范寧波 張瑞娜 路曉崇 宋朝鵬 鄒宇航 鐘秋 鄒聰明

摘要：為明確雪茄在晾制過程中煙葉顏色変化機(jī)理，以德雪7號(hào)上部葉為試驗(yàn)材料，研究了雪茄煙葉晾制過程中變色期的顏色參數(shù)（Z、a、b、C、Hパ、Hの、水分指標(biāo)（含水量、水活度）、膜脂過氧化（O2、H2O2、MDA）程度及抗氧化酶（SOD、POD、APX）活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明，煙葉在色過程中，葉片正面與背面的顏色參數(shù)變化趨勢(shì)一致;隨著晾制的進(jìn)行，煙葉中的水分逐漸散失，且主脈中的水分散失速率低于葉片中的水分散失速率煙葉中活性氧物質(zhì)（O2、HO2）和MDA含量逐漸增加抗氧化酶活性均有較大的變化，酶活性的変化規(guī)律略有不同：SOD和POD活性先增加后降低，APX的活性卻一直降低。相關(guān)分析表明，水分指標(biāo)、膜脂氧化程度、抗氧化酶活性與顏色參數(shù)之間相關(guān)性均較好。

關(guān)鍵詞：雪茄;顏色;水分;膜脂氧化

雪茄是一種特殊的煙制品，其香氣濃郁，吃味濃，勁頭大，是國內(nèi)目前高度重視發(fā)展的煙草類型。不同于烤煙在調(diào)制過程中需要避免掛灰、雜色等棕色化反應(yīng)的特點(diǎn)剛，在雪茄煙葉調(diào)制過程中，棕色化反應(yīng)是改變煙葉內(nèi)在品質(zhì)和外觀顏色的關(guān)鍵步驟4。雪茄在變色的過程中，會(huì)產(chǎn)生吡喃、叱嗪、叱咯、吡啶類等雜環(huán)化合物，對(duì)煙草的香吃味和風(fēng)格形成起著重要的作用。因此，研究雪茄煙葉在調(diào)制過程中的顏色變化對(duì)雪茄的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，煙葉顏色的變化與含水量和細(xì)胞膜脂的氧化程度密切相關(guān)，煙葉在調(diào)制過程中，由于發(fā)生水分的散失等生理活動(dòng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被逐漸破壞，細(xì)胞膜逐漸皺縮、破裂，細(xì)胞膜脂被逐漸氧化。膜脂在被氧化的過程中，會(huì)逐漸產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，O2和H2O2的含量會(huì)逐漸增加;

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂氧化的最終產(chǎn)物，其含量常被用來衡量細(xì)胞膜的破裂程度2。當(dāng)細(xì)胞破裂時(shí)，內(nèi)容物滲出，相互之間發(fā)生反應(yīng)，

造成煙葉的褐變。植物為了消除活性氧物質(zhì)和DA的毒害作用，進(jìn)化出了一系列對(duì)抗機(jī)制：超氧化物化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）等是生物細(xì)胞中消除膜脂氧化影響的最重要的抗氧化酶14。當(dāng)發(fā)生褐變反應(yīng)時(shí)，為了消除有毒物質(zhì)的影響，細(xì)胞中的活性氧清除酶系統(tǒng)紛紛啟動(dòng)。目前關(guān)于煙葉在調(diào)制過程中的顏色變化，多集中于烤煙中，而對(duì)雪茄的關(guān)注尚有欠缺。因此本文對(duì)雪茄在調(diào)制過程中最重要的時(shí)期一変色期進(jìn)行了重點(diǎn)關(guān)注，研究了煙葉參數(shù)、水分、膜脂氧化程度和抗氧化酶活性的變化，以及雪茄顏色変化與煙葉水分含量和細(xì)胞膜脂氧化之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)顏色變化的內(nèi)在原因，為雪茄煙葉的變色理論奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018-2019年在四川省什邡市師古鎮(zhèn)大泉坑村雪茄煙葉生產(chǎn)基地進(jìn)行，供試品種為德雪7號(hào)。試驗(yàn)田土壤有機(jī)質(zhì)含量13.01gkg，速效鉀含量89mgkg，速效磷含量38.1mgkg，速效氮含量120mg/kg，按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行統(tǒng)一管理。選取大小、成熟度（適熟）致的上部葉（15～17葉位）采收并進(jìn)行晾制。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采收的煙葉置于恒溫恒濕箱（HWS型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）中進(jìn)行晾制，參照四川雪茄調(diào)制技術(shù)參數(shù)進(jìn)行溫濕度參數(shù)設(shè)置（第0～2天為萎蔫期，此時(shí)不進(jìn)行人工干預(yù);第3～7天為色期：溫度26℃，濕度控制在95%左右，直至煙葉變褐完成）。在晾制的第0（鮮煙葉）、1、4、5、6、7天，固定選取代表性葉片3片測(cè)定顏色參數(shù)。同時(shí)另取葉片測(cè)定水分指標(biāo)，并取煙葉中間位置的葉片（注意避開脈），迅速轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫冰箱中保存，用于生理指標(biāo)的測(cè)定。所有指標(biāo)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1煙葉顏色參數(shù)使用HP-C210精密色差儀

