張澤偉，段偉文，陳 銘，鄧楚津，劉書成,2,3,4，吉宏武,2,3,4

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/ 2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/ 3.廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心/4.水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

小龍蝦，學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），自1929 年引入我國后，被大范圍推廣養(yǎng)殖。2016 年，我國已是全世界最大小龍蝦生產(chǎn)國，其加工產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時也遇到了諸多問題[1-2]。與其他冷藏水產(chǎn)品相比，小龍蝦含有較多自由氨基酸，致使其更容易遭受微生物作用而腐敗變質(zhì)，貨架期較短，成為限制小龍蝦產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的主要障礙[3]。如何有效地殺滅小龍蝦產(chǎn)品中腐敗菌，前人已有相關(guān)殺菌方式的研究報道。其中巴氏滅菌能較大程度保持小龍蝦產(chǎn)品滅菌后品質(zhì)，但殺菌效果不理想。高溫高壓滅菌能較好殺滅微生物，但對產(chǎn)品風(fēng)味與口感等影響較大[4]。因此選擇合適殺菌方式是小龍蝦產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。

過熱蒸汽是指在恒定的壓力下對飽和蒸汽繼續(xù)加熱，使其溫度升高到相應(yīng)沸點以上的高溫水蒸氣[5]。與傳統(tǒng)熱處理方式相比，過熱蒸汽的傳熱方式除對流傳熱和輻射傳熱，還有冷凝傳熱；在殺菌過程中蒸汽在物料表面冷凝，釋放大量的熱，使物料快速升溫同時大幅度殺滅微生物，縮短殺菌時間，保障產(chǎn)品品質(zhì)。且在殺菌過程中過熱蒸汽提供低氧環(huán)境，避免氧化反應(yīng)，降低有害物生成。近些年過熱蒸汽殺菌作為一種綠色熱加工技術(shù)而備受關(guān)注[6]。目前，研究已發(fā)現(xiàn)過熱蒸汽對大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、嗜熱芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）[8]、沙門氏菌（Salmonella）[9]等微生物具有良好的殺菌效果。然而，過熱蒸汽殺菌技術(shù)對小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌殺滅效果的研究尚未有文獻報道。

微生物殺菌動力學(xué)研究是殺菌技術(shù)運用的關(guān)鍵理論之一，它可以定量評價殺菌的效果、提供合適的殺菌設(shè)計標(biāo)準，對殺菌技術(shù)的實際應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義[10]。目前，已研究多種殺菌技術(shù)對不同微生物的殺菌動力學(xué)，例如超聲輔助超臨界CO2殺滅大腸桿菌（E.coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的動力學(xué)[11]，微波和巴氏滅菌殺滅大腸桿菌O157：H7（Escherichia coliO157：H7）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的動力學(xué)[12]和過熱蒸汽殺滅沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌的殺菌動力學(xué)[13]。然而，過熱蒸汽對小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的殺菌動力學(xué)還未見有研究報道。

本研究以從腐敗小龍蝦產(chǎn)品中分離的優(yōu)勢腐敗菌為研究對象，研究不同條件下過熱蒸汽溫度、流量和處理時間對小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的殺菌效果及動力學(xué)，并初步探究其殺菌機理，以期獲得過熱蒸汽殺滅小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的最佳條件，為指導(dǎo)過熱蒸汽在小龍蝦產(chǎn)品加工中的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦（Procambarus clarkii），30～ 36 尾/kg，購于廣東省湛江市霞山區(qū)東風(fēng)海鮮市場；營養(yǎng)肉湯(NB)、PCA 平板計數(shù)瓊脂、革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Taq DNA 聚合酶、PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司；體積分數(shù)25%戊二醛、無水乙醇、叔丁醇，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 主要實驗儀器和設(shè)備

