test

圖4 菌株A4 對As3+吸附的動力學特征Fig.4 Adsorption kinetics of As3+ onto strain A4 described by pseudo-first order model and pseudo-second order model by curves

表3 菌株A4對As3+吸附的動力學常數(shù)Table 3 Kinetic parameters for the sorption of As3+ by stain A4

2.7 菌株A4 對As3+的吸附機理分析

為明確菌株A4 制成菌粉對溶液As3+的吸附機理，利用SEM-EDX 掃描測定了吸附與不吸附As3+時菌粉的表面形態(tài)。從圖6(a)和6(c)可以發(fā)現(xiàn)，未吸附As3+的菌粉表面光滑，呈桿狀，菌株A4 菌粉吸附As3+后，表明形態(tài)和大小發(fā)生了顯著變化，具體表現(xiàn)為表面褶皺增多，團粒變大，這也體現(xiàn)了菌株A4 菌粉對溶液中As3+的吸附效應。

此外，通過能譜分析得到了菌株A4 菌粉在無As3+（圖6b）和含As3+（圖6d）處理下的離子裝載情況。結果表明，在無As 處理中，菌粉表面存在C、O、K、P、Pt、Mg、Nb 峰，而在含As 處理中的菌粉存在C、O、As 峰，說明As3+替換了菌粉表面原有的K、Pt、Mg、Nb 離子，并可能與P 元素大量螯合。上述結果也與紅外光譜分析結果一致。

圖5 菌株A4 對As3+吸附的等溫吸附特征Fig.5 Adsorption isotherm fitted by Langmuir model (a) and Freundlich model (b) by curves of As3+ onto strain A4

圖6 菌株A4 菌粉吸附As3+前后的掃描電鏡與能譜圖Fig.6 SEM-EDX images of the bacteria powder of the strain A4: (a), (c) without sorption of As3+, (b), (d)sorption of As3+

圖7 為負載As3+和未負載As3+的菌株A4菌粉的紅外光譜分析，用以確定可能導致As3+吸附的官能團。如圖4 所示，對比未吸附As3+處理，菌粉吸附As3+后，表面-OH、-CHO、-COOH、-NH與O-P-O等功能團變化顯著，其中-OH的最大峰峰型變窄，峰值由3 404 cm-1轉移至3 385.39 cm-1，這體現(xiàn)了As3+與-OH 的絡合作用，而-CHO（2 927.21 cm-1） 與-COOH（1 654.93 cm-1）功能團峰強則均有所增加；峰值1 542.04 cm-1和1 452.92 cm-1處為細胞蛋白質酰胺帶，受-CN伸展振動與-NH 彎曲振動影響顯著，菌粉吸附As3+后，峰強分別轉移至1 654.93 cm-1和1 453.11 cm-1；另一個變化是從1 404.75 cm-1到1 400.41 cm-1，此對應了As3+與-NH 基團的螯合效應；在峰值1 238.34 cm-1處，菌粉吸附As3+后峰值轉移至1 237.47 cm-1，這可能與As3+與細胞壁中多糖組分中的C-O-C 的結合有關；此外，另一個弱吸收峰強從533.00 cm-1轉移至533.68 cm-1，對應多糖的O-P-O 的剪接振動。因此，以上的光譜變化可能是As3+與菌株A4 菌粉上的-OH、-COOH、-NH與酰胺等基團相互作用的結果。

3 討 論

近年來，利用微生物方法處理污染水體中的As 已日趨增多，但菌種類型不同，生長特性存有差異，必然會影響其對As 的去除效率。Podder 等[18]發(fā)現(xiàn)耐As 菌株MTCC 4380Bacillus arsenicus的最佳生長pH 為7.0，且對As3+的耐受閾值為1 000 mg/L；Battaglia-Brunet 等[19]經分離得到的耐As菌株DSM 16361 or B6TThiomonas arsenivorans，其生長pH 值范圍在4.0 ～7.5，其耐As 能力為100 mg/L。本研究從As 污染礦區(qū)土壤分離出一株高耐As 菌株A4Microbacterium，其對As3+的耐受閾值為53 mmol/L，并在pH 值范圍5.0 ～7.0時的OD600值顯著上升，且在7.0 ～9.0 時平穩(wěn)增長，體現(xiàn)出A4 菌株對水體環(huán)境pH 值的高度適應能力，有利于實際治理工業(yè)廢水的應用。