（深圳漢譜光彩科技有限公司），分別測(cè)量葉片正面和背面的顏色參數(shù)亮度值、紅綠值'和黃藍(lán)值b，并計(jì)算飽和度C、色相角、色澤比H。參照文獻(xiàn)11?的測(cè)定方法，每片煙葉測(cè)量6個(gè)位點(diǎn)并取其平均值。計(jì)算公式為：色澤比（Hの=ab";色相角（の）=arctan（b'a），飽和度（C）=a2+b2。

1.3.2煙葉中水分指標(biāo)的測(cè)定每次取3片煙葉，將煙葉主脈與葉片分離，采用烘箱法分別測(cè)定主脈和葉片的含水量，計(jì)算整葉含水量取3片煙葉，利用10mm打孔器分別在每片煙葉的葉尖、葉中和葉基部快速打孔40片，平均放入4個(gè)樣品皿中，利用HD-6型水分活度測(cè)量?jī)x（無錫市華科儀器儀表有限公司）進(jìn)行葉片水活度的測(cè)定;將煙葉的主脈按長(zhǎng)度平均分成4段，置于樣品皿中測(cè)定主脈的水活度。

1.3.3活性氧物質(zhì)（O2、H2O2）和丙二醛（MDA）

含量測(cè)定超氧陰離子自由基（O2）產(chǎn)生速率和H2O2含量的測(cè)定分別按照試劑盒說明書（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測(cè)定。以每分鐘每克新鮮組織催化羥胺生成NaNO2的物質(zhì)的量表示O2產(chǎn)生速率，結(jié)果以mmol（gmin）表示;H2O2的含量以每克新鮮組織含有的H2O2物質(zhì)的量表示，結(jié)果以u(píng)mol/g表示;并采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量，結(jié)果以molg表示。

1.3.4抗氧化活性測(cè)定超氧化物岐化酶（SOD過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX活性均按照SOD、POD、APX酶試劑盒說明書（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測(cè)定。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)取樣重復(fù)3次，通過SPSS2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)并使用Excel2010進(jìn)行圖表的繪制。

2結(jié)果

2.1雪茄在晾制過程中水分含量的變化

煙葉的調(diào)制過程是水分散失的過程2，在煙葉的變色過程中，葉片和主脈水分含量呈逐漸降低趨勢(shì)（圖1）。但主脈中的水分含量一直高于葉片中的，失水速率也低于葉片的。至煙葉變色完成時(shí)，葉片的水分為25.61%，而主脈中的水分為65.74%。

水活度與含水量密切相關(guān)，可用于樣品含水量的無損快速測(cè)定。進(jìn)一步用水活度計(jì)測(cè)定煙葉的水活度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙葉的水活度變化規(guī)律和含水量變化一致，依然呈逐漸降低的趨勢(shì)且主脈的水活度一直遠(yuǎn)高于葉片的水活度。

2.2雪茄在晾制過程中葉片顏色的變化

由圖2可見，雪茄煙葉在晾制過程中，伴隨著煙葉含水量的逐漸減少，葉片逐漸皺縮，其顏色由綠色變黃再褐。煙葉在還沒有完全變黃時(shí)，葉尖已經(jīng)略有變褐，且煙葉在褐的過程中，是從葉尖向上，自葉緣向內(nèi)化。進(jìn)一步將顏色參數(shù)進(jìn)行量化，發(fā)現(xiàn)顏色參數(shù)的變化與圖片的変化趨勢(shì)一致（圖3）。