JSM-7610F 掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；SW-CJ-FD 潔凈雙人工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Hema 9600 PCR 基因擴增儀，珠海黑馬醫(yī)療儀器有限公司；SLI-700 埃朗生化培養(yǎng)箱，東京理化器株式會社；HZQ-X100 全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；FDU-1100 真空冷凍干燥設(shè)備，東京理化器械株式會社；Aglient Cary 60 紫外-可見光光度計，美國安捷倫科技公司；DDSJ-308A 電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；過熱蒸汽處理系統(tǒng)，自制[14]。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備 新鮮小龍蝦→超聲清洗→瀝干→油炸（170 ℃油炸3 min）→煮制（含5 g/100 mL食鹽的沸水中煮10 min）→冷卻→真空包裝→25 ℃下貯藏。

1.3.2 貯藏期間菌落總數(shù)與揮發(fā)性鹽基氮含量測定 每天測定熟制小龍蝦的菌落總數(shù)與揮發(fā)性鹽基氮含量。菌落總數(shù)測定方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》；揮發(fā)性鹽基氮采用自動凱氏定氮儀法測定，參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》。

1.3.3 腐敗菌的分離純化與鑒定 選取貯藏終點的小龍蝦樣品，在無菌超凈臺中將小龍蝦去頭、去殼，稱取25 g 蝦肉，用無菌剪刀剪碎后放入盛有225 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)。按10 倍系列稀釋，稀釋至10-5。取100 μL 菌懸液均勻涂抹在營養(yǎng)瓊脂上，在37 ℃下，恒溫培養(yǎng)48 h 左右。挑選一個合適的平板（菌落數(shù)約30～100 CFU）計數(shù)，并挑起平板上全部可見菌落，進行編號，連續(xù)進行3 次劃線分離。用體積分數(shù)為20%甘油-80 ℃保存，以備后用。根據(jù)革蘭氏染色、細菌形態(tài)和菌落特征將獲得的菌株分組。將所有純菌株進行16S rDNA 的PCR 擴增，其產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序[15]。將測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進行BLAST 系列分析，選取相似性99%以上菌株的基因序列，利用MEGA5.1 軟件進行鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌懸液的配制 用接種環(huán)挑取一環(huán)小龍蝦的優(yōu)勢腐敗菌接入無菌的營養(yǎng)肉湯（NB）中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)重復(fù)3 次[16]。將培養(yǎng)好的細菌菌懸液離心（5 000 r/min,15 min，4℃）。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮在生理鹽水中至所需濃度，濃度范圍為108～ 109CFU/mL[17]。

1.3.5 過熱蒸汽殺菌實驗過程 首先設(shè)置好過熱蒸汽儀器的溫度、流量等參數(shù)（溫度參數(shù)為170、200、230 ℃，流量參數(shù)為19、24、29 m3/h），待整個系統(tǒng)溫度和流量穩(wěn)定后，關(guān)閉閥門，快速將3根裝有4 mL 菌懸液的18mL 玻璃試管放在物料放置架上，關(guān)閉箱門。重新打開蒸汽閥門，同時記錄殺菌時間（殺菌時間為40、70、100、150、200、250、300 s）。殺菌完成后，將試管立即放入冰水中冷卻，直至微生物計數(shù)檢測[18]。

1.3.6 微生物計數(shù) 參照方法1.3.2 中菌落總數(shù)測定的方法檢測腐敗菌在過熱蒸汽處理前、后的數(shù)量。過熱蒸汽的殺菌效果采用微生物殘活率表示，見公式（1）。

過熱蒸汽處理前的菌懸液的菌落總數(shù)記為N0（CFU/mL）；過熱蒸汽處理后菌懸液的菌落總數(shù)記為N（CFU/mL）。

1.3.7 殺菌機理的菌懸液制備 按照1.3.4 的方法配制菌懸液，再按照1.3.5 的方法對菌懸液進行殺菌，具體的過熱蒸汽殺菌條件：過熱蒸汽溫度230 ℃、流量29 m3/h，處理時間分別為：0、40、70、100、150、200、250 s。

1.3.8 菌懸液電導(dǎo)率測量 對按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液，使用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率值。

1.3.9 菌懸液紫外吸收測量 對按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液進行離心（5000 r/min,15 min，4 ℃），取上清液，在波長260 nm 處測定其吸光值。

