柏秋月，鄧百萬,2**，解修超,2，寧 靜，常 寧

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata） 屬于擔(dān)子菌門（Basidomycota） 球蓋菇科（Strophariaceae）球蓋菇屬（Stropharia），又名皺球蓋菇、酒紅大球蓋菇等[1]。其色澤艷麗、腿粗蓋肥、食味清香，含有相當(dāng)高的蛋白質(zhì)和多種礦物質(zhì)元素及維生素[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大球蓋菇在改善冠心病[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]、抑菌[6]等方面作用顯著，且其作為世界交易的十大菇品種之一，需求量大，因此受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注[7]。

近年來，我國食（藥） 用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，傳統(tǒng)的固體菌種由于培養(yǎng)周期長，生長緩慢，菌絲易老化，使得大球蓋菇的大規(guī)模生產(chǎn)受到一定的限制。而液體菌種具有生長周期短，生長快，菌種純度高，適合大規(guī)模生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)[8]，更易于實(shí)現(xiàn)大球蓋菇工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、周年化生產(chǎn)。但大球蓋菇的液體培養(yǎng)基菌體生長較慢，而目前對于食用菌的的培養(yǎng)基優(yōu)化多采用單因素試驗(yàn)，其存在試驗(yàn)次數(shù)多、周期長和結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)[9]。因此，為提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確信，減少試驗(yàn)研究的工作量，研究以大球蓋菇1 號(hào)子實(shí)體作為材料進(jìn)行分離純化，得到大球蓋菇菌株，并通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面分析試驗(yàn)對大球蓋菇液體培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方，使大球蓋菇1 號(hào)菌絲體在短期內(nèi)生物量達(dá)到最大，彌補(bǔ)固體菌種在生產(chǎn)中的不足，以期為大球蓋菇1號(hào)液體種的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試大球蓋菇于2019 年5 月采自陜西省漢中市南鄭縣，品種為大球蓋菇1 號(hào)，審定編號(hào)為川審菌2004 004。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZRD-A7230 鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；FA2004 電子分析天平，上海精科天平有限公司；HWY-2112 型恒溫培養(yǎng)箱，中國廈門醫(yī)療電子儀器廠；HWY-2112 型搖床，廈門德維科技有限公司；K960 型熱循環(huán)PCR 儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；DYCZ-22A 型水平電泳儀，北京六一廠。

1.3 培養(yǎng)基

改良馬鈴薯培養(yǎng)基：土豆200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、磷酸二氫鉀5 g·L-1、硫酸鎂3 g·L-1、VB10.1 g·L-1、瓊脂15 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖20 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、磷酸二氫鉀3 g·L-1、硫酸鎂2 g·L-1、玉米粉10 g·L-1、VB11 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

察式培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、氯化鉀0.5 g·L-1、硫酸亞鐵0.01 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

1.4 方法

1.4.1 菌種的分離純化

將大球蓋菇1 號(hào)子實(shí)體用無菌水沖洗干凈后，先在75%酒精溶液中浸泡30 s，用無菌水沖洗后置于0.1%升汞溶液中浸泡5 min，再用無菌水沖洗5次~6 次后用無菌濾紙吸干其表面的水，置于墊有滅菌濾紙的平皿上[10]。用解剖刀取菌蓋及菌柄與菌蓋交界處取約6 mm 菌肉接種至馬鈴薯培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)箱下培養(yǎng)，得到大球蓋菇1 號(hào)菌株004。

1.4.2 菌種形態(tài)鑒定及ITS 分子鑒定

將分離的大球蓋菇1 號(hào)菌株004 接于察氏培養(yǎng)基上，取其菌絲采用棉藍(lán)染色法在光學(xué)顯微鏡下對菌絲體的形態(tài)和大小進(jìn)行鑒定[11]。

將分離的大球蓋菇菌絲體利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB 法） 提取DNA，并采用真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmoL·L-1上、下游引物各1 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 補(bǔ)至30 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序[12]，將測得序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 同源比對，使用MEGA 7.0軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株分類地位。

1.4.3 菌絲球干質(zhì)量測定方法

取1.00 cm2的大球蓋菇1 號(hào)菌絲塊接種于150 mL 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3 組，靜置24 h 后于28℃，140 r·min-1搖床發(fā)酵10 d，將發(fā)酵液抽濾后，置于干燥箱中60℃烘干水分后稱重，菌絲球干重（Y，g·150-1mL-1） 取平均值[13]。