由圖3可見，晾制過程中煙葉正面與背面的顏色參數(shù)化趨勢(shì)基本一致。亮度值和黃藍(lán)值b從晾制的第1天時(shí)即快速增大，并在晾制的第3天時(shí)達(dá)到了最大值，之后又迅速下降，直至低于初始值（0d）。在変色的過程中，葉片背面的"值一直大于正面的值，而背面的め值一直小于正面的b值。與"值和值先増大后小的変化規(guī)律不同，a值在煙葉調(diào)制過程中一直保持著增加的趨勢(shì)，在晾制的前期，'值的增加速率緩慢，幾乎無変化，且正面的a"值和背面的"值之間的差別也不大;隨著調(diào)制時(shí)間的增加，'值從晾制的第3天開始迅速增加，晾制5d之后，增加速率又逐漸降低?？傮w上，a"值的增加速率呈慢快-慢的趨勢(shì)。

煙葉在變色過程中正面與背面的飽和度C值化規(guī)律也一致晾制前期保持一直增加的趨勢(shì)，并在晾制的第3天達(dá)到最大值，之后又迅速下降，在變色完成后，其C值遠(yuǎn)小于晾制初期時(shí)煙葉的C值色澤比隨晾制過程的推進(jìn)而逐漸增加，增加速率較為穩(wěn)定，逐漸由負(fù)值變?yōu)檎?。色相角在晾制的?d為負(fù)值并逐漸下降，并在第4天時(shí)達(dá)到最低值，之后又突然增加并在第5天時(shí)變?yōu)檎抵笥致杂薪档偷廊槐３譃檎怠?/p>

2.3雪茄在晾制過程中膜脂氧化程度的變化

由圖4可以看出，隨著晾制時(shí)間的增長(zhǎng)，煙葉的O2產(chǎn)生速率呈上升趨勢(shì)。在晾制的前2d，O2的產(chǎn)生速率增加得較為緩慢，從晾制的第3天開始，O2產(chǎn)生速率迅速增加，并且直到變色完成一直保持著顯著加的趨勢(shì)。変色完成時(shí)，與晾制第0天相比，O2產(chǎn)生速率増加了1.57倍。

煙葉的H2O2含量與O2產(chǎn)生速率的變化趨勢(shì)一致，隨著調(diào)制時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在晾制的前2d，HO2含量增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，伴隨著晾制時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2的含量一直維持著顯著增加的趨勢(shì)。在晾制的第7天時(shí)，H2O2含量達(dá)到了17.02umolg，與第0天時(shí)的504umol/g相比，含量增加了2.38倍。

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的毒性2。由圖4可見，煙葉中的MDA含量呈逐漸增加的趨勢(shì)，且增加速率也是逐漸上升的，在晾制的前2d，MDA含量的增加速率相對(duì)較為緩慢，在晾制的第3天到第7天時(shí)，MDA含量迅速增加，表明煙葉在變褐的過程中細(xì)胞膜脂過氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致MDA大量積累，加劇了褐變的發(fā)生。

2.4雪茄在晾制過程中內(nèi)源抗氧化酶活性的變化

由圖5可以看出，在煙葉的調(diào)制過程中，SOD和POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并都在晾制的第3天達(dá)到最大值，之后活性迅速降低，在晾制的第7天達(dá)到最低值，與晾制開始時(shí)相比，此時(shí)這兩種抗氧化酶的活性分別降低了47.24%和36.82%。與SOD和POD的変化規(guī)律不同，抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性自晾制開始即開始下降，與第0天時(shí)的酶活性相比，至晾制的第7天時(shí)，APX的活性下降了75.89%，其下降幅度大于SOD和POD。

2.5煙葉晾制過程中顏色參數(shù)與煙葉水分、膜脂氧化程度和抗氧化酶活性之間的相關(guān)分析

由表1可知，煙葉正面、背面的亮度值與SOD、POD活性均具有極顯著正相關(guān)關(guān)系;煙葉正面、背面的紅綠值a與葉片和主脈的水分含量以及APX活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與活性氧物質(zhì)和MDA含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;煙葉正面、背面的黃藍(lán)值與SOD、POD活性具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，煙葉背面的b值與葉片的含水量以及APX活性均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與活性氧物質(zhì)、MDA之間均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;煙葉正面、背面的飽和度C與煙葉中的水分含量和抗氧化酶活性之間均呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，與活性氧物質(zhì)和MDA之間均呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系;煙葉正面、背面的色澤比H與煙葉中的水分含量和APX活性之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與活性氧物質(zhì)和MDA之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;煙葉正面、背面的色相角與煙葉中的水分和抗氧化酶活性均呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，與活性氧物質(zhì)和MDA含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3討論