1.3.10 細菌微觀形態(tài)的觀察 借助掃描電子顯微鏡對小龍蝦產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌菌株細胞形態(tài)進行觀察。對按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液進行離心（5 000 r/min,15 min，4 ℃，棄去上清液，下同），再加入0.1 mol/L pH＝7.0 的PBS 緩沖液，離心。加入適量的體積分數(shù)2.5%的戊二醛溶液固定過夜后離心。加入PBS 緩沖液，離心，重復(fù)3 次。分別加入30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇逐級洗脫，每級洗脫10 min，離心，其中100%的乙醇洗脫2 次，其余洗脫1 次。再加入無水乙醇與叔丁醇（體積比＝1∶1）洗脫15 min，離心。最后叔丁醇洗脫15 min，離心。得到的菌泥再經(jīng)真空冷凍干燥后，固定在金屬箔片上，噴金80 s，電鏡觀察。

1.4 殺菌動力學(xué)數(shù)學(xué)模型--Weibull 模型

式中，b為尺度參數(shù)，n為形狀參數(shù)，t為過熱蒸汽處理時間(s)。當(dāng)n=1，曲線為一條直線，此時Weiibull 模型為一級動力學(xué)方程；當(dāng)n＞ 1，曲線呈凸形；當(dāng)n＜ 1，曲線呈凹形。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準差”表示，使用Origin 8.5 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行擬合分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熟制小龍蝦貯藏期間菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮變化

菌落總數(shù)直接反映熟制小龍蝦產(chǎn)品被細菌污染的程度和是否符合衛(wèi)生要求，所以菌落總數(shù)在一定程度上表示小龍蝦產(chǎn)品是否具有可食性。揮發(fā)性鹽基氮含量表示小龍蝦產(chǎn)品由于受到微生物和酶的作用，本身蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)的程度[19]。圖1 是熟制小龍蝦在常溫下（25 ℃）貯藏過程中菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量的變化，由圖1 可知，貯藏期間小龍蝦菌落總數(shù)一直持續(xù)增長，揮發(fā)性鹽基氮含量先緩慢增加后急劇上升。孫亞軍等[20]研究南美白對蝦蝦仁貯藏期間揮發(fā)性鹽基氮的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性鹽基氮含量先緩慢增加后快速增加。熟制小龍蝦貯藏期間揮發(fā)性鹽基氮含量的增長規(guī)律與其類似。這是由于貯藏前期，產(chǎn)品微生物的數(shù)量較少，蛋白質(zhì)被分解的程度較低，堿性含氮物質(zhì)的含量較少。隨著貯藏時間延長，微生物數(shù)量增加，分解作用變強，從而使揮發(fā)性鹽基氮含量增加[21]。根據(jù)GB 10136-2015《食品安全國家標(biāo)準 動物性水產(chǎn)制品》，判定熟制小龍蝦達到腐敗終點的菌落總數(shù)限量為 5×104CFU/g，揮發(fā)性鹽基氮限定值為30 mg/100 g。貯藏2 d，小龍蝦的菌落總數(shù)為4.47×105CFU/g，已超過限定值，此時揮發(fā)性鹽基氮含量為19.45 mg/100 g還未超標(biāo)，揮發(fā)性鹽基氮指標(biāo)滯后于菌落總數(shù)指標(biāo)。綜合來看，貯藏2 d 的熟制小龍蝦已腐敗變質(zhì)，到達貨架期的終點。

圖1 熟制小龍蝦菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量隨貯藏時間的變化Fig.1 Change in total bacterial count and TVB-N value of cooked crayfish during storage

2.2 小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

根據(jù)1.3.3，從稀釋度為10-3的平板上共挑取56 個菌落，然后分別劃線分離純化。根據(jù)圖2 可知，小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可判定A1 號菌為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；B2 號菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；C12號菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；D4 號菌為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。它們均為革蘭氏陽性菌，并分別占挑取分離總菌落的19.64%、14.29%、42.86%和23.21%。

