韓瑜瑋，劉洋洋，陳 偉

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris（L.）Link）又稱北蟲草，是少數(shù)可以規(guī)?；a(chǎn)的食用真菌之一，也是我國最常見、分布最廣、藥用價值極高的一種蟲草菌[1]。蛹蟲草中的主要活性成分蛹蟲草多糖具有抑制腫瘤、抗炎癥、抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)免疫等功能[2-4]。多數(shù)研究認(rèn)為蛹蟲草多糖對肝臟的保護(hù)作用主要是通過提高機(jī)體的抗脂質(zhì)過氧化能力、改善人體細(xì)胞免疫和體液免疫及提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能實(shí)現(xiàn)[5-9]。

發(fā)酵型酸奶有提高自由基清除能力、過氧化物清除能力，降低血清膽固醇水平的功效[11-13]。蔡宇[14]、朱蘊(yùn)蘭[15]等利用蛹蟲草菌絲體及發(fā)酵液研制了一種功能性酸奶飲料。

隨著我國居民飲酒頻率和脂肪攝入量增加，酒精性肝損傷成為除病毒性肝炎之外的另一個重要危險因素[16]。而蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷協(xié)同保護(hù)作用的研究鮮有報道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵獲得蛹蟲草胞外多糖，以添加蛹蟲草胞外多糖及保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌3 種混菌發(fā)酵的酸奶為研究對象，灌胃酒精模型小鼠。通過生化指標(biāo)的變化分析蛹蟲草多糖酸奶對小鼠酒精性肝損傷的協(xié)同保護(hù)作用，為開發(fā)蛹蟲草多糖功能性乳制品提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性昆明小鼠56 只，體質(zhì)量（20f 2）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2018-0003。

蛹蟲草菌種，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；植物乳桿菌發(fā)酵劑 常州益菌加生物科技有限公司；脫脂乳粉 澳大利亞邁高乳業(yè)公司。

聯(lián)苯雙酯滴丸 萬邦德制藥集團(tuán)股份有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測試盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測試盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測試盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒 南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

PDA固體培養(yǎng)基：土豆20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、瓊脂粉2%、葡萄糖2%、K2HPO40.15%、MgSO40.10%，121 ℃滅菌20 min。

蛹蟲草液體培養(yǎng)基：土豆2 0%、葡萄糖2%、K2HPO40.15%、MgSO40.10%，121 ℃滅菌20 min[17]。

1.2 儀器與設(shè)備

SMP500-17805-2BF0酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司； TDZ5-WS臺式多管自動平衡離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；SW-CJ-1CU潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮有限公司； 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；RM2135石蠟切片機(jī) 德國Leica公司；HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng) 武漢千屏影像技術(shù)有限公司；YD-A型攤片機(jī)、YD-6L型冷凍工作臺、YD-6L型全自動生物組織包埋機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草多糖提取

蛹蟲草菌種在PDA固體培養(yǎng)基中活化，在無菌條件下接種到滅菌的蛹蟲草液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，抽濾；濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/5；用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液4 ℃醇析24 h，3 800 r/min離心，獲得粗多糖；溶解至一定體積水中，以1/4體積量加入Sevag液（氯仿-正丁醇體積比4∶1），去蛋白；多糖溶液醇析24 h，3 800 r/min離心，獲得脫蛋白多糖；Sephadex G-100柱過濾層析，得到蛹蟲草多糖純品[18]。

1.3.2 蛹蟲草多糖的分子質(zhì)量測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）測定蛹蟲草的重均分子質(zhì)量（weight-average molecular weights，Mw）、數(shù)均分子質(zhì)量（numberaverage molecular weights，Mn）和平均分子質(zhì)量（z-average molecular weight，Mz）[18]。

1.3.3 蛹蟲草多糖的基本指標(biāo)測定

使用苯酚-硫酸法測定蛹蟲草多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用Bradford的方法測定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過間羥基二苯基比色法測定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[18]。

