劉海新，余 穎，羅方方，湯水粉，馬文學(xué)，陳 思，鄭一玲

（1.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013；2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013）

丁香酚（eugenol）為苯丙素類化合物，可從丁香樹、柴桂等多種植物中提取[1]，有麻醉水生動(dòng)物的生理作用[2]。丁香酚可有效降低魚的應(yīng)激效應(yīng)，提高運(yùn)輸密度和存活率，因此在活魚運(yùn)輸環(huán)節(jié)中使用率高。當(dāng)前我國對(duì)麻醉劑用于食用水產(chǎn)品尚未開放，因此采用丁香酚麻醉食用活魚并不合法。目前丁香酚殘留可能導(dǎo)致食用安全風(fēng)險(xiǎn)已引起行業(yè)主管部門關(guān)注。近年來研究表明，長期食用高濃度丁香酚殘留食品會(huì)影響人體健康。美國國家毒理學(xué)規(guī)劃處研究認(rèn)為丁香酚具可疑致癌性[4]；歐洲食品安全委員會(huì)進(jìn)一步研究表明丁香酚對(duì)兔子有生長發(fā)育毒性，并制定每kg 人體每日允許攝入量為1.0 mg[5]。因此，研究水產(chǎn)品中丁香酚殘留與消除有重要意義。

丁香酚于在水產(chǎn)方面應(yīng)用研究重點(diǎn)在其對(duì)水生動(dòng)物的麻醉效果[6-16]，而對(duì)丁香酚在水生動(dòng)物體內(nèi)蓄積消除規(guī)律研究較少，僅見對(duì)虹鱒（Oncorhychus myskiss）[17]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[18]、銀鱸（Bidyanus bidyanus）[19]、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）[20]的研究。筆者以斜帶髭鯛（Hapalogenys nitens）為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，模擬長途運(yùn)輸麻醉過程，研究丁香酚在其血漿、肌肉、肝臟中蓄積和消除規(guī)律，并采用線性回歸統(tǒng)計(jì)分析估算休藥期，為丁香酚應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸?shù)氖秤冒踩u(píng)估提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斜帶髭鯛體質(zhì)量為（450±50）g，泉州市泉港肖厝養(yǎng)殖戶提供。實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)循環(huán)水族箱內(nèi)暫養(yǎng)1 周。養(yǎng)殖用水為沙濾海水，曝氣48 h后使用，鹽度26，養(yǎng)殖過程不斷充氧，保持水中溶解氧大于6.0 mg/L，每天換水1 次，投喂不含藥物的凍干磷蝦。挑選體表完整、活力強(qiáng)、無病無傷個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑及主要儀器 丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma 公司，純度≥99%；乙酸丁香酚酯標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度≥97%；分析純丁香酚，上海麥克林生化科技有限公司，純度≥99 %；正己烷，美國TEDIA 試劑公司，色譜純；無水硫酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，經(jīng)650 ℃灼燒4 h 于干燥器中冷卻備用；C18 和PSA 吸附劑，德國CNW 科技公司。

主要儀器有Agilent 7010 型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）、色譜柱Thermo TG-17MS 石英毛細(xì)管柱（30 mm × 0.25 mm × 0.25μm）、TGL-16G 離心機(jī)（上海安亭）、TDL-40B 離心機(jī)（上海安亭）、AB204-E 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多）、IKA MS3 旋渦混合器（德國IKA）、均質(zhì)器Retsch GM200（德國Restch）。

1.2 方法

1.2.1 不同質(zhì)量濃度丁香酚麻醉效果 設(shè)置丁香酚質(zhì)量濃度梯度為2.5、5.0、7.5、10、20、40 mg/L，每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)魚10 尾，放入麻醉液中麻醉1 h 后轉(zhuǎn)入海水中復(fù)蘇，觀察魚體進(jìn)入不同麻醉及復(fù)蘇分期的行為特征并計(jì)時(shí)。用同樣質(zhì)量濃度梯度的丁香酚溶液，每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)魚10 尾，分別麻醉魚6 h 和12 h 后轉(zhuǎn)入海水中復(fù)蘇1 h，記錄魚復(fù)蘇率。