圖2 4 種優(yōu)勢腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria

從小龍蝦產(chǎn)品中分離出的蠟樣芽孢桿菌和賴氨酸芽孢桿菌與相關(guān)文獻報道一致[22]。而解淀粉芽孢桿菌和短小芽孢桿菌是首次在腐敗小龍蝦產(chǎn)品中被發(fā)現(xiàn)。在真空包裝中，革蘭氏陽性菌的數(shù)量遠遠大于革蘭氏陰性菌[23]。蠟樣芽孢桿菌、解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌均被認為是熟制食品的優(yōu)勢腐敗菌，均在小麥面包[24]、魚糜[25]和烤雞[26]等中被發(fā)現(xiàn)。因煮制的殺菌溫度較低，同時解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌具有良好耐熱性，所以他們能夠在煮制過程中存活并在貯藏期間生長繁殖。因此解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌能夠在經(jīng)煮制后的小龍蝦產(chǎn)品中大量存在并成為小龍蝦的優(yōu)勢腐敗菌。

2.3 過熱蒸汽溫度和殺菌時間對小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的殺菌動力學(xué)

研究過熱蒸汽流量為24 m3/h、不同過熱蒸汽溫度和殺菌時間對4 種優(yōu)勢腐敗菌的滅活效果，其結(jié)果如圖3 所示。在整個殺菌過程，隨著殺菌時間延長，微生物殘活率持續(xù)下降，直到完全殺滅。但整個過程，微生物殘活率下降的速率是不同的。在殺菌初始階段，4 種優(yōu)勢腐敗菌的殘活率均迅速下降，并呈現(xiàn)類似的趨勢。然后隨著過熱蒸汽處理時間的延長，4 種優(yōu)勢腐敗菌的殘活率變化緩慢，趨于平緩。此外，過熱蒸汽對4 種小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的殺菌動力學(xué)所擬合的生存曲線均為“拖尾”曲線。這是由于在過熱蒸汽處理初期，過熱蒸汽遇見冷試管時，蒸汽在試管表面冷凝，釋放出大量的熱量并傳遞給菌懸液，使其溫度快速升高，從而快速的殺死菌懸液中存活的細菌。隨著過熱蒸汽的處理，菌懸液中存在的熱敏性細菌個體被殺滅，留下耐熱性較強的細菌個體，導(dǎo)致殘活率下降速率變慢[27]。上述趨勢與過熱蒸汽殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Geobacillus stearothermophilusspores）的過程類似[28]。這種趨勢不僅與殺菌工藝有關(guān)，還與細菌細胞壁有關(guān)。4 種小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌均為革蘭氏陽性菌。革蘭氏陽性菌擁有多層肽聚糖和磷壁酸組成的堅固和厚實的細胞壁，磷壁酸有助于加強細胞壁的機械強度，從而提高細菌熱耐性[29]。

殺菌效果也受過熱蒸汽溫度的影響。過熱蒸汽對4 種小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的滅活效果與過熱蒸汽溫度呈正相關(guān)。在相同殺菌時間，過熱蒸汽溫度為230 ℃的殺菌效果要優(yōu)于170 ℃。較高過熱蒸汽溫度使蒸汽在冷凝時釋放大量的熱和較強的氣體輻射，因此使菌懸液的溫度上升得更快，具有更高的微生物殺菌效率[30]。同時，不同腐敗菌對不同過熱蒸汽溫度有不同的反應(yīng)。蒸汽溫度170 ℃，殺菌時間為250 s 時，解淀粉芽孢桿菌的殘活率為-6.88，而在相同條件下，其他菌株對應(yīng)的殘活率均＜-8。在相同溫度條件下，其殘活率不同，可能與菌株本身的耐熱性有關(guān)。在4 種小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌中，B2菌株的耐熱性最強。BOUKHRIS I 等發(fā)現(xiàn)解淀粉樣芽孢桿菌具有很強耐熱性[31]。總之，過熱蒸汽對4種小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌有較好的殺菌效果。過熱蒸汽處理（200 ℃，250 s；230 ℃，200 s）后，其殘活率均＜-8，殺菌效果均能達到近100%的致死率。

