王 穎，宋 明，張錦華，周秋白，張正洲，王自蕊，楊竹青

( 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045 )

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖強(qiáng)度的日益增加和規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，抗生素濫用的情況也愈發(fā)嚴(yán)重，導(dǎo)致水源和水產(chǎn)品中抗生素殘留量大幅上升，最終危害人類(lèi)健康。微生態(tài)制劑作為一種新型綠色的飼料添加劑，既能調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)，還可改善養(yǎng)殖水體的水質(zhì)條件，使用方便、健康無(wú)藥物殘留[1-3]，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)。對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)[4]、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[5]、中華鱉(Pelodiscussinensis)[6]、羅非魚(yú)(Oreochromis)[7]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[8]等的研究表明，添加微生態(tài)活菌制劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能，但合理使用微生態(tài)制劑還缺乏足夠的科學(xué)依據(jù)，在飼料加工中添加微生態(tài)制劑經(jīng)過(guò)膨化制粒后對(duì)草魚(yú)生產(chǎn)性能是否有影響還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸菌以及酵母菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較為廣泛的3類(lèi)菌種，對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育等有著積極作用[9-11]。本試驗(yàn)采用該3類(lèi)菌種復(fù)配(8.0×109cfu/g)，以麩皮為載體加工制成微生態(tài)制劑添加于草魚(yú)膨化飼料中喂養(yǎng)草魚(yú)，分析在飼料中添加微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)、腸道消化酶、腸道組織學(xué)以及腸道菌群的變化情況，本研究還提出一個(gè)比較直觀，且簡(jiǎn)單易行的“腸伸展率”指標(biāo)來(lái)判別腸道的質(zhì)量，旨在為草魚(yú)綠色飼料生產(chǎn)提供參考依據(jù)，促進(jìn)草魚(yú)養(yǎng)殖提質(zhì)增效。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)分3組。第1組為基礎(chǔ)飼料(對(duì)照組)，在滿足草魚(yú)基本營(yíng)養(yǎng)需求的前提下，配制基礎(chǔ)飼料；試驗(yàn)2、試驗(yàn)3組分別向基礎(chǔ)飼料中添加0.5%、2%的微生態(tài)制劑。微生態(tài)制劑由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candidautilis)和乳酸桿菌(Lactobacillus)復(fù)配，麩皮為載體，由廣東佛山市順德區(qū)健坤生物科技有限公司定制發(fā)酵加工而成；試驗(yàn)飼料預(yù)混料的單體原料由江西大佑農(nóng)生物科技有限公司提供；大宗飼料原料由江西格力特水產(chǎn)飼料有限公司提供；草魚(yú)膨化顆粒飼料由江西格力特水產(chǎn)飼料有限公司代加工，飼料粒徑2.0 mm。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

試驗(yàn)用草魚(yú)購(gòu)自九江市水產(chǎn)研究所，為長(zhǎng)江四大家魚(yú)原種場(chǎng)原種草魚(yú)F1代。

1.2 方法

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選體質(zhì)好、規(guī)格均勻的草魚(yú)1260尾[平均體質(zhì)量為(110.23±0.43) g]，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)平行，每個(gè)平行70尾，分別放入18個(gè)3.0 m×2.0 m×1.2 m加蓋網(wǎng)箱中。試驗(yàn)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，養(yǎng)殖水溫為自然水溫25～30 ℃。養(yǎng)殖時(shí)間為60 d。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %Tab.1 Ingredients and nutrient level in theexperiment diets (DM basis)