1.2.2 藥浴麻醉和海水復(fù)蘇 用海水根據(jù)1.2.1 結(jié)果配制丁香酚溶液。取斜帶髭鯛70 尾，分別放入7個(gè)150 L 水族箱，每箱10 尾。水族箱中預(yù)先注入配制的丁香酚溶液。另取10 尾作為空白對(duì)照組不給藥。麻醉過程不斷充氧，于給藥后0.16、0.33、0.66、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 h，隨機(jī)從水族箱中取6 尾，自尾靜脈采血，加入10 g/L 抗肝素鈉0.3 mL（抗凝），混勻后離心，取上清血漿；剖取肝臟，用研缽磨碎均質(zhì)后裝入離心管中；剖取肌肉，用均質(zhì)器均質(zhì)后裝入廣口玻璃瓶。血漿及組織樣品于-18 ℃保存，待測。另取130 尾斜帶髭鯛按上述方法麻醉8 h 的魚，分別放入9 個(gè)裝有300 L海水的水族箱中，每箱≤15 尾，每日換水1 次。養(yǎng)殖用水為沙濾海水，曝氣48 h 后使用，鹽度26，養(yǎng)殖過程不斷充氧，保持水中溶解氧大于6.0 mg/L。于0.16、0.5、1.0、2.0、5.0、7.0、8.0、10、15、24、48、72、96、144、216、264、312、360、408、456 h 隨機(jī)從水族箱中分別取魚6 尾，同法采集血及肌肉與肝臟。為研究不同季節(jié)活魚麻醉運(yùn)輸和海水復(fù)蘇過程中丁香酚在魚體內(nèi)變化規(guī)律，分別于水溫15 ℃和25 ℃條件下進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 樣品前處理 采用QuCHERS 法進(jìn)行。以正己烷提取魚體組織中丁香酚，無水硫酸鈉吸取多余水分，PSA 和C18 去除干擾物。方法如下：

血漿：將冷凍保存的血漿于室溫下自然解凍，混勻，吸取0.5 mL 加入200 ng/mL 內(nèi)標(biāo)（乙酸丁香酚酯）溶液500 μL、正己烷2.5 mL 和無水硫酸鈉2 g，旋渦震蕩2 min，以4 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，用2.5 mL 正己烷重復(fù)提取1 次，合并上清液。取2.0 mL 提取液加入吸附劑PSA、C18 各100 mg 和無水硫酸鈉200 mg，渦旋混合2 min，靜置5 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過孔徑0.22 μm 濾膜后待測。

肌肉和肝臟：將冷凍保存樣品于室溫下自然解凍，稱?。?.0±0.1）g，加入200 ng/mL 內(nèi)標(biāo)（乙酸丁香酚酯）溶液1.00 mL、正己烷5 mL 和無水硫酸鈉2 g，旋渦震蕩2 min，以4 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，再用5 mL 正己烷重復(fù)提取1 次，合并上清液。取提取液2.0 mL，加入吸附劑PSA、C18各100 mg 和200 mg 無水硫酸鈉，渦旋混合2 min，靜置5 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過孔徑0.22 μm 濾膜后待測。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況，對(duì)濃度較高的血漿和組織樣品稀釋到線性范圍內(nèi)檢測。

1.2.4 儀器檢測 色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；初始溫度為80 ℃,保持2 min，以10 ℃/min 升溫至190 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min；氦氣為載氣（純度 ＞99.999%），流量為1.2 mL/min。

質(zhì)譜參數(shù)：電子轟擊能量為70 eV；離子源和四級(jí)桿溫度分別為250、150 ℃；傳輸線溫度250 ℃；氮?dú)鉃榕鲎矚猓髁?.5 mL/min；氦氣為淬滅氣，流量為2.25 mL/min；溶劑延遲8 min。

采用多重反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行，丁香酚以核質(zhì)比m/z149 作為定量離子、m/z104 作為輔助定性離子；對(duì)內(nèi)標(biāo)乙酸丁香酚酯以m/z149 作為定量離子、以m/z131 作為輔助定性離子。離子監(jiān)測參數(shù)見表1。

表1 丁香酚和丁香酚乙酸脂離子監(jiān)測參數(shù)Table 1 Monitoring parameters for eugenol and eugenyl acetate detection in mass spectrometry

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取空白對(duì)照組斜帶髭鯛的血漿和肌肉、肝臟組織，分別添加不同量的丁香酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，使提取液質(zhì)量濃度分別為0.1、0.4、2.0、10、20、50、100、500 ng/mL。按上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行GC-MS/MS 分析，用內(nèi)標(biāo)法對(duì)丁香酚含量進(jìn)行定量。

