張玲 李相安 程曉薇 鄒本革 聶凡皓 鄭剛 牟思洋 聶凡淇 姜雪萍

摘? 要：本研究對(duì)濰坊某種雞場(chǎng)死胚進(jìn)行病原菌分離鑒定，并從該種雞場(chǎng)孵化室污水中篩選對(duì)其敏感的噬菌體。結(jié)果顯示：病原菌為雞白痢沙門菌，命名為WF-1，且呈現(xiàn)多重耐藥性。利用從該孵化室污水中分離到的噬菌體WFSp1及實(shí)驗(yàn)室分離保存的5株（Sp1、Sp2、Sp3、Sp4和Sp5）沙門菌噬菌體對(duì)其進(jìn)行敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)噬菌體WFSp1對(duì)其敏感性最高。體外裂解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噬菌體WFSp1在160 min內(nèi)可完全裂解WF-1分離株，裂解增殖后的噬菌體效價(jià)高達(dá)2.5×1011 PFU/mL。該研究結(jié)果為用噬菌體制劑控制雞沙門菌感染提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：多重耐藥性;雞白痢沙門菌;分離鑒定;敏感噬菌體

中圖分類號(hào)：S831.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2020）12-0073-07

沙門菌引起的雞白痢是雞場(chǎng)常見的細(xì)菌性疾病，可經(jīng)種蛋垂直傳播，被污染的種蛋孵化率下降，或孵出帶菌雛雞，并成為雞場(chǎng)主要傳染源[1]。沙門菌還可通過被污染的飼料、飲水、墊料、糞便、老鼠和環(huán)境等水平傳播[2-3]。種雞場(chǎng)在臨床治療雞白痢時(shí)，如果盲目用藥，會(huì)加劇雞白痢沙門菌的耐藥性，進(jìn)而會(huì)給養(yǎng)雞業(yè)造成重大危害和經(jīng)濟(jì)損失。

噬菌體是生物界中數(shù)量最大的生物群體，也是目前已知的最大病毒群。在自然界，噬菌體的數(shù)量估計(jì)超過1030～1032個(gè)，被稱為生物界的“暗物質(zhì)”，是地球上最豐富的生命體[4-5]。噬菌體可以特異、高效地殺滅細(xì)菌，與抗生素相比，能大大地減少對(duì)微生物群體自然多樣性的破壞。因此，近年來噬菌體作為新型抗菌劑得到廣泛的研究，由此產(chǎn)生的產(chǎn)品層出不窮，遍及臨床醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、土壤改良等多個(gè)領(lǐng)域[6-7]。本研究從山東省濰坊市某種雞場(chǎng)孵化室的死胚中分離到一株多重耐藥性的雞白痢沙門菌，并測(cè)定其對(duì)噬菌體的敏感性，以期為種雞場(chǎng)利用噬菌體控制雞白痢提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1 樣本來源

細(xì)菌分離樣本來自濰坊和煙臺(tái)地區(qū)種雞場(chǎng)孵化室的死胚;分離噬菌體的樣本來自該孵化場(chǎng)的污水;雞白痢沙門菌陽(yáng)性菌株YN-1由本實(shí)驗(yàn)室鑒定后保存。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

微量生化發(fā)酵管和藥敏試紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;PCR試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，胰蛋白酶、酵母提取物（OXOID公司），瓊脂干粉（日本BOSHARP公司），SS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），SM緩沖液、LB半固體培養(yǎng)基和雙層瓊脂培養(yǎng)基等由本實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），Centrifuge 5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），SHAKE SCS-24恒溫?fù)u床（上海市離心機(jī)械研究所有限公司），0.22 μm濾器（法國(guó)Millipore公司）。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

無菌操作解剖雞胚，蘸取卵黃液接種到SS培養(yǎng)基上劃線分離，37 ℃下倒置培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，挑選典型菌落，進(jìn)行細(xì)菌純化，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鏡檢

挑取SS培養(yǎng)基上純化的單個(gè)菌落， 37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，得到新鮮對(duì)數(shù)期菌液，涂布于載玻片上，干燥固定后進(jìn)行革蘭染色和鞭毛染色，鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.5 細(xì)菌的生化鑒定