注： 1.預(yù)混料為每千克飼料提供The premix provides the followings per kg of diet： 維生素A VA 5 000 IU，維生素B1VB125 mg，維生素B2VB245 mg，維生素B6VB620 mg，維生素B12VB120.1 mg，維生素K3VK310 mg，維生素E VE 200 mg，維生素C VC 200 mg，維生素D3VD32 500 IU，肌醇 inositol 200 mg，泛酸鈣Calcium pantothenate 60 mg，煙酸 nicotinic acid 200 mg，葉酸 folic acid 10 mg，生物素 biotin 1.5 mg，氯化膽堿 choline chloride 2 500 mg，亞硒酸鈉NaSeO3·5H2O 0.3 mg，氯化鈷CoCl2·6H2O 0.4 mg，碘化鉀KI 0.8 mg，硫酸銅CuSO4·5H2O 10 mg，硫酸錳MnSO4·4H2O 20 mg，硫酸鋅ZnSO4·H2O 50 mg，硫酸亞鐵FeSO4·7H2O 150 mg，硫酸鎂MgSO4·7H2O 500 mg，氯化鈉NaCl 1 000 mg，亞磷酸鈣Ca(H2PO3)212 450 mg. 2.實(shí)測(cè)值 Measured values.

1.3 樣本采集與處理

養(yǎng)殖結(jié)束饑餓24 h，稱(chēng)量各網(wǎng)箱內(nèi)草魚(yú)總體質(zhì)量，計(jì)算其終末均質(zhì)量、質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率以及飼料系數(shù)等。從每個(gè)網(wǎng)箱中取6尾規(guī)格接近的試驗(yàn)草魚(yú)，測(cè)定其體質(zhì)量、去內(nèi)臟質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、內(nèi)臟質(zhì)量、體長(zhǎng)、腸長(zhǎng)等，計(jì)算其肥滿度、肝體比、臟體比、空殼率、腸伸展率等。其中3根腸道用于測(cè)定腸伸展率(腸伸展率是指腸道拉伸至斷裂為止的拉升長(zhǎng)度與原始長(zhǎng)度的比值。腸伸展率越大，表明腸道發(fā)育越好，肌層發(fā)達(dá)，損傷小)。另3根取其中腸做組織切片，蘇木精—伊紅染色，觀察其消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)。取草魚(yú)前腸、中腸、后腸測(cè)其相應(yīng)的消化酶活性，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

計(jì)算公式如下：

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

飼料系數(shù)=mf/(mt-m0)

質(zhì)量增加率/%=(mt-m0)/m0×100%

肥滿度=100mt/Lt3

臟體比/%=mv/mt×100%

肝體比/%=mh/mt×100%

空殼率/%=(me/mt)×100%

腸伸展率=Le/LI

式中，mt為終末均質(zhì)量(g)；m0為初始均質(zhì)量(g)；mf為平均飼料攝入量(g)；t為飼喂天數(shù)(d)；mh為肝臟質(zhì)量(g)；mv為內(nèi)臟質(zhì)量(g)；me為去內(nèi)臟質(zhì)量；Lt為體長(zhǎng)(cm)；Le為腸拉伸長(zhǎng)；LI為初始腸長(zhǎng)。

腸道菌群樣品的采集：投喂試驗(yàn)飼料6 h后，無(wú)菌解剖草魚(yú)，取其腸道內(nèi)容物于無(wú)菌的EP管中，放入液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存。之后每組選取部分樣本將其送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA的V3+V4區(qū)高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在單因素方差分析的基礎(chǔ)上，再用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，菌群分析采用t檢驗(yàn)，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

高通量測(cè)序所獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的序列，整理后的剩余高質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理用于后期分析。采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)匹配細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，區(qū)分樣本后，將樣品序列聚類(lèi)，基于運(yùn)算分類(lèi)單元(OTU)在97%相似水平下分析樣品的測(cè)序深度。利用香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)公式計(jì)算細(xì)菌多樣性指數(shù)，利用Chao指數(shù)公式計(jì)算細(xì)菌豐富度指數(shù)。并在各個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)每組樣品的群落組成和差異。通過(guò)PICRUSt對(duì)運(yùn)算分類(lèi)單元豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后通過(guò)每個(gè)運(yùn)算分類(lèi)單元對(duì)應(yīng)的green gene id，獲得運(yùn)算分類(lèi)單元對(duì)應(yīng)的同源蛋白簇(COG)家族信息并計(jì)算各同源蛋白簇的豐度來(lái)進(jìn)行16S功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