1.2.6 檢測結(jié)果的可靠性和定量限 取空白血漿，加入不同濃度的丁香酚，使血漿中丁香酚質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、50、500 μg/L，每個(gè)濃度取6 個(gè)平行樣品，檢測回收率為78.4%～ 96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.59%～ 9.12%。取空白肌肉，加入不同濃度的丁香酚，使肌肉中丁香酚質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、50、500 μg/kg，每個(gè)濃度取6 個(gè)平行樣品，檢測回收率為79.1%～ 88.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.12%～ 11.2%。取空白肝臟，加入不同濃度丁香酚，使肝臟中丁香酚質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、50、500 μg/kg，每個(gè)濃度取6 個(gè)平行樣品，檢測回收率為77.2%～88.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11～ 12.8 %。因此，所用檢測方法符合藥物分析要求。根據(jù)信噪比大于10及回收率70%～ 120%的要求，確定肌肉和血漿定量限為1 μg/kg，肝臟定量限為2 μg/kg。

1.2.7 休藥期估算 日本對(duì)丁香酚在魚類中最高殘留限量（MRL）為50 μg/kg[22]，依據(jù)該限量水平參照歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）方法[21]估算休藥期。即lnCt=-kt+lnC0，Ct為不同時(shí)間點(diǎn)組織中藥物濃度，C0指數(shù)前因子（時(shí)間t=0 時(shí)，組織中藥物濃度）。EMA 推薦，以動(dòng)物組織中藥殘濃度（正態(tài)分布單側(cè)95%置信限95%容許上限）低于最高殘留限量（MRL）時(shí)間為休藥期（d）。如算得結(jié)果不是整數(shù)，應(yīng)以“d”為單位向上取整。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DAS2.0 藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)藥-時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合并計(jì)算主要代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)的相關(guān)性、顯著性以及方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚麻醉斜帶髭鯛濃度確定

丁香酚對(duì)不同魚類的麻醉表現(xiàn)各有差異，參考文獻(xiàn) [11-13]，將麻醉和復(fù)蘇分別分為A1 -A4、R1-R4 各4 個(gè)階段，各階段行為特征見表2。

表2 斜帶髭鯛麻醉與復(fù)蘇分期及行為特征Table 2 Behavior of Hapalogenys nitens in different anaesthetic and recovery stages

由表3 和表4 可知，在2.5 mg/L 的丁香酚中，斜帶髭鯛即有麻醉反應(yīng)；5.0～ 7.5 mg/L 的丁香酚就能使斜帶髭鯛產(chǎn)生魚體失去平衡、平躺到容器底部的麻醉效果；質(zhì)量濃度為10 mg/L 丁香酚溶液可使斜帶髭鯛進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)，麻醉12 h 后，復(fù)蘇率為90%。斜帶髭鯛經(jīng)20 mg/L 丁香酚溶液麻醉6 h，復(fù)蘇率90%，麻醉12 h 復(fù)蘇率70%。經(jīng)40 mg/L 丁香酚溶液麻醉6 h，斜帶髭鯛全部死亡。說明超過20 mg/L 丁香酚溶液對(duì)斜帶髭鯛有一定毒性作用。

據(jù)了解，長途運(yùn)輸過程中用丁香酚麻醉魚時(shí)，丁香酚用量難以準(zhǔn)確控制，主要通過觀察藥物對(duì)魚的麻醉效果而定。只要魚活動(dòng)能力明顯降低、沉到水箱底部，即可達(dá)到長途運(yùn)輸降低死亡率的目的，并不將魚麻醉到完全失去活動(dòng)能力狀態(tài)，即魚被麻醉程度相當(dāng)于“反應(yīng)遲鈍，鰓蓋張合頻率緩慢，魚體失去平衡”的A2 麻醉階段；部分長途運(yùn)輸中的魚也會(huì)進(jìn)入“失去反應(yīng)能力，鰓蓋張合沒規(guī)律，平躺于容器底部”的A3 麻醉階段。表2～ 4 可見，丁香酚質(zhì)量濃度定為7.5 mg/L 時(shí)，斜帶髭鯛進(jìn)入A3麻醉階段，但不進(jìn)入深度麻醉的A4 階段，可確保經(jīng)長時(shí)間麻醉后的復(fù)蘇率仍較高。因此，確定麻醉斜帶髭鯛的丁香酚質(zhì)量濃度為7.5 mg/L。