將初步鑒定為沙門菌的菌株劃線接種于SS培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)18 h～24 h，取菌落加入到生理鹽水中制成均勻懸液，比濁度在0.5～0.65個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?。將制備好的?xì)菌懸液接種于各種生化反應(yīng)管中，37 ℃下培養(yǎng)24 h～48 h。根據(jù)生化管說明書記錄試驗(yàn)結(jié)果。參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB4789.4-2016）判斷結(jié)果。

1.6 細(xì)菌的PCR鑒定

取細(xì)菌菌液提取DNA，利用雞白痢沙門菌特異性引物對(duì)疑似沙門菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。以雞白痢沙門菌rfbS基因在第237位和第598位堿基的差異，設(shè)計(jì)特異性PCR引物。上游引物：5-TGCCTATCAGAGTATTAGTGT-3，下游引物：5-TATTCACGAATTGATATATCCT-3。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃，10 min;94 ℃ 30s，50 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 細(xì)菌的耐藥性分析

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）[臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI），2011]，根據(jù)CLSI推薦方法進(jìn)行操作，在無菌條件下，吸取0.2 mL滴度為5×108 CFU/mL 經(jīng)鑒定的沙門菌菌液，滴入LB瓊脂平皿中，涂布均勻，以保證細(xì)菌在平皿表面均勻分布，蓋上皿蓋，室溫下放置3 min～5 min，使培養(yǎng)基表面的水分吸收掉，用無菌鑷子將10種藥敏紙片貼于平皿中，37 ℃下培養(yǎng)18 h～24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。根據(jù)CLSI（2011）標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感（S）、中介（I）和耐藥（R），分析病原菌的耐藥譜。

1.8 細(xì)菌噬菌體的篩選

以雞白痢沙門菌分離株為宿主菌，挑取復(fù)蘇的單菌落，制備細(xì)菌懸液備用。取細(xì)菌分離相應(yīng)的孵化場(chǎng)的污水放入雞白痢沙門菌懸液各500 μL，混勻后37 ℃下浸泡6 h，用無菌紗布濾去多余雜質(zhì)，經(jīng)10 000 r/min離心15 min，將上清經(jīng)0.22 μm濾器過濾。取200 μL濾液與200 μL對(duì)數(shù)期的宿主菌混勻，37 ℃下孵育5 min，混合液與5 mL上層瓊脂培養(yǎng)基充分混勻后迅速鋪到瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)3 h～4 h，觀察有無噬菌斑出現(xiàn)。

摳取噬菌斑于盛有1 mL生理鹽水的EP管中，40 ℃水浴30 min。浸出液10 000 r/min離心5 min，將上清用LB肉湯進(jìn)行10倍稀釋至合適的稀釋度，雙層平板法得到單個(gè)噬菌斑。重復(fù)3～5次直至獲得大小和形態(tài)一致的噬菌斑。

1.9 細(xì)菌噬菌體的效價(jià)測(cè)定

將100 μL培養(yǎng)好的噬菌體液進(jìn)行不同梯度的稀釋，稀釋到合適濃度后將200 μL噬菌體與200 μL的宿主菌混勻，37 ℃下孵育5 min。將上述混合液加入50 ℃左右的上層中，混合均勻倒入下層平板中。待上層凝固后倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h～6 h后，記錄噬菌斑數(shù)量，計(jì)算噬菌體效價(jià)。

1.10 噬菌體對(duì)分離菌株的體外裂解作用

選取敏感噬菌體WFSp1進(jìn)行體外裂解測(cè)定。分別吸取200 μL噬菌體增殖液和細(xì)菌懸液（銀杏對(duì)照組加200 μL菌液和? ?200 μL LB肉湯），于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中180 r/min 37 ℃下振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基渾濁情況，并每隔20 min檢測(cè)培養(yǎng)液的OD600 nm變化，并通過雙層平板法檢測(cè)噬菌體增殖液的效價(jià)。

1.11 噬菌體WFSp1的形態(tài)觀察

將滴度為2.5×1011 PFU/mL的噬菌體純化液滴到覆有Foumovar膜的銅網(wǎng)上， 10 min～15 min后濾紙吸去余液，再滴加一滴2%的磷鎢酸負(fù)染5 min～10 min，濾紙吸去余液，室溫晾干，JEM-1011透射電鏡下觀察并拍照。