3個(gè)試驗(yàn)組草魚(yú)體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率、質(zhì)量增加率以及空殼率隨著微生態(tài)制劑添加量的增加而增加，對(duì)照組與0.5%添加組差異不顯著(P>0.05)，2%添加組顯著高于對(duì)照組和0.5%添加組(P<0.05)；飼料系數(shù)隨著微生態(tài)制劑添加量的增加逐漸降低，2%添加組顯著低于對(duì)照組和0.5%添加組(P<0.05)。臟體比隨著微生態(tài)制劑添加量的增加逐漸降低，2%添加組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%添加組與對(duì)照組、2%添加組差異不顯著(P>0.05)。肝體比各組之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。

2.2 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道消化酶活性的影響

0.5%添加組草魚(yú)前腸淀粉酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，2%添加組與對(duì)照組、0.5%添加組差異不顯著(P>0.05)；中腸淀粉酶活性隨著微生態(tài)制劑添加量的增加逐漸升高，2%添加組顯著高于對(duì)照組、0.5%添加組(P<0.05)，0.5%添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。3組間草魚(yú)后腸淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)。前腸脂肪酶活性差異不顯著(P>0.05)；2%添加組草魚(yú)中腸脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組和0.5%添加組(P<0.05)，對(duì)照組和0.5%添加組之間差異不顯著(P>0.05)；后腸脂肪酶活性逐漸升高，2%添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%添加組高于對(duì)照組，但和對(duì)照組、2%添加組差異不顯著(P>0.05)。中腸脂肪酶活性最高，前后腸差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表2 飼料中添加不同比例微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)的影響(n=6)Tab.2 The effect of different proportions of dietary probiotics on growth in grass carp (n=6)

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同一行中上標(biāo)不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

Note:values are expressed as mean±SE; means with different superscripts in the same line are significantly different(P<0.05); et sequentia.

表3 飼料中添加不同比例微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道消化酶活性的影響(n=6)Tab.3 The effect of different proportions of dietary probiotics on activities of intestinal digestive enzymes in grass carp (n=6)

2.3 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)中腸的組織結(jié)構(gòu)影響較為明顯。隨著微生態(tài)制劑添加量的增加，草魚(yú)腸伸展率逐漸升高，2%添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%添加組與對(duì)照組、2%添加組差異不顯著(P>0.05)；草魚(yú)肌層厚度逐漸增加，2%添加組顯著高于對(duì)照組、0.5%添加組(P<0.05)，對(duì)照組和0.5%添加組差異不顯著；絨毛長(zhǎng)度逐漸增加，2%添加組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%添加組與對(duì)照組、2%添加組差異不顯著(P>0.05)(表4)。

表4 飼料中添加微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道結(jié)構(gòu)的影響(n=3)Tab.4 The effect of dietary probiotics on the intestinal structure in grass carp (n=3)

2.4 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道微生物菌群多樣性的影響

香農(nóng)曲線趨于平緩，覆蓋率為99.86%～99.92%，說(shuō)明對(duì)草魚(yú)腸道樣本微生物群落的檢測(cè)比率接近飽和，目前的測(cè)序量能覆蓋樣本中的絕大部分物種。對(duì)照組、0.5%和2%添加組數(shù)據(jù)分別可劃分為259、395和428個(gè)運(yùn)算分類(lèi)單元。通過(guò)樣品測(cè)序序列計(jì)算各樣品的多樣性指數(shù)，其中2%添加組的香農(nóng)指數(shù)最大，為2.7288，辛普森指數(shù)最小，為0.1675。對(duì)照組和0.5%添加組的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)差異較小，多樣性相似；通過(guò)樣品測(cè)序序列計(jì)算各樣品的物種豐富度指數(shù)Chao，2%添加組的物種豐富度指數(shù)最大，物種豐富度最高。2%添加組香農(nóng)指數(shù)、豐富度指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%添加組香農(nóng)指數(shù)和豐富度指數(shù)與對(duì)照組、2%添加組差異都不顯著(P>0.05)。2%添加組辛普森指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%添加組與對(duì)照組、2%添加組差異不顯著(P>0.05)。2%添加組的運(yùn)算分類(lèi)單元、多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均最高(表5)。

表5 各組微生物菌群和多樣性指數(shù)(n=3)Tab.5 Bacterial community and diversity index in each group (n=3)

