李秀玲，劉寶鎖，劉 波，張 楠，朱克誠(chéng)，郭 梁，郭華陽，江世貴，張殿昌

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510300； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300 )

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)是一種肉食性魚類，主要捕食浮游動(dòng)物、小型甲殼類、貝殼類和魚類等[1]。魚肉質(zhì)鮮美，生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，為優(yōu)質(zhì)的海水食用魚類[2]。近年來，在中國(guó)和東南亞的一些國(guó)家，例如新加坡和馬來西亞等國(guó)家對(duì)卵形鯧鲹的商業(yè)化養(yǎng)殖不斷增加[3-4]。

腸道內(nèi)棲息著數(shù)以萬計(jì)的微生物，這些微生物有助于宿主的生長(zhǎng)、消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、抵抗疾病和免疫調(diào)節(jié)等[5-6]。脂肪是三大營(yíng)養(yǎng)素之一，在提供能量、必需脂肪酸和磷脂等方面發(fā)揮著重要作用[7]。許多研究表明，脂肪源可以影響腸道微生物的組成和多樣性，而微生物也會(huì)參與脂質(zhì)代謝。在哺乳動(dòng)物中，腸道微生物參與脂質(zhì)代謝，包括膽汁酸合成[8]、能量動(dòng)態(tài)平衡[9]和脂質(zhì)存儲(chǔ)等。在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)中，飼料中的脂肪酸主要通過改變腸道微生物的分布影響其生長(zhǎng)和免疫[10]。在斑馬魚(Daniorerio)中，腸道微生物調(diào)節(jié)腸道吸收和脂肪酸的代謝[11]。目前關(guān)于不同脂肪源對(duì)腸道微生物影響的研究還比較少，考慮到脂肪源和腸道微生物的關(guān)系及對(duì)宿主的影響，因此探究不同脂肪源對(duì)卵形鯧鲹腸道菌群的影響是非常有必要的。

腸道微生物的研究大體經(jīng)歷了3個(gè)階段，培養(yǎng)依賴的方法階段，非培養(yǎng)依賴的傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法階段和基于測(cè)序的高通量組學(xué)方法階段[12]。傳統(tǒng)培養(yǎng)的方式只能檢測(cè)到約1%～10%的微生物群落，這種方法雖然能夠快速有效地自環(huán)境樣品中提取大部分脂肪酸，但受人為因素干擾強(qiáng)烈[13]，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。高通量測(cè)序技術(shù)能夠?yàn)榭焖贉?zhǔn)確的基因組測(cè)序提供平臺(tái)，大大降低了成本、時(shí)間[14]，已經(jīng)成為微生物多樣性研究的主要方法[15-16]。本研究基于16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，旨在探討不同脂肪源對(duì)卵形鯧鲹腸道微生物菌群的影響，以期能夠?yàn)槁研析K鲹確定合適的脂肪源和健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

共配制8種等氮等能的飼料，除脂肪源不同其他飼料原料和用量都相同，8種脂肪源分別為魚油、磷蝦油、豆油、玉米油、1∶1魚油—豆油、1∶1魚油—玉米油、1∶1磷蝦油—豆油和1∶1磷蝦油—玉米油。飼料配方見表1，試驗(yàn)飼料脂肪酸組成見表2。所有飼料原料過40目篩，原料混勻后依次加入脂肪源和水，經(jīng)過制粒機(jī)(華南理工大學(xué))制成2.5 mm的沉性飼料顆粒，密封于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

640尾規(guī)格均一、體質(zhì)健康的卵形鯧鲹[體質(zhì)量(82.85±2.36) g]采自中國(guó)南海水產(chǎn)研究所海南熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，隨機(jī)放入32個(gè)1.0 m×1.0 m×1.5 m網(wǎng)箱中，每個(gè)網(wǎng)箱20尾魚，隨機(jī)分成8組，每組4個(gè)平行，分別投喂8組試驗(yàn)飼料。飼養(yǎng)8周，日飽食投喂2次(7:00,16:00)。試驗(yàn)期間，鹽度約35，海水溫度27～31 ℃，pH 7.5～8.2，溶解氧>5 mg/L。