1.4.4 Plackett-Burman 試驗(yàn)

以蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、酵母膏（X3）、KH2PO4（X4）、MgSO4（X5）、玉米粉（X6）、VB1（X7） 等因素為研究對象，進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)，按表1 和表3 配置液體培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，菌絲球干重（Y） 取平均值，并采用Minitab 18 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.1 Plackett-Burman experimental design table

1.4.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)的設(shè)計(jì)分析影響菌株004 菌絲體干重的因素，將正效應(yīng)顯著性因素逐步增加，負(fù)效應(yīng)顯著因素逐步減少，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，對于影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但使生物量升高的因素取“+1”水平，對于影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但使生物量降低的因素取“-1”水平[14]。

1.4.6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取MgSO4（X5）、玉米粉（X6）、VB1(X7) 3 個(gè)因素作為自變量，對每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1、0、+1 進(jìn)行3 因素3水平的試驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，菌絲球干重（Y）取平均值，因素和水平編碼，如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.2 Box-Behnken experimental design table

1.4.7 數(shù)據(jù)處理和分析

利用Minitab 18 軟件對Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株菌落形態(tài)及顯微特征

菌株004 菌落形態(tài)與顯微特征見圖1。

由圖1 可知，菌株004 的菌落形態(tài)及顯微特征：菌落呈圓形，呈放射狀蔓延；菌絲白色，絲狀，氣生菌絲較少，有多且明顯雙核菌絲[16]。

2.2 菌株序列分析

大球蓋菇1 號(hào)菌株004 ITS 的擴(kuò)增結(jié)果顯示其序列大小在800 bp 左右。將菌種ITS 序列測序后，提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行序列分析和相似性比較，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

由圖2 可知菌株004 與Strophariasp.ITS 基因序列具有99%相似率，說明其屬于大球蓋菇。

2.3 菌株004 初始生物量

將大球蓋菇1 號(hào)菌株004 接種于150 mL 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測得3 組菌絲球干重分別為0.882 3 g·150-1mL-1、0.892 9 g·150-1mL-1、0.901 1 g·150-1mL-1。大球蓋菇1 號(hào)菌株004 菌絲球干重平均值為0.892 1 g·150-1mL-1。

2.4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)生成的12 次試驗(yàn)，考察蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、玉米粉、VB1等7 個(gè)因素對大球蓋菇菌絲體干重（Y） 的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。利用軟件Minitab 18 對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如表4 所示。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.3 Plackett-Burman test design and response values

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)分析結(jié)果（已編碼單位）Tab.4 Plackett-Burman experimental results (coded units)

由表3、表4 可知，MgSO4（X5）、玉米粉（X6）和VB1(X7) 為顯著性因素，可作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。其中，X5和X7增加時(shí)，菌絲生物量增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），為正效應(yīng)因素，而X6增加時(shí)，菌絲生物量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），為負(fù)效應(yīng)因素。

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

為了建立更有效的響應(yīng)面擬合方程，必須進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)是以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長[17]。由PB 試驗(yàn)可知MgSO4、玉米粉、VB1對于大球蓋菇生物量有顯著影響，因此根據(jù)3 個(gè)因素效應(yīng)的大小比例設(shè)定其變化步長進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5 所示。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.5 Design and results of steepest climbing test

表5 結(jié)果表明，在MgSO44.5 g·L-1、玉米粉4 g·L-1和VB12.6 g·L-1時(shí)，大球蓋菇1 號(hào)菌株004 的菌絲球干重最大為1.141 3 g·150-1mL-1，應(yīng)將此作為最佳響應(yīng)區(qū)域。

2.6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

根據(jù)表2 中的因素水平設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平Box-Behnken 試驗(yàn)，結(jié)果如表6 所示。

表6 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表Tab.6 Box-Behnken central composite factor horizontal coding table

表6 結(jié)果表明，X6X7項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；X6、X7、X5X7、X52、X62、X72項(xiàng)極有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，X5、X5X6無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型P值為0.000 2，可信度為99.99%，因此模型有意義，二次回歸方程可靠，失擬項(xiàng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值0.177 6>0.05），說明試驗(yàn)操作可信。運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件響應(yīng)面分析程序?qū)?7 組試驗(yàn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得到表8回歸方程方差分析表。

