張偉理永霞劉振凱高夢鴿孟繁麗張星耀

（1.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)新技術研究所，北京 100091；2.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210037）

松材線蟲病（Pine wilt disease）即松樹萎蔫病，是以松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus為病原[1]，墨天牛屬昆蟲Monochamusspp.為主要媒介[2]，綜合人為參與、寄主松樹、相關伴生菌和環(huán)境因素互作的一種復雜病害系統(tǒng)[3-4]。該病于20 世紀80 年代初傳入我國境內(nèi)，隨后迅速擴散蔓延。根據(jù)國家林業(yè)局公告（2019 年第 4 號），2019 年我國大陸地區(qū)松材線蟲發(fā)病區(qū)已經(jīng)擴張至18 個省市自治區(qū)的531 個區(qū)縣，對我國松林生態(tài)系統(tǒng)構成嚴重威脅。松材線蟲的生活史可分為繁殖型周期和擴散型周期[2，5]。在適宜的環(huán)境下，松材線蟲進入繁殖型周期（egg、L1、L2、L3、L4和 adult），種群數(shù)量不斷增加，造成松樹發(fā)病死亡。在不良環(huán)境條件下，松材線蟲進入擴散型周期即滯育型周期，包括擴散型三齡幼蟲（DL3）和擴散型四齡幼蟲（Dauer，DL4）兩個階段[6]。當松墨天牛Monochamus alternatus的蛹羽化為成蟲時，擴散型三齡幼蟲被誘導形成擴散型四齡幼蟲，進入松墨天牛體內(nèi)[7-9]。擴散型四齡幼蟲口針退化不取食，依靠消耗體內(nèi)能量運動[8]。天牛成蟲羽化后取食健康松樹時，擴散型四齡幼蟲轉移至健康松樹，并在松樹體內(nèi)適宜的環(huán)境條件下解除滯育，轉型并發(fā)育為成蟲，進入繁殖周期開始大量繁殖危害松樹[10]。因此，松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲的轉型是其完成危害松樹生活史的重要環(huán)節(jié)。

松材線蟲在擴散型四齡幼蟲階段完成了從病死松樹進入天牛成蟲以及從天牛成蟲進入健康松樹的傳播過程[8]。目前對于松材線蟲擴散型四齡幼蟲的研究表明，松材線蟲擴散型四齡幼蟲與繁殖型幼蟲相比較會發(fā)生生理和結構上的特異性變化，例如松材線蟲擴散型四齡幼蟲的表皮增厚、生殖腺發(fā)育停滯、脂滴增加、口針退化等以利于度過不良環(huán)境[8，11-12]。松材線蟲擴散型四齡幼蟲是擴散型三齡幼蟲在天牛分泌的脂肪酸乙酯促進下發(fā)育形成的，并且發(fā)現(xiàn)松材線蟲Insulin 信號通路的daf-16和 daf-12 基因上調(diào)表達參與此過程[8，13]。而擴散型四齡松材線蟲能夠受到天牛分泌的蛔甙（ascarosides）吸引從而進入天牛，伴隨天牛取食健康松樹進行傳播[9]。松材線蟲擴散型四齡幼蟲除了可以受到天牛的吸引以外，還可以受到松樹化學物質(zhì)的吸引，在傳播媒介天牛取食健康松樹的新鮮樹葉過程中轉移至健康松樹中[14]。松材線蟲擴散型四齡幼蟲在接觸松樹之后，如黑松Pinus thunbergii、赤松Pinus densiflora、五針松Pinus parviflora、落葉松Larix leptolepis和雪松Cedrus deodara等，均可以促進松材線蟲向成蟲的轉型，而無松樹刺激則轉型不明顯[6]。另外，研究表明松樹揮發(fā)物單萜類α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-月桂烯和檸檬烯均可以促進松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲的轉型[15]。然而，目前關于松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型過程的研究尚不多見，其他樹種對于松材線蟲轉型的影響也未見報道。

