張?zhí)m蘭，鄧杰，郭燕，徐升東，黎仲冰，衛(wèi)春會(huì)*

(1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000； 2.四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司，四川 閬中 637400；3.中國(guó)人民解放軍原濟(jì)南軍區(qū)新技術(shù)農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)基地，山東 鄒城 273517)

桑葚(mulberry)是?？粕僦参锍墒旃氲慕y(tǒng)稱，又名桑烏、桑果、桑棗[1]。果實(shí)味甜汁多，色澤鮮艷，顏色主要有黃棕色、棕紅色至暗紫色[2]。桑葚營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有多種人體必需氨基酸、微量元素及維生素[3]。同時(shí)桑葚還是中藥，具有烏發(fā)明目、補(bǔ)虛祛濕等功效，屬于藥食同源的食物[4]，被譽(yù)為“民間圣果”、“百果之先”等美名[5]。桑葚中起顯著作用的是花青素，花青素(anthocyanidin)屬黃酮化合物，有很強(qiáng)的抗氧化能力，能夠促進(jìn)人體健康[6,7]。食用它不僅能夠美容養(yǎng)顏、護(hù)肝、抗腫瘤、抗氧化、預(yù)防動(dòng)脈硬化等，還具有顯著提高人體免疫力的功效[8-10]?；ㄇ嗨剡€能改善大腦發(fā)育過程中乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[11]，預(yù)防大腦動(dòng)脈閉塞、再灌注損傷和促進(jìn)刺激視紫紅質(zhì)再生等[12,13]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)合成色素安全的擔(dān)憂日漸顯著，花青素作為一種天然色素，安全、無異味、資源豐富，而且具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，在食品、飲料、化妝品、醫(yī)藥方面有著較大的應(yīng)用潛力[14]。

目前，對(duì)花青素的穩(wěn)定性和抗氧化活性有不少研究，卓毓光等[15]通過分析影響花青素穩(wěn)定性的因素，總結(jié)了提高花青素穩(wěn)定性的途徑；侯巧芝等[16]研究表明桑葚花青素抗氧化活性隨著濃度的增大呈線性增強(qiáng)。針對(duì)花青素提取研究常用的方法有超聲波-乙醇法、超聲波提取法、微波提取法等[17]。但通過乙醇溶劑浸取法提取桑葚花青素的研究并不多，因此，對(duì)乙醇溶劑浸取法提取花青素的研究是很有必要的。本研究采用乙醇溶劑浸取法提取桑葚花青素，通過單因素和正交設(shè)計(jì)對(duì)花青素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳乙醇溶劑浸取花青素工藝，從而為桑葚深加工技術(shù)提供理論與技術(shù)支持，為高效利用開發(fā)桑葚花青素打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料及預(yù)處理

桑果干：由四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司提供。

將桑果干在干燥箱中烘干，再用粉碎機(jī)打成粉末狀，過20目篩，放于干燥器中密封儲(chǔ)藏備用。

1.1.2 試劑

95%乙醇、濃鹽酸、乙酸鈉、氯化鉀等均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

UV-1200型紫外可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Starter 2100型pH計(jì) 奧豪斯儀器(上海)有限公司；XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；AR2140型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；1500型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司；BM255C型粉碎機(jī) 廣東美的精品電器制造有限公司；LabServ.LS.0610型干燥箱 飛世爾試驗(yàn)器材(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 緩沖液的配制

pH 1.0氯化鉀-鹽酸緩沖的液配制：①精確稱取7.45 g的KCl固體放置于燒杯中，在容量瓶中用蒸餾水定容至500 mL，配成0.2 mol/L KCl溶液；②精確量取8.5 mL濃鹽酸在容量瓶中用蒸餾水定容至500 mL，配成0.2 mol/L HCl溶液；③將KCl溶液與HCl溶液以25∶67的比例混合，再用KCl溶液調(diào)pH至1.0±0.1[18]。

pH 4.5醋酸鈉-鹽酸緩沖液的配制：精確稱取16.4 g的NaAc在容量瓶中用蒸餾水定容到1000 mL，再用鹽酸調(diào)pH至4.5±0.1。

1.3.2 最大吸收波長(zhǎng)Amax及吸光值A(chǔ)的檢測(cè)

稱取粉碎后的干桑葚5.0 g，加入10 mL 50%乙醇浸提15 min，抽濾后得到花青素粗提取液，再取5 mL花青素提取液，分別用pH 1.0氯化鉀緩沖液或pH 4.5醋酸鈉緩沖液稀釋10倍后，將稀釋液靜置15 min，用酶標(biāo)儀在440～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別測(cè)定兩種提取稀釋液，從440 nm開始的吸光值A(chǔ)，波峰處的波長(zhǎng)值為最大吸收波長(zhǎng)即Amax。