1.3.4 蛹蟲草多糖酸奶的配制

加入13%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）脫脂乳粉、6%蔗糖，蛹蟲草多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.03%、0.06%、0.12%，95 ℃水浴15 min進(jìn)行巴氏殺菌，待冷卻至42 ℃，接種0.1%發(fā)酵菌粉（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌接種質(zhì)量比為3∶1∶1），制備蛹蟲草多糖益生菌酸奶，41 ℃恒溫培養(yǎng)發(fā)酵6 h，后熟12 h，4 ℃貯存?zhèn)溆肹19]。

1.3.5 動物分組及給藥

小鼠隨機(jī)分7 組，每組8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，除空白對照組外，各組每天灌胃150 mg/kgmb體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液，建立小鼠酒精性肝損傷模型。每日灌胃相應(yīng)樣品，共給藥28 d，期間供給顆粒飼料，不限制飲食飲水。分組及給藥劑量如表1所示。

表 1 各組小鼠的基本給藥情況（n＝8）Table 1 Administration scheme for mice in each group (n= 8)

1.3.6 檢測方法及檢測指標(biāo)

1.3.6.1 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的體質(zhì)量變化、進(jìn)食、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況。

1.3.6.2 小鼠肝臟指數(shù)測定

小鼠肝臟指數(shù)根據(jù)下式計算。

1.3.6.3 小鼠血清的制備

小鼠眼球取血置于離心管中，放置30 min，3 800 r/min離心10 min，取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6.4 血液中生化指標(biāo)的測定按照試劑盒說明測定血清ALT、AST、LDL-C和HDL-C，測量血漿TG和TC水平[20]。

1.3.6.5 小鼠肝臟組織勻漿的制備

小鼠脫頸處死，迅速刨出肝臟組織用預(yù)冷的生理鹽水洗去殘留血，濾紙拭干，稱質(zhì)量。按1∶9（m/V）比例制成10%組織勻漿液，4 ℃條件貯存?zhèn)溆肹21]。

1.3.6.6 肝臟組織中生化指標(biāo)的測定

按照試劑盒說明測定SOD、GSH-Px活力及MDA含量。采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.6.7 病理學(xué)切片的制作

質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定24 h，脫水透明處理，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包完成統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草多糖的分子質(zhì)量

蛹蟲草多糖Mw、Mn和Mz分別為2.5 8 h 1 03、1.95h 103、3.15h 103Da，Mw/Mn為1.32。

2.2 蛹蟲草多糖的基本指標(biāo)

蛹蟲草多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（8 4.0 2 f 3.7 5）%、（3.18f 0.12）%、（17.65f 0.07）%。

2.3 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

乙醇灌胃小鼠后，小鼠均表現(xiàn)出四肢癱軟等興奮狀態(tài)[22]。不同添加量（0.03%、0.06%、0.12%）蛹蟲草多糖酸奶對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響見表2，在空白對照組和模型組之間觀察到體質(zhì)量增長比例沒有顯著的變化。與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著提高了56.82%（P＜0.05），說明乙醇能夠造成小鼠肝腫脹。與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶組，陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)分別降低3.38%、7.89%、13.21%、16.26%、25.93%。與酸奶對照組相比，高劑量蛹蟲草多糖酸奶組肝臟指數(shù)顯著下降13.13%（P＜0.05）。與陽性對照組相比，低、中、高劑量蛹蟲草多糖酸奶組肝臟指數(shù)均有提高，分別提高24.35%、17.17%、13.04%。

表 2 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on body mass and liver index in mice

2.4 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

在本研究中，模型組與空白對照組相比，模型組ALT、AST活力分別增加了91.84%、65.52%（表3），表明建模成功[23]。ALT和AST均為非特異性細(xì)胞內(nèi)功能酶，在正常動物血清中的含量很低[24]，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時，肝細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST逸出細(xì)胞進(jìn)入血漿使酶活力增高，是臨床上常用的肝功能評價 指標(biāo)[25]。所以ALT與AST活力可以在一定程度上反映生物體內(nèi)肝細(xì)胞的損傷程度[26]。