1.3 樣品采集和DNA提取

試驗(yàn)結(jié)束后，將魚饑餓24 h，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)挑選3尾卵形鯧鲹，在低溫下解剖取出腸道樣品，剔除脂肪組織，放入液氮后于-80 ℃保存。

按照天根DNA試劑盒[天根(北京)生化科技有限公司]說明書提取卵形鯧鲹腸道細(xì)菌總DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，利用Nanodrop2000檢測(cè)DNA的含量。

表1 試驗(yàn)飼料原料及營(yíng)養(yǎng)組成(干質(zhì)量) %Tab.1 Ingredients and proximate composition of the experimental diets (dry weight)

注：1.預(yù)混料(聯(lián)鯤生物科技有限公司)為每千克日糧提供維生素、微量元素和抗氧化劑: 維生素A(375 000 IU) 119.81 mg，維生素D3(77 000 IU) 1.925 mg，維生素E 3000 mg，維生素K3930 mg，維生素B1600 mg，維生素B2600 mg，葉酸 185 mg, 維生素D 7.5 mg, 肌醇 4500 mg, 鋅 1750 mg, 錳 1100 mg, 銅 410 mg, 鐵 1300 mg, 鈷 60 mg, 碘 50 mg, 硒 15 mg. Premix (Guangzhou Nutriera Biotechnology Co, Ltd) provides vitamins, trace elements and antioxidants per kg diet: vitamin A (375 000 IU) 119.81 mg, vitamin D3(77 000 IU) 1.925 mg, vitamin E 3000 mg, vitamin K3930 mg, vitamin B1600 mg, vitamin B2600 mg, folic acid 185 mg, vitamin D 7.5 mg, inositol 4500 mg, zinc 1750 mg, manganese 1100 mg, copper 410 mg, Fe 1300 mg,Co 60 mg, I 500 mg, and Se 15 mg.

2.營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值. Nutritional level is measured.

表2 試驗(yàn)飼料脂肪酸組成 g/kgTab.2 Fatty acid composition of the experimental diets

1.4 PCR擴(kuò)增

用515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和907R:5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′引物對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4～V5可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。PCR采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：10 μL的5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)、4 μL的dNTP Mixture (2.5 mmol/L)、0.5 μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase、1 μL的正向引物(5 μmol/L)，1 μL的反向引物(5 μmol/L) 和10 ng 的DNA模板、ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)27次；72 ℃延伸5 min。使用AxyPrepTMDNA 凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，在本試驗(yàn)中30 ng的PCR純化產(chǎn)物用來進(jìn)行基于illumina平臺(tái)的高通量測(cè)序。

1.5 序列分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode序列和引物序列，對(duì)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)。Raw Tags經(jīng)過濾操作，去掉低質(zhì)量、不符合長(zhǎng)度的Tag以及嵌合體，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)。

得到Tags數(shù)據(jù)后，一方面對(duì)每個(gè)運(yùn)算分類單元的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況。另一方面，對(duì)運(yùn)算分類單元進(jìn)行豐度、Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析，得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息，獲得不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異信息。

利用QIIME (v1.7.0)計(jì)算Alpha多樣性(ACE指數(shù)、chao1指數(shù)、香農(nóng)—威納指數(shù)、辛普森指數(shù))指數(shù)和Beta多樣性(主坐標(biāo)分析和主成分分析)，利用R軟件(v2.15.3)繪制稀釋曲線。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若差異達(dá)到顯著水平，則采用Tukey′s進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 序列分析

經(jīng)過組裝、質(zhì)量篩選和修飾后，在卵形鯧鲹腸道中共獲得1 087 662個(gè)序列，每個(gè)樣品平均獲得45 319個(gè)序列(2 998～58 918)。在所有試驗(yàn)組中，運(yùn)算分類單元稀釋曲線趨于平緩，表明測(cè)序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種(圖1)。