2.2 丁香酚在魚體內(nèi)濃度變化和代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.2.1 藥浴麻醉 在水溫（15±2）℃條件下，7.5 mg/L 丁香酚溶液藥浴麻醉的藥物在血漿、肌肉、肝臟中藥-時(shí)曲線見圖1。圖1 可見，藥浴過程中，丁香酚在不同組織中蓄積趨勢一致。各組織藥物濃度組藥浴2 h 后達(dá)到峰值，在藥浴8 h 內(nèi)基本保持穩(wěn)定。（15±2）℃和（25±2）℃水溫環(huán)境條件下，麻醉過程丁香酚在魚體內(nèi)蓄積變化見圖2～ 4。結(jié)果表明，溫度會(huì)顯著提高丁香酚在魚體內(nèi)蓄積濃度，高溫條件下絕大部分時(shí)間點(diǎn)血漿和組織中丁香酚濃度值均高于低溫條件下對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。

表3 不同質(zhì)量濃度丁香酚對(duì)斜帶髭鯛麻醉效果Table 3 Anaesthetic effect of eugenol at different concentration on Hapalogenys nitens

表4 不同質(zhì)量濃度丁香酚長時(shí)間麻醉對(duì)斜帶髭鯛的影響Table 4 Effect of eugenol concentration on recovery of Hapalogenys nitens

圖1 15 ℃藥浴麻醉中血漿、肌肉、肝臟丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.1 Eugenol concentration in tissue during the period of anaesthetization at 15 ℃

圖2 不同溫度下麻醉過程血漿中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.2 Eugenol concentration in plasma at different temperature during the period of anaesthetization

圖3 不同溫度下麻醉過程肌肉中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.3 Eugenol concentration in muscle at different temperature during the period of anaesthetization

圖4 不同溫度下麻醉過程肝臟中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.4 Eugenol concentration in liver at different temperature during the period of anaesthetization

在丁香酚藥浴麻醉過程中，斜帶髭鯛各組織中丁香酚達(dá)到最高濃度時(shí)間和濃度值見表5。

表5 斜帶髭鯛藥浴麻醉時(shí)丁香酚的達(dá)峰時(shí)間和達(dá)峰濃度Table 5 Eugenol peak time and peak concentration of Hapalogenys nitens during the period of anaesthetization

表5 表明，采用7.5 mg/L 丁香酚麻醉斜帶髭鯛，藥物達(dá)峰時(shí)間tmax由小到大依次為血漿、肌肉、肝臟。15 ℃和25 ℃水溫條件下，肝臟達(dá)峰濃度Cmax分別為160.07 mg/kg 和185.20 mg/kg，顯著高于肌肉和血漿。水溫從15 ℃升到25 ℃，斜帶髭鯛血漿丁香酚達(dá)峰時(shí)間tmax從2.00 h 降至1.50 h，肌肉中tmax從3.00 h 降至2.00 h，蓄積速度有所加快，而肝臟中tmax無明顯影響。溫度對(duì)魚體中丁香酚蓄積影響還表現(xiàn)在各組織達(dá)峰濃度上，血漿、肌肉和肝臟的Cmax增加幅度分別為29.8%、24.5%和15.7%。因此，升溫可提高丁香酚在魚體內(nèi)蓄積速度及濃度水平。

2.2.2 復(fù)蘇 圖5 可見，斜帶髭鯛經(jīng)丁香酚溶液麻醉8 h 后在海水中復(fù)蘇時(shí)，丁香酚在魚體內(nèi)快速降解，48 h 時(shí)血漿和肌肉中丁香酚濃度低于50 μg/kg，48～ 456 h（19 d）丁香酚在4～30 μg/kg 范圍無規(guī)律變化。肝臟中丁香酚48 h 后在80～ 400 μg/kg 范圍無規(guī)律變化。

根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）最小原則判斷（權(quán)重系數(shù)取1/c2），斜帶髭鯛復(fù)蘇時(shí)丁香酚在魚體內(nèi)代謝過程符合二室模型，主要藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表6。水溫從15 ℃升高到25 ℃，丁香酚在斜帶髭鯛血漿中平均駐留時(shí)間MRT（0-t）從6.464 h 降至6.076 h，在肌肉中從4.001 h 降至3.756 h，在肝臟中從6.670 h 降至5.791 h，降幅分別為6.00%、6.12%、13.17%，代謝速度隨溫度升高有所加快。