綜上所述，筆者以松材線蟲病防治關鍵齡期擴散型四齡幼蟲為研究對象，通過光學顯微鏡觀察了松材線蟲DL4 轉型的形態(tài)結構變化過程，以及油紅染色后的脂肪特征變化，分析了松科植物對于轉型過程的影響，為闡明松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型的作用機理奠定基礎，也為松材線蟲病的科學防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 擴散型四齡松材線蟲收集 解剖松墨天牛獲得擴散型四齡松材線蟲。為了保證擴散型四齡松材線蟲的蟲態(tài)一致性，于4—8 月天牛羽化高峰期，在浙江和廣東等省松材線蟲病發(fā)生區(qū)的松林中懸掛誘捕器（杭州費洛蒙生物科技有限公司），收集松墨天牛，將松墨天牛肢解在含有無菌水的培養(yǎng)皿中，放置2 h。待松材線蟲從松墨天牛氣管中游出后，用移液器吸出移至新的無菌水培養(yǎng)皿中。將收集到的擴散型四齡松材線蟲放入4 ℃冰箱待用。

1.2 擴散型四齡松材線蟲轉型過程形態(tài)觀察 在直徑35 mm 培養(yǎng)皿中，加入4 mL 無菌水，放置1 塊5 mm×5 mm 的馬尾松木片作為誘導物，加入100頭擴散型四齡松材線蟲。每隔12 h 觀察1 次線蟲狀態(tài)，并拍照（CZX51 and BX51，Olympus，Japan）。

1.3 擴散型四齡松材線蟲轉型過程油紅染色 采用油紅對轉型過程中的擴散型四齡松材線蟲進行染色。配制0.01 g/mL 的油紅溶液（Sigma，USA），溶劑為乙醇，配制完成后震蕩混勻2 min，經(jīng)過0.22 μm的過濾器過濾，保存于4 ℃冰箱待用。使用時，將配制完成的油紅溶液再次過濾，室溫放置10 min，取100 μL于1.5 mL 離心管中，加入等體積的上述不同轉型時期的松材線蟲，染色12 ～16 h 后，將線蟲置于水中，挑取相應轉型時期線蟲觀察、拍照。

1.4 多種松科植物對擴散型四齡松材線蟲轉型的影響 在天牛羽化高峰期選擇銀杏Ginkgo biloba、紅豆杉Taxus chinensis、圓柏 Sabina chinensis、側柏Platycladus orientalis、雪松 Cedrus atlantica、油松Pinus tabuliformis、黑松和馬尾松 P.massoniana 的枝條，測試不同植物對于松材線蟲擴散型四齡幼蟲轉型的影響。在35 mm 培養(yǎng)皿中，加入4 mL 無菌水，放置1 塊5 mm ×5 mm 的植物枝條作為誘導物，對照未加任何植物枝條，加入30 頭擴散型四齡松材線蟲，2 d 后觀察轉型為成蟲的數(shù)量，并計算轉型率。試驗重復3 次。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0 中的單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)值為平均數(shù)±標準誤。

2 結果與分析

2.1 擴散型四齡松材線蟲向成蟲轉型過程形態(tài)

在馬尾松木片誘導下，松材線蟲擴散型四齡幼蟲可在36 ～48 h 完成轉型。整個轉型過程可劃分為5個階段，包括擴散型四齡（DL4）、轉型前期（TP）、轉型中期（TM）、轉型后期（TA）和轉型末期（TT）。松材線蟲DL4 階段，頭部鈍圓，無溢縮，尾巴尖，無性別特征；TP 階段，線蟲呈現(xiàn)豎直狀態(tài)，輕微擺動，可見頭部蛻皮，出現(xiàn)口溢縮，尾部膨大；TM 階段，蛻皮明顯，線蟲開始彎曲，出現(xiàn)性別特征，但是不顯著；TA 階段，進一步完成蛻皮，線蟲成蟲狀態(tài)表現(xiàn)明顯，雌蟲出現(xiàn)陰門蓋，雄蟲出現(xiàn)交合刺；TT 階段完成蛻皮（圖1）。