表7 回歸分析結(jié)果Tab.7 Regression analysis results

由表7 可知，R2=0.970 1，R2adj= 0.931 7。F值可得到X5、X6和X7對Y的影響順序：X6>X7>X5，即玉米粉>VB1>MgSO4，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行非線性的二次多項(xiàng)式擬合，得到的預(yù)測模型為：Y=-11.292 85+2.132 2X5+0.161 32X6+5.722 91X7-0.022 363X5X6+0.072 281X6X7-0.226 31X5X7-0.160 04X52-0.026 923X62-0.991 83X72。

2.7 響應(yīng)面圖分析

將一個(gè)因素固定在0 水平，做另外2 個(gè)因素交互作用的曲面圖及等高線圖[18]，確定MgSO4、玉米粉與VB1對大球蓋菇菌絲生物量影響，如圖3~圖5。

由表7 可知，當(dāng)以大球蓋菇菌絲生物量為響應(yīng)值時(shí)，MgSO4與玉米粉并無交互作用。由圖3、圖4和圖5 可知，VB1與MgSO4和玉米粉的交互作用等高線圖呈明顯的橢圓形，說明交互作用顯著，對大球蓋菇菌絲生物量有顯著影響。這可能是因?yàn)閂B1作為生長因子，能夠促進(jìn)菌絲的生長。當(dāng)VB1用量為2.5 g·L-1左右時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大。當(dāng)VB1用量低于2.5 g·L-1時(shí)，菌絲生物量隨著VB1的增加而增加，表明在此范圍內(nèi)，VB1與MgSO4和玉米粉具有協(xié)同左右，提高生長因子VB1的用量可促進(jìn)菌絲的生長。當(dāng)超過最佳用量時(shí)，菌絲生物量先降低后趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)楫?dāng)VB1超過一定用量時(shí)，又開始抑制菌絲的生長，因此會(huì)導(dǎo)致菌絲生物量的降低，但其機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，菌絲體干重（Y） 最大估值為1.193 3 g·150-1mL-1，對應(yīng)的因素濃度為MgSO44.56 g·L-1、玉米粉4.25 g·L-1、VB12.43 g·L-1，即為最佳培養(yǎng)基配方。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性，采用上述最佳培養(yǎng)基配方做驗(yàn)證性試驗(yàn)，最終得到菌株004 菌絲生物量為1.215 4 g·150-1mL-1，在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下其菌絲生物量為0.892 1 g·150-1mL-1，優(yōu)化后提高了36.2%，實(shí)測值與擬合值誤差約為1.9%，結(jié)果表明，該模型的可靠性較高，可很好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面法優(yōu)化大球蓋菇1 號(hào)液體培養(yǎng)基是可行有效的。

3 討論

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)主要用于關(guān)鍵參數(shù)的篩選，最陡爬坡試驗(yàn)用于在Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步逼近最優(yōu)區(qū)域。而響應(yīng)面設(shè)計(jì)是從眾多因子中尋找最佳組合的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，能夠?qū)τ绊戫憫?yīng)值的各因子及其交互作用進(jìn)行全面評價(jià)，得到最優(yōu)組合[19]。

通過采用Plackett-Burman 試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法考察了蔗糖、蛋白胨、玉米粉等7 個(gè)因素對大球蓋菇1 號(hào)菌絲生物量的影響，并得到相應(yīng)的預(yù)測模型，優(yōu)化的液體培養(yǎng)基組分為蔗糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、KH2PO43.00 g·L-1、MgSO44.56 g·L-1、玉米粉4.25 g·L-1、VB12.43 g·L-1，對優(yōu)化后的大球蓋菇1 號(hào)液體培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得最佳培養(yǎng)基的菌絲生物量提高36.2%，達(dá)到1.215 4 g·150-1mL-1，與模型預(yù)測結(jié)果相近，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。而孫清波等[20]運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化大球蓋菇液體培養(yǎng)基得到的菌絲生物量為0.6 g·150-1mL-1，低于本研究優(yōu)化結(jié)果，證明本研究優(yōu)化結(jié)果有效，能夠?yàn)榇笄蛏w菇液體菌種的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論和依據(jù)。但本試驗(yàn)缺少對培養(yǎng)條件的優(yōu)化，無法確定培養(yǎng)條件對菌絲生長的影響，因此在大球蓋菇液體種的培養(yǎng)條件上仍需進(jìn)行研究。