1.3.3 吸光值A(chǔ)及樣品花青素含量C的測(cè)定

花青素的含量測(cè)定采用pH示差法，公式如下：

A=(Amax-A700)pH 1.0-(Amax-A700)pH 4.5。

(1)

C(mg/g)=(A/εL)×Mw×DF×V/Wt。

(2)

式中：A為總吸光值；Amax為最大吸收波長(zhǎng)值；A700為波長(zhǎng)為700 nm的吸光值；ε為Cy-3-Glu的消光系數(shù)(其值為26900 L/(mol·cm)；Mw為Cy-3-Glu的相對(duì)分子質(zhì)量(449.2 g/mol)；DF為稀釋倍數(shù)；V為總?cè)∫后w積(mL)；Wt為樣品質(zhì)量(g)；L為光程(1 cm)。

1.3.4 工藝流程

原料桑葚果干→粉碎→過篩(20目篩)→乙醇溶劑浸提→抽濾→取樣測(cè)定吸光值→計(jì)算含量→旋轉(zhuǎn)濃縮→冷凍干燥→花青素粗品。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溶劑pH、提取時(shí)間、提取溫度5個(gè)因素對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH為4.0、提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶10 (g/mL)的情況下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.2 料液比的確定

稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH為4.0、提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為60 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為的65%情況下，考察料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.3 溶劑pH的確定

稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶10 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%情況下，考察溶劑pH分別為2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.4 提取時(shí)間的確定

稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH為4.0、提取溫度為40 ℃、料液比為1∶10 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的情況下，考察提取時(shí)間分別為60,90,120,150,180 min對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.5 提取溫度的確定

稱取1.0 g粉碎后的桑葚粉置入250 mL的三角瓶中，在pH為4.0、提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶10 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的情況下，考察提取溫度分別為30,40,50,60,70 ℃對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為變量，以花青素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，從而確定桑葚花青素的最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸光值A(chǔ)max的確定

在440～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別測(cè)定兩種提取稀釋液，桑葚果中花青素最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定曲線見圖1。

圖1 桑葚花青素最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定曲線Fig.1 Measuring curves of the maximum absorption wavelength of anthocyanins in mulberry

由圖1可知，兩條折線均在波長(zhǎng)530 nm處出現(xiàn)波峰，吸光值達(dá)到最大，因此，采用波長(zhǎng)為530 nm測(cè)定提取液的吸光值，并通過示差法計(jì)算花青素樣品吸光值A(chǔ)。

2.2 單因素條件對(duì)桑葚花青素含量的影響

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑葚花青素提取量的影響

本試驗(yàn)考察了不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑葚花青素提取量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響Fig.2 Effect of different ethanol volume fractions on anthocyanins extraction amount

由圖2可知，隨著酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，桑葚花青素提取量不斷增大，在酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)提高酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取量反而逐漸降低。在酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，糖類、果膠和其他水溶性物質(zhì)的溶解性好，影響了花青素的溶出，導(dǎo)致花青素的提取量較低[19]；當(dāng)酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，脂溶性物質(zhì)易溶出[20]，影響花青素溶出，導(dǎo)致花青素提取量偏低。因此，選取體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液。

2.2.2 料液比對(duì)桑葚花青素提取量的影響

本試驗(yàn)考察了不同料液比對(duì)桑葚花青素提取量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同料液比對(duì)花青素提取量的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on anthocyanins extraction amount

由圖3可知，隨著提取液料液比的增大，桑葚花青素提取量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，表明在一定范圍內(nèi)提高料液比有利于提高花青素含量；在料液比為1∶10 (g/mL)時(shí)花青素濃度為2.4 mg/g，當(dāng)料液比低于1∶10 (g/mL)時(shí)，桑葚花青素提取不完全；當(dāng)料液比超過1∶10 (g/mL)時(shí)，花青素可能在酸性條件下被破壞，從而導(dǎo)致花青素提取量減少。故選擇料液比為1∶10 (g/mL)。

2.2.3 溶劑pH對(duì)桑葚花青素提取量的影響

本試驗(yàn)考察了不同溶劑pH對(duì)桑葚花青素提取量的影響，結(jié)果見圖4?；ㄇ嗨卦谒嵝詶l件下比較穩(wěn)定，因此將提取劑pH調(diào)為2～5。

圖4 不同乙醇溶液pH對(duì)花青素提取量的影響Fig.4 Effect of different pH values of ethanol solution on anthocyanins extraction amount

由圖4可知，隨著pH的變化，桑葚花青素濃度變化，pH先逐漸增大后降低，在pH值達(dá)到4.0時(shí)，提取量達(dá)到最大值。pH過低，導(dǎo)致花青素的糖苷鍵斷裂，從而使花青素吸光值較低；pH增大，提取出的花青素提取量反而減小，可能是因?yàn)閜H過高影響花青素的穩(wěn)定性，進(jìn)而使花青素吸光值減小。因此，本試驗(yàn)選擇提取液的pH為4.0。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)桑葚花青素提取量的影響