圖7 菌株A4 菌粉吸附As3+前后的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of the bacteria powder of the strain A4 before and after sorption of As3+

眾多研究報道了細菌、真菌及微藻類等對As3+的不同吸附能力。Sari 等[20]利用Langmuir 模型擬合得到無生命的綠藻Maugeotia genuflexa的最大As3+吸附量為57.48 mg/g；Wu 等[20]通過對酵母菌對As3+的吸附試驗得到最大As3+吸附量為62.91 μg/g。而Asadi Haris 等[11]從位于北極極寒地區(qū)某池塘沉積物中收集到菌種Yersinia sp.，進行了Langmuir 與Freunlich 吸附等溫線擬合，并得到該菌株對As3+的最大吸附量為159 mg/g。本研究通過正交試驗優(yōu)化得到菌株A4 所制菌粉在最佳吸附條件下對As3+的吸附量可達128 mg/g，并通過吸附動力學證實了菌粉在120 min 左右時間可達吸附飽和狀態(tài)，通過Langmuir 方程擬合得到菌株A4 所制菌粉對As3+的最大吸附量為114.6 mg/g，該值雖低于極耐寒菌對As3+的吸附量，但遠優(yōu)于常規(guī)生長條件下其它菌種對As3+的吸附能力，因此菌株A4 對As 污染水體As3+的去除潛力是值得肯定的。

為探明菌株A4 所制菌粉對水溶液中As3+的吸附機理，本研究進行了含As3+與不含As3+水溶液下所得菌粉的SEM-EDX 分析與FTIR 分析，結果發(fā)現(xiàn)，相比未含As3+溶液所得菌粉，含As3+溶液所得菌粉表面皺褶明顯增多，且團粒結構變大，這體現(xiàn)了As3+在菌粉表面的吸附作用。死菌細胞表面往往呈現(xiàn)負電荷并有較多的吸附位點，促進了其對As3+的吸附能力。此外，由能譜圖可知（圖6c, d）可知，菌粉表面發(fā)生了Mg2+與As3+的離子交換作用，此過程亦促進了菌粉對As3+的吸附。大量研究表明，死細菌的細胞壁與代謝產物會暴露大量活性基團如羧基、羥基、氨基等，這是菌粉吸附As3+的重要機制[21-22]。本研究表明：菌株A4 細胞壁上的的-OH、-COOH、-NH 與酰胺等基團與As3+發(fā)生了絡合作用，實現(xiàn)了菌粉對As3+的吸附效應。

綜上所述，菌株A4 對水體As3+的吸附能力為水體環(huán)境容量提供了正效應，對后續(xù)As 污染水體的微生物治理具有理論與指導意義。未來可繼續(xù)探究在不同改性條件下該菌粉對As3+吸附效果有何變化或該菌粉對不同重金屬的吸附特征與機理，以完善水體重金屬污染微生物治理方法體系。

4 結 論

1）通過單因素試驗對菌株A4 進行生長條件優(yōu)化，得到最適生長條件為溫度30℃、pH值7.0～9.0，轉速180 r/min，NaCl 濃度0.25m/v。

2）分離菌株A4 所制菌粉對As3+吸附的正交優(yōu)化條件為：菌粉投加量0.02 g/L、吸附時間2 h、pH 值8.0 和溫度20℃，此條件下菌粉對As3+的吸附量為128 mg/g。

3）吸附動力學擬合數(shù)據(jù)顯示菌粉對As3+的吸附符合準一階動力學；Langmuir 模型較Freundlich模型更適合描述菌株A4 所制菌粉對As3+的吸附特征，且最大As3+量為114.6 mg/g。

4）菌株A4 所制菌粉對As3+的吸附機理一方面在于菌粉表面Mg2+和As3+的離子交換作用，另一方面在于菌粉表面的羧基、羥基、胺基等活性基團與As3+的絡合作用。向As 污染水體施加菌株A4 有利于去除As3+，從而提升水體環(huán)境容量。