雪茄在調(diào)制過程中發(fā)生的一系列生理變化，最直觀的是顏色的變化：由綠色變?yōu)辄S色，最終被氧化為褐色。由綠變黃主要是由于葉綠素的降解而褐變則主要是因?yàn)榧?xì)胞破裂，酚類物質(zhì)滲出，被氧化成醌類物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)生聚合反應(yīng)而生成“類黑精”，外觀上表現(xiàn)為煙葉表面顏色的加深。色差計(jì)可以方便快捷地將顏色量化，在煙葉的調(diào)制過程中被廣泛使用。本研究結(jié)果表明，煙葉在晾制過程中煙葉正面與背面各顏色參數(shù)變化趨勢(shì)基本致，且晾制前期煙葉（亮度值）、a"（紅綠值）、b”（黃藍(lán)值）逐漸增加，表明此時(shí)煙葉主要由較為暗沉的綠色轉(zhuǎn)變?yōu)槊髁恋狞S色。、b"在第3天達(dá)到最大值后，又逐漸下降，符合此時(shí)煙葉逐漸變褐的規(guī)律，這與高婭北等的研究結(jié)果一致。水分的存在是煙葉中各種保持活性狀態(tài)的前提，而水分的散失會(huì)造成細(xì)胞的損傷。在本文的研究中，隨著時(shí)間的推移，煙葉中的水分減少，結(jié)合數(shù)據(jù)分析，我們可以認(rèn)為煙葉的顏色化與水分含量之間關(guān)系密切。

當(dāng)煙葉逐漸脫水時(shí)，細(xì)胞膜脂的氧化作用增強(qiáng)，細(xì)胞區(qū)室化作用被打破，導(dǎo)致葉綠體等細(xì)胞器被破壞2，這可能是水分影響煙葉顏色變化的內(nèi)在原因。研究發(fā)現(xiàn)，褐變與細(xì)胞膜脂的氧化密切相關(guān)，而SOD、POD、APX是生物細(xì)胞中消除膜脂氧化影響的最重要的抗氧化酶?；钚匝醯姆e累是引起膜脂過氧化作用的主要原因，在本研究中，隨著晾制時(shí)間的增加，煙葉中活性氧物質(zhì)（O2、H1O2）和MDA的含量增加，這與黃山等24在烤煙調(diào)制過程中的研究結(jié)果一致。伴隨著活性氧的積累，抗氧化酶活性將會(huì)發(fā)生変化，以清除多余的活性氧2。本研究表明，SOD和POD活力在変色前期不斷增強(qiáng)并逐步達(dá)到高峰，可最大程度清除活性氧，減輕細(xì)胞的氧化傷害;伴隨著調(diào)制時(shí)間的增加，細(xì)胞氧化程度加劇，酶活力降低，不能及時(shí)有效地清除活性氧，導(dǎo)致活性氧物質(zhì)在煙葉細(xì)胞中大量積累。APX也是植物中重要的抗氧化酶，在本研究中，其活性自晾制開始時(shí)即一直降低，變化規(guī)律與SOD和POD略有不同，然而在變色完成之后，這3種抗氧化酶仍然保持著較高的活性，這可能與雪茄的調(diào)制環(huán)境較溫和，適合酶的存活有關(guān)。另外，本文的數(shù)據(jù)分析表明，抗氧化酶活性和活性氧物質(zhì)的含量與煙葉的顏色形成之間具有較為緊密的聯(lián)系。

4結(jié)論

在雪茄煙葉的晾制過程中，煙葉的水分含量降低，細(xì)胞膜脂氧化程度加劇，抗氧化酶系統(tǒng)啟動(dòng)以清除細(xì)胞中的有毒物質(zhì)。相關(guān)分析表明，在雪茄煙葉的晾制過程中，其顏色參數(shù)與水分變化和膜脂氧化程度之間相關(guān)性明顯，這表明煙葉顏色的變化與水分散失和膜脂氧化密切相關(guān)。

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