從屬水平上進(jìn)一步分析各個(gè)樣品中菌群多樣性的相互關(guān)系，選取3個(gè)試驗(yàn)組中每組3個(gè)平行樣的并集，并構(gòu)建維恩圖(圖1)。由圖1可知，3組共有屬的數(shù)量為134，分別占這三組腸道樣品全部屬的88.16%、70.53%、66.34%。對(duì)照組與0.5%添加組共有屬較少，而0.5%添加組和2%添加組中共有屬較多，分別占全部屬數(shù)量的22.63%和21.29%。對(duì)照組、0.5%添加組和2%添加組其特有屬數(shù)量分別為4、8和16。

圖1 3組腸道微生物在屬水平上維恩圖Fig.1 Horizontal Venn diagram of the intestinal microorganisms in the three groups at genus level

2.5 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道微生物組成的影響

3種不同處理的草魚(yú)的9個(gè)腸道內(nèi)含物樣品微生物菌落主要由17個(gè)門(mén)組成，合并小于1%的區(qū)域，在門(mén)水平上對(duì)每組樣品的菌群結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，對(duì)照組梭桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)優(yōu)勢(shì)度較高分別占樣本所包含物種的總數(shù)目的63.56%、32.52%，此外變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)分別占1.83%、1.45%；0.5%添加組梭桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)優(yōu)勢(shì)度也較高，分別占樣本所包含物種的61.82%、20.27%，此外變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)分別占9.75%、4.21%和2.66%；2%添加組厚壁菌門(mén)優(yōu)勢(shì)度較高占樣本所包含物種的64.20%，此外變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)分別占9.94%、3.86%、6.14%、5.12%、4.55%和4.50%(圖2)。通過(guò)三元相圖(圖3)分析也可得出，不同組中微生物的組成和分布比例有所不同，2%添加組中厚壁菌門(mén)豐度較高，而對(duì)照組和0.5%添加組梭桿菌門(mén)較高。

從門(mén)水平上對(duì)其進(jìn)行多組、兩組之間差異性檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)2%添加組與對(duì)照組在梭菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、衣原體們、螺旋體菌門(mén)水平上差異顯著(P<0.05)(圖4)。對(duì)照組與0.5%添加組以及0.5%添加組與2%添加組在各門(mén)水平上差異不顯著(P>0.05)，但在對(duì)照組和0.5%添加組之間，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在0.5%添加組和2%添加組之間，厚壁菌門(mén)豐度明顯升高，由20.27%升至64.20%，而梭桿菌門(mén)豐度明顯降低，由61.82%降至3.86%。此外，變形菌門(mén)豐度基本不變，藍(lán)藻菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，在飼料中添加微生態(tài)制劑會(huì)改變草魚(yú)腸道菌群組成，2%添加組在厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)上豐度高于對(duì)照組，在梭桿菌門(mén)豐度低于對(duì)照組；0.5%添加組在變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)上豐度高于對(duì)照組，在厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度低于對(duì)照組。

在屬水平上對(duì)3組樣品的菌群結(jié)構(gòu)及分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，合并小于1%的區(qū)域(圖5)，結(jié)果表明，對(duì)照組和0.5%添加組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為梭桿菌門(mén)的鯨桿菌屬(Cetobacterium)，對(duì)應(yīng)的屬各占各組全部屬的63.31%、61.79%，2%添加組優(yōu)勢(shì)菌屬為厚壁菌門(mén)的Paeniclostridium、Erysipelatoclostridium分別占該組全部屬的25.07%、13.74%，而在2%添加組中鯨桿菌屬的豐度較低，僅為3.83%，在對(duì)照組和0.5%添加組中Paeniclostridium、Erysipelatoclostridium的占也比較低。厚壁菌門(mén)的Dielma在對(duì)照組和0.5%添加組分別占9.04%、11.93%而在2%添加組中僅占2.64%，可進(jìn)一步得出2%添加組的優(yōu)勢(shì)菌屬與對(duì)照組和0.5%添加組存在明顯差異。此外，在0.5%添加組和2%添加組中存在大量未分類(lèi)的其他物種。

圖2 三組腸道微生物在門(mén)水平上的豐度Fig.2 Abundance of intestinal microflora in three groups at phylum level

圖3 三組腸道微生物門(mén)水平上三元相圖Fig.3 Ternary phase diagrams of intestinal microflora in three groups at the phylum level 圖中相同顏色的圓形代表來(lái)自于同一個(gè)門(mén)，圓形面積的大小代表豐度的大小. The circle of the same color represents the same phylum, and the size of the circle represents the size of abundance.