本試驗(yàn)考察了不同提取時(shí)間對(duì)桑葚花青素提取量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響Fig.5 Effect of different extraction time on anthocyanins extraction amount

由圖5可知，在提取時(shí)間為60～180 min范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素提取量先上升后下降，當(dāng)水浴浸提時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，提取的花青素提取量達(dá)到最大值。分析可能是花青素長(zhǎng)時(shí)間在較高的水浴溫度下發(fā)生氧化或降解，使花青素被破壞，故提取量降低。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取120 min為水浴浸提的最佳時(shí)間。

2.2.5 提取溫度對(duì)桑葚花青素提取量的影響

本試驗(yàn)考察了不同提取溫度對(duì)桑葚花青素提取量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同提取溫度對(duì)花青素提取量的影響Fig.6 Effect of different extraction temperatures on anthocyanins extraction amount

由圖6可知，隨著提取溫度由高到低，花青素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在60 ℃達(dá)到最大值，這說明在一定范圍內(nèi)升高溫度有利于花青素的提取。隨著溫度增加，花青素提取量逐漸增大，主要是因?yàn)闇囟饶芴岣呋ㄇ嗨卦谌軇┲械娜芙舛群蛿U(kuò)散速度，也有利于細(xì)胞的破壞，提高細(xì)胞膜的通透性；溫度繼續(xù)上升，花青素的提取量緩慢下降，主要是因?yàn)闇囟冗^高，桑葚花青素的穩(wěn)定性遭到部分破壞，使提取量有所下降，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇提取溫度為60 ℃。

2.3 桑葚花青素提取正交試驗(yàn)及結(jié)果

為了確定桑葚花青素的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。對(duì)比單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)料液比、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素的花青素提取量變化幅度比較大，且受外界影響比較大，而溶劑pH和提取時(shí)間對(duì)花青素提取的影響相對(duì)比較穩(wěn)定，且提取量的變化也比較清晰直觀。因此，選擇料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為變量。

在提取時(shí)間120 min，溶劑pH 4.0條件下，以花青素的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)定4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 乙醇溶劑浸取法花青素提取正交表Table 1 Orthogonal table of anthocyanins extracted by ethanol solvent extraction method

表2 乙醇溶劑浸取法方差分析表Table 2 Variance analysis table of ethanol solvent extraction method

注：“*”表示對(duì)結(jié)果影響差異性顯著(p<0.05)。

由表1可知，從極差值得到各因素對(duì)花青素提取量的影響大小為：料液比(B)>提取溫度(A)>體積分?jǐn)?shù)(C)，花青素提取量最佳提取條件組合為A2B2C1，即浸取溫度60 ℃，料液比1∶10(g/mL)，溶劑體積分?jǐn)?shù)為55%。

由表2可知，料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(p<0.05)，提取溫度、體積分?jǐn)?shù)對(duì)桑葚花青素提取量無顯著影響(p>0.05)。

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果

對(duì)上述正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果A2B2C1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在提取時(shí)間為120 min，溶劑pH為4.0的條件下，進(jìn)行5組平行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)極差分析工藝提取花青素含量為2.53 mg/g，故選擇最佳提取條件組合為A2B2C1，即提取溫度為60 ℃、料液比為1∶10 (g/mL)、體積分?jǐn)?shù)為55%。

表3 乙醇溶劑浸提法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification test results of ethanol solvent extraction method mg/g

3 結(jié)論

本研究采用乙醇溶劑浸取法提取桑葚花青素，在乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溶劑pH、提取時(shí)間、提取溫度等單因素研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。從各因素的極差值發(fā)現(xiàn)其對(duì)花青素提取量的影響大小為：料液比>提取溫度>體積分?jǐn)?shù)，其中料液比對(duì)桑葚花青素提取量有顯著性影響；通過工藝驗(yàn)證試驗(yàn)得到乙醇溶劑法提取花青素的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、料液比為1∶10 (g/mL)、提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為120 min、溶劑pH為4.0，提取得到的桑葚花青素提取量為2.53 mg/g。

乙醇溶劑浸取法與其他提取方法相比，操作簡(jiǎn)單，設(shè)備投入少，乙醇成本低，安全且產(chǎn)率也比較可觀，環(huán)保且能耗低，無論是實(shí)驗(yàn)室還是工業(yè)生產(chǎn)，均可推行，是很有應(yīng)用前景的桑葚花青素提取方法。本研究?jī)?yōu)化確定了乙醇浸提桑葚花青素的提取工藝，后續(xù)將開展花青素純化工藝，以期為今后桑葚花青素的規(guī)模化提取以及新產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。