圖1 卵形鯧鲹腸道微生物稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of intestinal microbiota in golden pompano T. ovatus

2.2 Alpha多樣性分析

卵形鯧鲹腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)見表3。Chao1和ACE指數(shù)反映群落豐富度，數(shù)值越大，表明群落的豐富度越高。香農(nóng)—威納指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)反映群落的多樣性，數(shù)值越大，表明群落的多樣性越高。Alpha多樣性結(jié)果顯示,磷蝦油組的ACE和Chao1指數(shù)顯著高于1∶1磷蝦油—玉米油組(P<0.05)，其他組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。香農(nóng)—威納指數(shù)在1∶1魚油—豆油組中顯著高于豆油和1∶1磷蝦油—玉米油組(P<0.05)。辛普森多樣性指數(shù)在磷蝦油、1∶1魚油—豆油和1∶1磷蝦油—豆油組中顯著高于豆油和1∶1磷蝦油—玉米油組 (P<0.05)，其他組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 卵形鯧鲹腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)Tab.3 Intestinal microbial Alpha diversity index in golden pompano T. ovatus

注：同行數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Note: means with different letters in the same line are significant difference (P<0.05).

2.3 腸道菌群組成及其相對(duì)豐度分析

腸道菌群在卵形鯧鲹中的組成見圖2。在所有組中的腸道菌群中注釋到4個(gè)門水平上的菌群，包括擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和軟壁菌門，變形菌門豐度最高。在魚油組、磷蝦油組、玉米油組、1∶1魚油—豆油組、1∶1磷蝦油—豆油組和1∶1磷蝦油—玉米油組組中變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，在豆油組和1∶1魚油—玉米油組中軟壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌群。

圖2 卵形鯧鲹腸道微生物在門水平上的相對(duì)豐度聚類堆疊圖Fig.2 Bacterial relative abundance in intestine of gdden powpano T. ovatus at the Phylum level

2.4 Beta多樣性分析

主坐標(biāo)分析是將進(jìn)化結(jié)構(gòu)中聚類相近的物種組合在一起，聚在一起的樣品是物種進(jìn)化程度方面較為類似的樣品。主成分分析是將分布較為類似的物種組合在一起，聚在一起的樣品是在物種組成方面較為類似的樣品。卵形鯧鲹腸道微生物主坐標(biāo)分析結(jié)果(圖3)表明，在卵形鯧鲹腸道中微生物沒有聚集，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且受脂肪源影響較大。卵形鯧鲹腸道微生物主成分分析結(jié)果(圖4)表明，不同組間距離較遠(yuǎn)脂肪源對(duì)卵形鯧鲹腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響，組間物種組成方面差異較大。

圖3 卵形鯧鲹腸道微生物主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal co-ordinates analysis of intestinal microbiota in golden pompano T. ovatus

圖4 卵形鯧鲹腸道微生物主成分分析Fig.4 Principal component analysis of intestinal microbiota in golden pompano T. ovatus

3 討 論

由于腸道微生物在宿主營(yíng)養(yǎng)吸收和分解中起著重要的作用[18-19]，因此腸道微生物和宿主的關(guān)系越來越受到關(guān)注。Han等[20]發(fā)現(xiàn)，腸道微生物來源于環(huán)境，且受遺傳背景和食物等因素的影響?；谀c道微生物在脂肪的吸收和分解方面發(fā)揮的重要作用，本研究利用Illuniana 16S rDNA高通量測(cè)序分析不同脂肪源對(duì)卵形鯧鲹腸道菌群的影響。