2? 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果

從濰坊市某種雞場(chǎng)孵化室的死胚中分離到1株細(xì)菌，命名為WF-1。在SS培養(yǎng)基上得到形態(tài)邊緣整齊，稍隆起，表面光滑濕潤(rùn)，有金屬光澤的黑色菌落，培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，結(jié)果見圖1。鏡檢結(jié)果為革蘭陰性，單個(gè)或成對(duì)排列，粗短、兩端鈍圓的小桿菌（比大腸桿菌細(xì)），結(jié)果見圖2。經(jīng)過鞭毛染色后，鏡檢觀察到細(xì)長(zhǎng)成束的鞭毛，結(jié)果見圖3。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

將SS培養(yǎng)基上分離到的典型或可疑菌落分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后分別接種于三糖鐵瓊脂（TSI）斜面和HBI沙門菌生化鑒定條進(jìn)行培養(yǎng)。通過試驗(yàn)鑒定，初步認(rèn)為WF-1為沙門菌，具體結(jié)果見表1。

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

以分離株WF-1的細(xì)菌基因組DNA為模板，利用雞白痢沙門菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期400 bp大小一致的片段，確定分離菌株WF-1為雞白痢沙門菌，結(jié)果見圖4。

2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2列出了雞白痢分離株WF-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，與沙門菌對(duì)照株YN-1相比，分離株WF-1對(duì)臨床常用抗生素氟苯尼考、阿奇霉素、大觀霉素、林可霉素、阿莫西林、多西環(huán)素和新霉素均產(chǎn)生耐藥性。

2.5 細(xì)菌噬菌體的篩選純化

以雞白痢沙門菌WF-1為宿主菌進(jìn)行噬菌體篩選。挑取噬菌斑，經(jīng)過4代分離純化后，噬菌體在雙層平板上形成直徑5 mm左右、規(guī)則透明的噬菌斑，并伴有暈圈，結(jié)果見圖5。

2.6 噬菌體效價(jià)的測(cè)定

將Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Sp5和WFSp1共6株噬菌體裂解液進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用雙層瓊脂平板法將噬菌體培養(yǎng)12 h，在平板上均形成形態(tài)規(guī)則、大小一致的噬菌斑，從中選取噬菌斑數(shù)在30～300個(gè)的平板，計(jì)算噬菌體的效價(jià)，并記錄結(jié)果，結(jié)果見表3。

2.7 噬菌體WFSp1對(duì)WF-1分離株的體外裂解分析

將分離的噬菌體WFSp1和WF-1混合，振蕩培養(yǎng)160 min后，發(fā)現(xiàn)噬菌體和細(xì)菌混合的培養(yǎng)基液體變清亮，搖動(dòng)可見細(xì)微的細(xì)菌碎片，對(duì)照組培養(yǎng)基液體渾濁。噬菌體WFSp1對(duì)WF-1的體外裂解OD600 nm結(jié)果見圖6。OD600 nm變化顯示，兩組混合液中0～ 100 min細(xì)菌濃度不斷增高，100 min～? ? 140 min WFSp1+WF-1組菌液濃度開始下降，140 min～160 min WFSp1+WF-1組菌液濃度接近0，同時(shí)陰性對(duì)照組菌液濃度持續(xù)增高。由此可知WF-1被噬菌體WFSp1于? 160 min內(nèi)完全裂解，測(cè)得增殖后噬菌體的效價(jià)為2.5×1011 PFU/mL。

2.8 噬菌體WFSp1的形態(tài)觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)噬菌體WFSp1屬于有尾噬菌體目短尾病毒科，二十面體結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖7。