圖1 松材線蟲擴散型四齡向成蟲轉型過程顯微鏡觀察Fig.1 Transformation process of B.xylophilus DL4 observed by microscope

2.2 擴散型四齡松材線蟲向成蟲轉型過程脂肪染色觀察 DL4 階段脂肪多且密集，染色較深，說明整體含量很高；頭部顏色較淺，脂肪含量較少，腹部和尾部顏色較重，脂肪含量較高。TP 階段脂肪含量迅速下降，僅有頭部、尾部有區(qū)域化脂肪染色，但無明顯顆粒感，而腹部和體壁內(nèi)側仍然存在少量的脂肪。TM 階段，頭部脂肪顆粒消失，腹部體壁內(nèi)側和尾部仍有少量脂肪存在。TA 階段，雌蟲頭部脂肪顆粒消失，其他部位均有脂肪存在；而雄蟲頭部和尾部均無脂肪顆粒染色，僅有蟲體中間部分有脂肪存在。TT 階段與TA 階段相似，但是TT 階段松材線蟲表現(xiàn)出明顯的脂肪顆粒感，且頭部出現(xiàn)較弱的個別脂肪顆粒（圖2）。另外，松材線蟲擴散型四齡幼蟲有一部分不能完成轉型，形態(tài)上依然保持DL4 階段形態(tài)，但是體內(nèi)脂肪顆粒大量減少，被消耗殆盡（圖2，DL4 UT）。

圖2 松材線蟲擴散型四齡向成蟲轉型過程脂肪染色顯微鏡觀察Fig.2 Lipid status during transformation process of B. xylophilus DL4 observed by microscope

2.3 多種松科植物對擴散型四齡松材線蟲轉型的影響 非松科植物銀杏對松材線蟲轉型沒有影響，與空白對照組接近，松材線蟲轉型率約為13%。松科植物對松材線蟲擴散型四齡幼蟲轉型均有顯著的促進作用，紅豆杉和雪松促進下松材線蟲擴散型四齡幼蟲的轉型率約為30%，而圓柏、側柏和油松促進轉型更為明顯，在其刺激下，松材線蟲擴散型四齡幼蟲的轉型率約為55%，促進效果最為顯著的為黑松和馬尾松，在其刺激下，松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型的轉型率達到了80%以上。測試的松科植物中，雪松、油松、黑松和馬尾松為已知的松材線蟲寄主（圖3）。

圖3 多種松科植物對擴散型四齡松材線蟲轉型的促進作用Fig.3 Promotion of Pinidae trees to B.xylophilus DL4 transformation

3 結論與討論

松材線蟲由擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型是其危害松樹的關鍵步驟，筆者觀察并定義了松材線蟲轉型過程的5 個階段，分別為DL4、轉型前期（TP）、轉型中期（TM）、轉型后期（TA）和轉型末期（TT）。發(fā)現(xiàn)轉型過程中脂肪含量在DL4 階段含量很高，但是在TP 階段即發(fā)生了大部分的轉化，而后各個階段脂肪含量相對較少。選用的松科植物紅豆杉、圓柏、側柏、雪松、油松、黑松和馬尾松均促進DL4 的轉型且效果明顯，其中以黑松和馬尾松木塊刺激下松材線蟲轉型率最高，而非松科植物銀杏無轉型促進效果。該研究為進一步探明松材線蟲由擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型的分子及調(diào)控機制奠定基礎，同時也為松材線蟲的科學防治提供新的思路和理論基礎。

前人僅對松材線蟲擴散型四齡幼蟲與成蟲進行比較研究，發(fā)現(xiàn)松材線蟲擴散型四齡幼蟲的表皮增厚、生殖腺發(fā)育停滯、脂滴增加、口針退化等以利于度過不良環(huán)境，并未對線蟲轉型的動態(tài)過程進行深入研究[8，11-12]。筆者以松材線蟲擴散型四齡幼蟲為研究對象，通過光學顯微鏡觀察了松材線蟲擴散型四齡幼蟲轉型的形態(tài)結構變化，更加深入了解其變化過程。