3.1 Alpha多樣性和Beta多樣性分析

本研究主要采用Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析對(duì)卵形鯧鲹腸道微生物群落進(jìn)行分析。Alpha多樣性反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，Alpha多樣性指數(shù)包括菌群豐度(Chao1、ACE指數(shù)和運(yùn)算分類單元)和菌群多樣性(香農(nóng)—威納指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù))。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中脂肪源類型能夠調(diào)節(jié)腸道微生物的多樣性和豐富度。磷蝦油含有豐富的n-3多不飽和脂肪酸，包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸[21-22]，并且在抗氧化、抗高血脂等方面起著關(guān)鍵作用。得益于磷蝦油產(chǎn)生的有益影響，磷蝦油組腸道中更有利于微生物的聚集；同時(shí)，由于磷蝦油組中的豐富n-3多不飽和脂肪酸，腸道微生物尤其是變形菌可能更有助于對(duì)其分解利用。1∶1磷蝦油—玉米油是磷蝦油和玉米油的混合物，玉米油富含豐富的n-6和n-9多不飽和脂肪酸，磷蝦油和玉米油的混合物使得腸道內(nèi)微生物的豐富度和多樣性顯著下降，這可能說明兩者的混合物不利于腸道微生物的生存。

3.2 腸道菌群組成及其相對(duì)豐度分析

測(cè)序結(jié)果表明，在卵形鯧鲹腸道中主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和軟壁菌門4種菌群，且變形菌是優(yōu)勢(shì)菌群，這與許多研究結(jié)果是一致的[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，變形菌在斑馬魚[25]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[26]和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[21]等魚類中是優(yōu)勢(shì)菌群，而擬桿菌門、厚壁菌門在人和小鼠腸道中是優(yōu)勢(shì)菌群。在不同研究中，不同物種的腸道微生物的組成和豐度確實(shí)存在很大差異，這可能與物種種類和環(huán)境有關(guān)。在本試驗(yàn)中，8組飼料除脂肪源種類不同外其他原料組成都是相同的，因此脂肪源種類是決定優(yōu)勢(shì)菌群的主要因素。擬桿菌的主要功能是幫助宿主降解碳水化合物(尤其是多糖)、蛋白質(zhì)和其他物質(zhì),以提高宿主的營(yíng)養(yǎng)利用率，厚壁菌有助于膳食纖維的降解,并將纖維降解為揮發(fā)性脂肪酸以供宿主利用[27]。本研究結(jié)果表明，豆油和1∶1魚油—玉米油有益于軟壁菌的生長(zhǎng)，而其他脂肪源有益于變形菌的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，中國(guó)沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)水域中變形菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌[28]，這表明，卵形鯧鲹腸道微生物組成與水體微生物組成有很大的相似性。在本研究中，變形菌和軟壁菌可能與脂肪酸代謝有關(guān)。從脂肪酸組成來看，豆油和1∶1魚油—玉米油組含有中等水平的單不飽和脂肪酸，推測(cè)可能中等水平的單不飽和脂肪酸有利于軟壁菌的生長(zhǎng)，而軟壁菌可能有利于其代謝。關(guān)于微生物與脂肪源種類之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步探討。

3.3 主坐標(biāo)分析和主成分分析

主坐標(biāo)分析和主成分分析表明，脂肪源顯著影響腸道菌群，且不同脂肪源之間腸道菌落構(gòu)成差異顯著，表明脂肪源在調(diào)節(jié)腸道菌群中發(fā)揮著重要的作用。有研究顯示，食物來源和宿主的發(fā)育系統(tǒng)是導(dǎo)致腸道微生物菌群差異的兩個(gè)重要因素[29-30]，在本試驗(yàn)中飼料成分可能是導(dǎo)致腸道菌群差異的最重要因素。由主坐標(biāo)分析和主成分分析圖可見，1∶1魚油—玉米油組和1∶1磷蝦油—玉米油組聚在一起，這表明兩組在物種進(jìn)化方面和物種組成方面較為類似，這可能與飼料中的多不飽和脂肪酸含量和種類有關(guān)。

利用16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)卵形鯧鲹腸道微生物多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，飼喂磷蝦油和1∶1磷蝦油—豆油的魚具有較高的腸道微生物多樣性，且不同脂肪源對(duì)腸道微生物多樣性影響顯著，這些結(jié)果對(duì)促進(jìn)卵形鯧鲹生長(zhǎng)和確定合適脂肪源具有重要的指導(dǎo)意義。