圖4 對(duì)照組和2%添加組腸道微生物門(mén)水平上差異檢驗(yàn)Fig.4 The difference test of intestinal microbial between the control group and the 2% group at phylum level 縱坐標(biāo)表示不同分類(lèi)水平下的物種名，橫坐標(biāo)表示該樣本的某一物種豐度的百分?jǐn)?shù)數(shù)值，不同顏色表示不同分組. *，P<0.05，**, P<0.01，***, P<0.001，下同. The ordinate is the species name at different levels of classification, the abscissa is the percent of a species abundance of the sample, and different colors show different groups. *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001, et sequentia.

再?gòu)膶偎缴喜捎胹tudent′st檢驗(yàn)對(duì)3組樣本兩兩進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明，對(duì)照組和2%添加組在鯨桿菌屬、藍(lán)藻細(xì)菌(norank_c__Cyanobacteria)、norank_f__MNG7、分支桿菌(Mycobacterium)、甲基孢囊菌科細(xì)菌(unclassified_f__Methylocystaceae)之間差異顯著(P<0.05)(圖6)。0.5%添加組和2%添加組在Romboutsia、藍(lán)藻細(xì)菌(norank_c__Cyanobacteria)之間差異顯著(P<0.05)(圖7)。而對(duì)照組和0.5%添加組之間在各屬水平上差異不顯著(P>0.05)，但各屬比例有所差異。2%的微生態(tài)制劑使草魚(yú)腸道優(yōu)勢(shì)菌屬直接發(fā)生改變。

并且隨著微生態(tài)制劑含量的升高，草魚(yú)腸道本身的優(yōu)勢(shì)菌屬——鯨桿菌屬豐度先升高，后大幅下降。

2.6 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道微生物代謝功能的影響

所有樣本主要的同源蛋白簇功能有：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、轉(zhuǎn)錄、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制、修復(fù)、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、防御機(jī)制、細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)等功能。該結(jié)果表明，草魚(yú)樣本中的微生物代謝功能非常豐富(圖8)。

與物種組成相比，所有組樣本的同源蛋白簇功能組成較為相似，涉及代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)的功能均有一定程度的變化。由圖9可知，隨著微生態(tài)制劑含量的升高，無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制、修復(fù)、翻譯等功能的豐度越來(lái)越高，說(shuō)明微生態(tài)制劑可增加腸道微生物的各種功能的豐度，調(diào)節(jié)草魚(yú)的生長(zhǎng)代謝。

3 討 論

3.1 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)生產(chǎn)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加不同比例的微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)的生產(chǎn)性能有一定的促進(jìn)作用，特定生長(zhǎng)率、質(zhì)量增加率以及空殼率均隨微生態(tài)制劑添加量的增加逐漸升高，0.5%添加組和2%添加組質(zhì)量增加率分別比對(duì)照組提高了13.34%和31.73%。Wang[12]在飼料中添加3種微生態(tài)制劑，促進(jìn)了草魚(yú)魚(yú)種的生長(zhǎng)，提高了魚(yú)種成活率。陳玉春等[13]在飼料中添加微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)魚(yú)種有明顯的促生長(zhǎng)作用，并提高魚(yú)種成活率。尹惠霖[14]在飼料中添加納豆芽孢桿菌(B.natto)，促進(jìn)草魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)，提高草魚(yú)幼魚(yú)的特定生長(zhǎng)率和質(zhì)量增加率，增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并在一定范圍內(nèi)，隨納豆芽孢桿菌添加量增加，草魚(yú)幼魚(yú)質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率呈上升趨勢(shì)。此外，在軍曹魚(yú)(Rachycentroncanadum)[15]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[16]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[17]、淇河鯽(Carassiusauratus)[18]、建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)[19]等其他水產(chǎn)動(dòng)物的研究上也得出相似結(jié)果。但本試驗(yàn)從添加微生態(tài)制劑后再膨化制粒的角度去探索其對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)的影響，仍能得到與直接添加微生態(tài)制劑相似的結(jié)果。推測(cè)微生態(tài)制劑的菌種不是影響草魚(yú)生長(zhǎng)的唯一原因，菌種在飼料中所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物可能也是影響草魚(yú)生長(zhǎng)的關(guān)鍵原因。