表 3 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠血清AST、ALT活力的影響Table 3 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on AST and ALT activities in serum of mice

與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶組，陽性對照組ALT活力分別顯著降低10.99%、33.33%、47.87%、58.87%、40.07%，AST活力下降8.74%、22.51%、34.55%、38.89%、 42.19%（P＜0.05）。

未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對肝功能有一定作用，與模型組相比，ALT、AST活力分別顯著性降低10.99%、8.74%。而高劑量蛹蟲草多糖酸奶效果更加明顯，與模型組相比，ALT活力顯著性降低58.87%，AST活力下降38.89%。說明蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高肝功能。與陽性對照組相比，蛹蟲草多糖高劑量酸奶組ALT活力顯著降低31.36%，AST活力提高5.71%，高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯同樣對小鼠肝功能有很好的改善作用。

2.5 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂肪代謝的影響

表 4 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠血清TG、TC、HDL-C、 LDL-C濃度的影響Table 4 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on TG, TC, HDL-C and LDL-C contents in serum of mice

小鼠經(jīng)酒精連續(xù)灌胃28 d后，肝臟發(fā)生脂肪性病變，脂肪代謝能力下降，導(dǎo)致血液中TG、TC濃度上升[27]。模型組TG、TC濃度均明顯高于空白對照組（P＜0.05），各樣品處理組與模型組相比，TG、TC濃度均降低 （表4）。與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組，陽性對照組TG濃度分別下降4.43%、25.09%、33.21%、39.48%、42.44%，TC濃度分別下降4.86%、12.71%、20.75%、26.92%、31.78%。與陽性對照組相比，蛹蟲草多糖高劑量酸奶處理組TG、TC濃度分別下降5.13%、7.12%。

HDL、LDL與膽固醇在體內(nèi)的運(yùn)輸密切相關(guān)，HDL-C、LDL-C濃度會隨著血液中TG濃度的變化而改變[28-30]。同對照組相比，模型組HDL-C濃度顯著下降 （P＜0.05），LDL-C濃度顯著上升（P＜0.05）。與模型組相比，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組，陽性對照組的LDL-C濃度分別降低10.24%、24.88%、30.73%、38.54%、80.00%，HDL-C濃度分別提高1.33%、7.33%、14%、20.67%、12.00%。與陽性對照組相比，蛹蟲草多糖高劑量酸奶處理組，HDL-C濃度顯著提高2.07 倍，LDL-C水平顯著提高了7.74%。

未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對脂肪代謝能力的提高有一定作用，與模型組相比，TG、TC、LDL-C濃度顯著降低4.43%、4.86%、10.24%，HDL-C濃度提高1.33%。而高劑量蛹蟲草多糖酸奶與模型組相比，TG、TC、LDL-C濃度分別顯著降低39.48%、26.92%、38.54%，HDL-C含量顯著提高20.67%，蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高脂肪代謝能力。高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯都對小鼠肝臟脂肪代謝有很好的促進(jìn)作用。

2.6 蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響

表 5 蛹蟲草多糖酸奶對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 5 Effect of yoghurt with Cordyceps militaris polysaccharides on SOD and GSH-Px activities and MDA level in liver of mice

MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物[31]用于量化脂質(zhì)過氧化程度，在一定程度上反映組織損傷時出現(xiàn)的過強(qiáng)氧化作用。肝臟組織中MDA含量越高，說明其氧化活性越強(qiáng)，肝臟組織受損越嚴(yán)重[32-33]。模型組與空白對照組相比，MDA含量顯著上升26.18%（P＜0.05）（表5）。與模型組相比，酸奶對照組，低、中、高劑量蛹蟲草多糖酸奶組，陽性對照組差異顯著（P＜0.05）。