與繁殖型幼蟲相比，擴散型幼蟲的體內(nèi)脂肪含量會增加，以利于其抵抗干燥、高溫或者食物短缺等不良環(huán)境[16-18]。例如秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans 當環(huán)境不利時，如食物缺乏、種群密度增加、溫度升高等，C.elegans 形成類似于松材線蟲擴散型的dauer 幼蟲[16]。該階段C.elegans 幼蟲進入滯育期，不再進食且身體結構特化，如身體輻射狀縊縮、口被內(nèi)部形成的栓所封閉、表皮形成特化的脊、體內(nèi)脂肪粒增多等，可以抵御不良外界環(huán)境。當外界環(huán)境恢復有利條件時，如充足的食物、稀疏的種群密度和溫和的溫度等，dauer 幼蟲會轉型進入繁殖周期。松材線蟲擴散型四齡幼蟲與繁殖型相比較，其腸道和皮下存在大量脂滴，其中包含一些高電子密度物質(zhì)[11]，我們的研究也表明DL4 階段含有大量脂肪。另外，松材線蟲擴散型四齡幼蟲有一部分不能完成轉型，形態(tài)上依然保持DL4 階段形態(tài)，但是體內(nèi)脂肪顆粒大量減少，被消耗殆盡。這些不轉型的擴散型松材線蟲可能未接收到轉型啟動信號不能轉型，但是線蟲一直處于運動狀態(tài)，需要不斷消耗脂肪維持能量供給，因此脂肪被消耗掉。

在不同松科植物刺激條件下，松材線蟲能夠迅速完成轉型，發(fā)育為成蟲。非松科植物銀杏對松材線蟲轉型沒有影響，而松科植物對松材線蟲擴散型四齡幼蟲轉型均有顯著的促進作用，其中以黑松和馬尾松促進效果最為顯著。前人研究也表明松材線蟲擴散型四齡幼蟲在接觸松樹之后，黑松、赤松、五針松、落葉松和雪松等均可以促進松材線蟲向成蟲的轉型，而無松樹刺激則轉型不明顯[6]。另外，松樹揮發(fā)物單萜類α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-月桂烯和檸檬烯均可以促進松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲的轉型[15]。由此，可以推測松科植物促進松材線蟲擴散性四齡幼蟲轉型與其含有的萜烯類物質(zhì)有關。

萜烯類物質(zhì)促進松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型，其機理目前尚不清楚。在 C.elegans 的dauer 轉型過程中，當遇到環(huán)境信號（食物、溫度和密度等）刺激時，細胞膜上的G-蛋白偶聯(lián)化感受體與配體化學分子結合，啟動鳥苷酸環(huán)化酶途徑，導致神經(jīng)元細胞內(nèi)環(huán)磷鳥嘌呤核苷（cGMP）濃度升高，激活cGMP-門控離子通道，將胞外信號傳遞進入胞內(nèi)，激活 Insulin 和 TGF- β 通路的信號分子[19]。這些信號分子在內(nèi)分泌細胞表面與各自受體結合，分別啟動相應通路信號轉導。最終兩條信號通路共同調(diào)控daf-9 的表達，產(chǎn)生的DA 與靶組織DAF-12 結合后，促進繁殖發(fā)育，抑制dauer 形成。相反，當DA 含量下降時，空載核受體DAF-12則促進dauer 形成，抑制繁殖發(fā)育[20]。研究表明，松材線蟲擴散型四齡幼蟲是由擴散型三齡幼蟲在天牛分泌的脂肪酸乙酯的促進下發(fā)育形成的，并且發(fā)現(xiàn)松材線蟲Insulin 信號通路的daf-16 和daf-12 基因上調(diào)表達參與此過程[8，13]。因此，C.elegans 的dauer 形成因素及基因表達調(diào)控為進一步研究松材線蟲擴散型四齡幼蟲向成蟲轉型的機制提供了良好的理論基礎，也為松材線蟲的科學防治提供新的思路。