2.4 過熱蒸汽流量對小龍蝦腐敗菌殺菌效果的影響

過熱蒸汽溫度為200 ℃，不同過熱蒸汽流量的殺菌過程中，蒸汽流量對4 種優(yōu)勢腐敗菌殺菌效果的變化趨勢與蒸汽溫度相似。其結(jié)果如圖4 所示，在殺菌初期，殘活率迅速減小。隨處理時間的延長，腐敗菌的殘活率變化逐漸變緩慢。擬合不同蒸汽流量對小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的動力學(xué)曲線都呈帶有“拖尾”的曲線。通過過熱蒸汽（19 m3/h，300 s；24 m3/h，250 s；29 m3/h，200 s）處理后，小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌能被完全殺滅，其殺菌效果均能達到近100%的致死率。

圖3 在24 m3/h 蒸汽流量下殺菌處理小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的存活曲線Fig.3 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different 24 m3/h steam flow rate

圖4 在200℃蒸汽溫度下殺菌處理小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的存活曲線Fig.4 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different superheated steam flow rates,treatment time and 200 ℃ steam temperature

2.5 Weibull 模型參數(shù)及擬合評價

運用Weibull 模型擬合不同過熱蒸汽溫度、流量和殺菌時間因素下殺滅4 株小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌后殘活率的曲線。由表1 可知，Weibull 模型的R2≥0.935，表明Weibull 模型對過熱蒸汽滅活小龍蝦產(chǎn)品中優(yōu)勢腐敗菌的所有動力學(xué)都具有較高擬合度。Weibul 模型因只有2 個參數(shù)b、n，具有一定的簡潔性、靈活實用性，可避免過度參數(shù)化[32]。尺度參數(shù)b反映過熱蒸汽參數(shù)與殺菌效果間相關(guān)性，形狀參數(shù)n反映曲線的形狀。由表1 可知，參數(shù)b隨著過熱蒸汽溫度、流量的增大而增大，說明過熱蒸汽參數(shù)與殺菌效果呈正相關(guān)，所以提高過熱蒸汽溫度和增大流量，更容易到達滅活腐敗菌的效果；參數(shù)n的值均小于1（表1），表明擬合曲線的形狀為先迅速下降，后趨于平緩，呈凹形。因此，延長殺菌時間并不能夠提高整個殺菌過程的殺菌效率[33]。為避免拖尾現(xiàn)象發(fā)生、提高過熱蒸汽殺菌效果和保障產(chǎn)品品質(zhì)，過熱蒸汽對小龍蝦腐敗菌的殺菌過程應(yīng)提高過熱蒸汽溫度、增大流量、縮短殺菌時間。

表1 Weibull 模型參數(shù)和R2Table 1 Weibull model parameters and R2

為衡量實際值與預(yù)測值的接近程度，以過熱蒸汽溫度、流量所有的實測值分別為橫坐標(biāo)，模型預(yù)測值為縱坐標(biāo)作圖，進行線性擬合，其結(jié)果如圖5所示。實測值與預(yù)測值越接近，其關(guān)系曲線的斜率a、決定系數(shù)R2均接近于1，截距b接近于0。由圖5 可知，過熱蒸汽溫度和流量的線性回歸方程分別為y=0.984 11x-0.090 6（R2=0.984 98）、y=0.978 6x-0.127 73（R2=0.979 31）。斜率a、截距b分別為a=0.984 11、0.978 6；b=0.090 6、0.127 73。斜率a、R2均接近1，截距b接近于0，說明Weibull 模型得到的預(yù)測值與實測值接近程度很高。

圖5 過熱蒸汽溫度和流量對小龍蝦腐敗菌殺菌效果的實測值和預(yù)測值的相關(guān)性Fig.5 Correlation between measured value and predicted value for inactivation effects of spoilage bacteria in crayfish by steam temperature and flow rate