圖5 3組腸道微生物在屬水平上的豐度Fig.5 Abundance of intestinal flora in 3 groups at genus level

圖6 對(duì)照組和2%添加組腸道微生物屬水平上差異檢驗(yàn)Fig.6 The difference test of intestinal microorganism between the control group and the 2% group at genus level

圖7 0.5%添加組和2%添加組腸道微生物在屬水平上差異檢驗(yàn)Fig.7 The difference test of intestinal microorganism between the 0.5% and 2% groups at genus level

圖8 3組腸道微生物同源蛋白簇功能分類(lèi)預(yù)測(cè)Fig.8 The functional classification prediction of homologous protein clusters of intestinal microorganisms in the three groups

圖9 3組腸道微生物同源蛋白簇功能分類(lèi)柱狀圖Fig.9 The functional classification histogram of homologous protein clusters of intestinal microorganisms in the three groups

3.2 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道消化酶以及腸道組織的影響

本試驗(yàn)中，隨著微生態(tài)制劑添加量的增加，腸伸展率、中腸肌層厚度和絨毛長(zhǎng)度逐漸增加。腸道是魚(yú)類(lèi)重要的消化器官，腸道組織學(xué)和形態(tài)學(xué)指數(shù)在確定攝食與同化之間功能關(guān)系中具有重要作用，腸道絨毛結(jié)構(gòu)的完整與攝食相關(guān)[20]。腸絨毛形態(tài)變化直接影響絨毛的表面積和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[21]，說(shuō)明添加微生態(tài)制劑擴(kuò)大草魚(yú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的有效區(qū)域，增加草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收效率。黃燦等[22]報(bào)道，枯草芽孢桿菌可修復(fù)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)造成的草魚(yú)腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，對(duì)維持腸道的正常形態(tài)與功能起到了重要的作用。邱燕[23]研究表明，在草魚(yú)飼料中添加枯草芽孢桿菌或酵母培養(yǎng)物，隨添加量的增加，各試驗(yàn)組肌層厚度、微絨毛高度、淀粉酶均高于基礎(chǔ)組，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究引入一個(gè)評(píng)價(jià)腸道質(zhì)量的新指標(biāo)——腸伸展率，添加微生態(tài)制劑后腸伸展率有顯著的提高，表明草魚(yú)消化道結(jié)構(gòu)更好、厚薄更均勻，腸道更富有彈性，有利于蠕動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)飼料在草魚(yú)腸道中消化吸收。而腸道中消化酶的活性直接關(guān)系著動(dòng)物的消化吸收能力，間接影響了動(dòng)物的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生許多消化酶，對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化均有促進(jìn)作用[24]。王子彥等[25]用芽孢桿菌飼喂鯉魚(yú)后，腸道淀粉酶活性比對(duì)照組提高3.82倍。本試驗(yàn)中草魚(yú)中腸淀粉酶和脂肪酶活力隨微生態(tài)制劑添加量的增加而升高，2%添加組顯著高于對(duì)照組和0.5%添加組，這與已有報(bào)道一致。