3? 討論

雞白痢沙門菌引起的傳染性疾病可水平傳播和垂直傳播，并且可在雞群中持續(xù)循環(huán)感染。種雞感染后，雞場(chǎng)若不及時(shí)采取措施，不僅會(huì)影響種雞生產(chǎn)，還會(huì)影響種蛋的孵化率，提高雛雞的病死率，給養(yǎng)雞業(yè)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。很多發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，如西歐、美國(guó)、加拿大、澳大利亞和日本，已經(jīng)實(shí)施并完成了雞白痢的凈化工作，但是在發(fā)展中國(guó)家，雞白痢仍然流行和蔓延。雞白痢沙門菌對(duì)抗菌藥耐藥性日益嚴(yán)重，隨著耐藥范圍擴(kuò)大和耐藥水平增高已成為影響全球公共衛(wèi)生安全的重要問題[11-13]。噬菌體特異性強(qiáng)，能自我復(fù)制，專一性強(qiáng)，源于自然，對(duì)環(huán)境及動(dòng)物機(jī)體友好，具有殺死耐藥性細(xì)菌的功能，已有報(bào)道用噬菌體在臨床上治療耐藥性細(xì)菌感染[4-5，10]。噬菌體將在禁抗、限抗、無抗的政策中發(fā)揮防治細(xì)菌性疾病的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，目前普遍認(rèn)為其是一種作為新型替代抗生素的生物制劑。

4? 結(jié)論

本研究針對(duì)從濰坊市某種雞場(chǎng)分離到的雞白痢沙門菌進(jìn)行自場(chǎng)噬菌體篩選，并測(cè)定其對(duì)分離噬菌體的敏感性，體外裂解試驗(yàn)顯示噬菌體WFSp1在160 min內(nèi)可以完全裂解雞白痢沙門菌WF-1，且裂解后噬菌體WFSp1效價(jià)高達(dá)2.5×1011 PFU/mL。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)FSp1對(duì)WF-1的裂解效果敏感高效，在臨床應(yīng)用中是否能發(fā)揮同樣的作用需要進(jìn)一步細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u(píng)估。在沙門菌耐藥性日益嚴(yán)重的情況下，期望噬菌體療法能夠在沙門菌的防控中發(fā)揮積極作用。

參考文獻(xiàn)

[1] ARORA D，KUMAR S，JINDAL N，et al. Prevalence and epidemiology of Salmonella enterica serovar Gallinarum from poultry in some parts of Haryana，India[J]. Vet World，2015，8（11）：1300-1304.

[2] GUPTA S，JINDAL N，KHOKHAR R S，et al. Individual and combined effects of ochratoxin A and Salmonella enterica serovar Gallinarum infection on pathological changes in broiler chickens[J]. Avian Pathol，2008，37（3）：265-272.

[3] ATLAS R，MALOY S. One Health and Food-Borne Disease[M]. Washington D C：ASM Press，2014：137-148

[4] ROHWER F，SEGALL A M. In retrospect：a century of phage lessons[J]. Nature，2015，528：46–48.

[5] WTTZANY G. Viruses： Essential Agents of Life[M]. Dordrecht：Springer，2012：61-81

[6] SALMOND G P，F(xiàn)INERAN P C. A century of the phage：past，present and future[J]. Nat Rev Microbiol，2015，13（12）：777-786.

[7] KORTRIGHT K E，CHAN B K，KOFF J L，et al. Phage therapy：a renewed approach to combat antibiotic-resistant bacteria[J]. Cell Host Microbe，2019，25（2）：219-232.

[8] HAJAM I A，KIM J，LEE J H. Oral immunization with a novel attenuated Salmonella Gallinarum encoding infectious bronchitis virus spike protein induces protective immune responses against fowl typhoid and infectious bronchitis in chickens[J]. Vet Res，2018，49（1）：91.

[9] AHIWALE S S，BANKAR A V，TAGUNDE S N，et al. Isolation and characterization of a rare waterborne lytic phage of Salmonella enterica serovar Paratyphi B[J]. Can J Microbiol，2013，59（5）：318-323.

[10] AHMADI M，KARIMI TORSHIZI M A，RAHIMI S，et al. Prophylactic bacteriophage administration more effective than post-infection administration in reducing Salmonella enterica serovar enteritidis shedding in quail[J]. Front Microbiol，2016，7：1253.

[11] BISWAS S，BRUNEL J M，DUBUS J C，et al. Colistin：an update on the antibiotic of the 21st century[J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2012，10（8）：917-934.

[12] 劉志科，楊寧寧，徐錦鳳，等.雞白痢沙門菌病原的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，44（9）：2792-2800.

[13] 周盼伊. 《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017-2020年）》提出六大行動(dòng)[J]. 中國(guó)動(dòng)物保健，2017，19（10）：2-3.