2.6 殺菌機理初探

2.6.1 電導(dǎo)率及紫外吸收 細胞膜是維持細胞完整和細胞正常物質(zhì)運輸、能量代謝的重要結(jié)構(gòu)，當(dāng)細菌的細胞膜受到破壞時，細胞膜失去控制物質(zhì)運輸?shù)墓δ?，細胞?nèi)電解質(zhì)大量外流，導(dǎo)致菌懸液的電導(dǎo)率升高。同時膜內(nèi)小分子物質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)也隨之流出，這些核酸物質(zhì)在波長260 nm 處有吸收[34]。因此通過測量菌懸液的電導(dǎo)率和260 nm吸光度的變化情況，了解菌體在過熱蒸汽處理后細胞膜的受損情況。從圖6-a 可知，0～ 40 s，菌懸液的電導(dǎo)率數(shù)值上升最快，40～ 250 s，菌懸液的電導(dǎo)率上升的速率比前40 s 緩慢。如圖6-b 所示，菌懸液在260 nm 的吸光度隨著過熱蒸汽處理時間延長呈不斷上升趨勢，先快速升高后平緩增加。電導(dǎo)率與吸光度的變化表明在過熱蒸汽處理40 s后菌懸液中已有大量菌體的細胞膜受到破壞[35]。電導(dǎo)率和紫外吸收的變化規(guī)律與小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的存活曲線（圖3、圖4）具有一致性。在殺菌初始階段，大量優(yōu)勢腐敗菌被殺滅，隨著過熱蒸汽處理時間延長，過熱蒸汽的殺菌速率變緩慢，最后趨于穩(wěn)定。

圖6 小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌電導(dǎo)率和紫外吸收隨過熱蒸汽處理時間的變化Fig.6 The changes of conductivity and UV absorption of the dominant spoilage bacteria from crayfish product treated with superheated steam treatment time

2.6.2 細菌微觀形態(tài)的觀察 圖7 表示小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌蠟樣芽孢桿菌的微觀形態(tài)隨過熱蒸汽處理時間的變化。從圖7-A 觀察可知，未經(jīng)過熱蒸汽處理的細胞具有規(guī)則的長桿狀，形態(tài)豐滿、完整、未變形，細胞表面光滑，無破裂，無內(nèi)容物外泄現(xiàn)象。過熱蒸汽處理40 s（圖7-B）后，菌體保持較完整的桿狀，但細胞表面變粗糙，出現(xiàn)不規(guī)則的褶皺，表現(xiàn)為凹凸不平，同時存在內(nèi)容物外泄現(xiàn)象，此時菌體形態(tài)已遭到破壞，細胞膜或細胞壁已破裂，導(dǎo)致菌懸液的電導(dǎo)率和紫外吸收數(shù)值的增加。過熱蒸汽處理150 s 和250 s 后（圖7-C 和圖7-D），菌體形態(tài)扭曲變形，菌體四周不完整，破損和斷裂嚴重，甚至有些菌體破裂成細胞碎片。結(jié)果表明，隨過熱蒸汽處理時間延長，改變了菌株外部形態(tài)，并對細菌的細胞壁膜造成不可逆的損傷，以及胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而導(dǎo)致菌體死亡。

圖7 過熱蒸汽分別處理0、40、150、250 s 蠟樣芽孢桿菌的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of Bacillus cereus at different inactivation time with superheated steam

3 結(jié)論

采用稀釋涂布平板法，從腐敗的小龍蝦產(chǎn)品中分離出優(yōu)勢腐敗菌，經(jīng)重復(fù)劃線純化得到純菌落。根據(jù)優(yōu)勢腐敗菌的16S rDNA 基因序列將其鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。Weibull 模型能較好擬合過熱蒸汽溫度、流量和殺菌時間對熟制小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的滅活動力學(xué)，其R2≥0.935。經(jīng)過熱蒸汽處理后，4 種小龍蝦產(chǎn)品的優(yōu)勢腐敗菌均能被完全殺滅。提高過熱蒸汽溫度和流量可以使過熱蒸汽對熟制小龍蝦腐敗菌的整體殺菌效果得到提升。同時通過對過熱蒸汽處理后菌懸液電導(dǎo)率和吸光度測量，以及對菌體微觀結(jié)構(gòu)的觀察，表明過熱蒸汽殺菌使菌體細胞膜遭到嚴重變化，使細菌形態(tài)發(fā)生變化，造成胞內(nèi)物質(zhì)外流，致使腐敗菌死亡。本研究結(jié)果證實過熱蒸汽是在小龍蝦產(chǎn)品加工殺菌過程中一種有前途的殺菌技術(shù)。