3.3 微生態(tài)制劑對(duì)草魚(yú)腸道菌群的影響

腸道內(nèi)正常的微生物菌群能促進(jìn)魚(yú)類(lèi)消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)魚(yú)類(lèi)的免疫功能，維持其機(jī)體的健康[26]。機(jī)體的飲食影響?hù)~(yú)類(lèi)腸道菌群的數(shù)目和種類(lèi)[27]。在本試驗(yàn)中2%添加組草魚(yú)腸道菌群豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)以及菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照組間存在較大差異。0.5%添加組與對(duì)照組差異不顯著，其原因可能是0.5%添加量較少，還不足以引起顯著差異。維恩圖顯示，3組草魚(yú)腸道的核心菌群相似。對(duì)照組主要由梭桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)以及擬桿菌門(mén)組成，與Wu等[28]研究結(jié)果類(lèi)似。本試驗(yàn)中，隨著微生態(tài)制劑添加量的增加，梭桿菌門(mén)豐度持續(xù)下降。Koren等[29]認(rèn)為，梭桿菌門(mén)中的一些成員與低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇的含量呈正相關(guān)。推測(cè)梭桿菌門(mén)相對(duì)豐度的降低可能會(huì)促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂類(lèi)的利用。在屬水平上，2%添加組鯨桿菌屬豐度由63.31%降至3.83%，李東亮[30]研究得出，易感染腎致病菌草魚(yú)腸道鯨桿菌屬豐度增加，這為本研究提供了一個(gè)反證，提示鯨桿菌屬相對(duì)豐度的降低可提高機(jī)體免疫力。本研究中，草魚(yú)腸道菌群中厚壁菌門(mén)的豐度先降后升，但其中的Paeniclostridium和Erysipelatoclostridium豐度大幅上升。這兩個(gè)菌屬在水產(chǎn)上的相關(guān)研究較少，Nguyen等[31]發(fā)現(xiàn)，PaeniclostridiumsordelliiATCC9714T能產(chǎn)丁酸。而Erysipelotrichaceae通常被認(rèn)為是丁酸的產(chǎn)生菌[32]。在飼料中添加適宜量的丁酸鈉可提高草魚(yú)特定生長(zhǎng)率和飼料效率，使腸道更健康，各種消化酶活力升高[33]。丁酸也可為機(jī)體上皮生長(zhǎng)提供能量，改善腸道屏障功能以及保護(hù)機(jī)體免患結(jié)腸疾病[34]。Pozuelo等[32]發(fā)現(xiàn)，健康人腸道內(nèi)Erysipelotrichaceae相對(duì)豐度更高，而腸道易激綜合征患者Erysipelotrichaceae相對(duì)豐度減少，可能是由其產(chǎn)生的丁酸含量較少，使上皮的通透性增加。Woting[35]研究表明，Clostridiumramosum的存在與小腸葡萄糖和脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)，且可以改善飼料效率。Yutin等[36]將Clostridiumramosum重新分類(lèi)到Erysipelotrichaceae科的Erysipelatclostridium屬。因此，可推斷在本研究中Erysipelatoclostridium相對(duì)豐度的增加可能在機(jī)體體內(nèi)丁酸的產(chǎn)生以及葡萄糖和脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。2%添加組藍(lán)藻細(xì)菌和分支桿菌的相對(duì)豐度較高，藍(lán)藻細(xì)菌可在一定程度上改善水質(zhì)，而分支桿菌和鯨桿菌屬其具體作用機(jī)理在水生動(dòng)物研究較少，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)使用的復(fù)合微生態(tài)制劑中的3種菌在草魚(yú)腸道菌群中均未發(fā)現(xiàn)，或豐度較低，推測(cè)可能是飼料膨化過(guò)程中菌均被殺死，主要起作用的是菌的發(fā)酵產(chǎn)物。在本試驗(yàn)中，隨微生態(tài)制劑添加量增加，“能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換”、“碳水化合物運(yùn)輸與代謝”、“氨基酸運(yùn)輸與代謝”、“脂質(zhì)運(yùn)輸與代謝”等相關(guān)代謝功能的豐度有所增加。Wu等[37]研究結(jié)果也顯示，在正常草魚(yú)腸道菌群中上述功能相關(guān)的腸道微生物占主導(dǎo)地位，并且草魚(yú)的腸道微生物群在碳水化合物的轉(zhuǎn)化和發(fā)酵中起作用，可為機(jī)體及其自身提供能量。推測(cè)本試驗(yàn)微生態(tài)制劑的添加可使草魚(yú)腸道菌群朝更健康的方向變化。