SOD、GSH-Px是消除活性氧的重要內(nèi)源性抗氧化酶[34]。 小鼠在40%乙醇灌胃28 d后，其體內(nèi)乙醇代謝引發(fā)多種氧化應(yīng)激反應(yīng)，模型組小鼠肝臟過氧化物的含量顯著升高，抗氧化能力明顯下降，蛹蟲草多糖酸奶組小鼠肝臟抗氧化能力均有所改善。模型組與空白對照組小鼠相比， GSH-Px、SOD活力顯著下降（P＜0.05）（表5）。與模型組相比，酸奶對照組，蛹蟲草多糖低、中、高劑量酸奶處理組，陽性對照組GSH-Px、SOD活力均有提高。

未添加蛹蟲草多糖的對照酸奶對提高肝臟抗氧化的能力有一定作用，與模型組相比，GSH-Px、SOD活力分別提高7.64%、1.90%，MDA含量降低4.90%，高劑量蛹蟲草多糖酸奶與模型組相比，GSH-Px、SOD活力分別提高53.95%、25.16%，MDA含量降低49.57%，蛹蟲草多糖與植物乳桿菌能夠協(xié)同提高脂肪代謝能力。蛹蟲草高劑量多糖酸奶與聯(lián)苯雙酯對小鼠肝臟抗氧化都有很好的促進(jìn)作用。

2.7 病理切片分析結(jié)果

圖 1 肝臟組織病理切片（×400）Fig. 1 Histological observation of liver tissue (× 400)

由圖1可知，空白對照組肝細(xì)胞排列規(guī)則、形態(tài)正常、無脂肪變性癥狀，肝細(xì)胞呈放射狀整齊排列，細(xì)胞核呈圓形（圖1a）；在模型組肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量的脂肪或水泡變性，并且一些細(xì)胞核消失，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹，甚至出現(xiàn)肝細(xì)胞成片壞死 （圖1b）；酸奶對照組肝索排列紊亂，并且一些細(xì)胞核消失，肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量的脂肪或水泡變性肝細(xì)胞明顯腫脹（圖1c）；低劑量組中肝細(xì)胞腫脹嚴(yán)重，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，出現(xiàn)縮固現(xiàn)象（圖1d）；中劑量組中央靜脈周圍仍有部分肝細(xì)胞脂肪變性，腫脹范圍減小，程度減輕（圖1e）；高劑量組中肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常，未見明顯細(xì)胞變性及壞死（圖1f）；陽性對照組中，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常，細(xì)胞核形狀規(guī)則（圖1g）。病理組織形態(tài)學(xué)觀察提示：3 種蛹蟲草多糖酸奶對小鼠酒精性肝損傷有不同程度的保護(hù)作用，其中以高劑量組保護(hù)作用比較明顯。

3 結(jié) 論

不同劑量蛹蟲草多糖酸奶組各項(xiàng)指標(biāo)與陽性對照組各項(xiàng)指標(biāo)具有相同的變化趨勢，肝功能與脂肪代謝功能均得到顯著改善，肝臟抗氧化能力顯著增強(qiáng)。且高劑量蛹蟲草多糖酸奶處理組與等劑量聯(lián)苯雙酯處理相比，大部分指標(biāo)反映高劑量蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷具有同樣良好的干預(yù)作用。

酸奶對改善肝功能與脂肪代謝功能、增強(qiáng)肝臟抗氧化能力有一定的作用。添加蛹蟲草多糖的酸奶對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用明顯高于未添加蛹蟲草多糖的酸奶。高劑量蛹蟲草多糖酸奶對酒精性肝損傷保護(hù)作用效果較好。植物乳桿菌益生發(fā)酵的蛹蟲草多糖酸奶可發(fā)揮蛹蟲草多糖和植物乳桿菌在護(hù)肝功能方面的協(xié)同作用，具有更高的效果，為蛹蟲草多糖功能性乳制品的開發(fā)推廣提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。