圖5 斜帶髭鯛魚體復(fù)蘇丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.5 Eugenol concentration in tissue during the period of recovery

表6 不同溫度下斜帶髭鯛體內(nèi)丁香酚降解過程藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 6 Pharmacokinetic parameters of Hapalogenys nitens during the period of recovery at different temperature

斜帶髭鯛血漿、肌肉和肝臟丁香酚在降解過程中的濃度均出現(xiàn)反復(fù)現(xiàn)象（圖6～ 8）。血漿和肝臟丁香酚濃度均在復(fù)蘇5 h 時(shí)升高，肌肉丁香酚濃度在3 h 時(shí)升高。各組織丁香酚濃度升幅差異大。肝臟從3.02×103μg/kg 回升到1.37×104μg/kg，升幅為353%；血漿從167 μg/kg 回升到257 μg/kg，升幅為 53.9%；肌肉從 1.77×103μg/kg 回升到2.78×103μg/kg，升幅為57.1%。肝臟丁香酚升幅遠(yuǎn)大于肌肉和血漿。

溫度升高對(duì)魚體血漿、肌肉、肝臟中丁香酚含量影響見圖9～ 11。由圖9～ 11 可見，不同溫度下復(fù)蘇48 h 后斜帶髭鯛血漿、肌肉和肝臟中丁香酚殘留濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），說明溫度變化對(duì)各組織中丁香酚長時(shí)間殘留濃度影響不大。

圖6 復(fù)蘇20 h 血漿中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.6 Eugenol concentration in plasma during the period of recovery in 20 hours

圖7 復(fù)蘇20 h 肌肉中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.7 Eugenol concentration in muscle during the period of recovery in 20 hours

圖8 復(fù)蘇20 h 肝臟中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.8 Eugenol concentration in liver during the period of recovery in 20 hours

圖9 不同溫度下復(fù)蘇過程血漿中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.9 Eugenol concentration in plasma during the period of recovery at different temperature

圖10 不同溫度下復(fù)蘇過程肌肉中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.10 Eugenol concentration in muscle during the period of recovery at different temperature

圖11 不同溫度下復(fù)蘇過程肝臟中丁香酚藥-時(shí)曲線Fig.11 Eugenol concentration in liver during the period of recovery at different temperature

2.3 丁香酚在魚肌肉中的休藥期

將表7 中肌肉丁香酚濃度值取自然對(duì)數(shù)，最小二乘法線性回歸方程為y=-0.092 7x+6.907 0，相關(guān)系數(shù)R=0.915 8。以線性回歸統(tǒng)計(jì)分析估算休藥期，所采用的數(shù)據(jù)需滿足方差齊性檢驗(yàn)、失擬檢驗(yàn)、殘差正態(tài)分布檢驗(yàn)要求。如數(shù)據(jù)未通過這些檢驗(yàn)，說明數(shù)據(jù)中存在離群值或所采用的時(shí)間點(diǎn)組織中藥物不在代謝末端消除期，需剔除離群值或重新選擇其他時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。

以柯克倫（Cochran）檢驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)殘留濃度對(duì)數(shù)值的方差齊性[23]，計(jì)算得統(tǒng)計(jì)量C=0.407，小于顯著水平α=0.05 統(tǒng)計(jì)量臨界值C=0.590，因此不同組數(shù)據(jù)的方差齊性符合要求；為確保擬合回歸線性相關(guān)性滿足統(tǒng)計(jì)要求需進(jìn)行失擬檢驗(yàn)，過程見表8。對(duì)給定顯著水平α=0.05，計(jì)算所得統(tǒng)計(jì)量F=0.421 1 ＜F0.95（2,22）=3.44，因此認(rèn)為，殘留濃度對(duì)數(shù)值是時(shí)間的線性函數(shù)；在線性回歸模型中，殘差應(yīng)服從正態(tài)分布。將殘差除以Sy·x（剩余標(biāo)準(zhǔn)差）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，數(shù)值范圍在-2.022～ 1.439 之間，均未超過4 倍剩余標(biāo)準(zhǔn)差的判定限。應(yīng)用SPSS22.0軟件“探索分析”功能，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化殘差進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)（Shapiro-Wilk），同時(shí)繪制正態(tài)分布檢驗(yàn)Q-Q圖，觀察是否有離群值。Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)的顯著性P=0.315 ＞ 0.05，接受殘差正態(tài)分布的假設(shè)。標(biāo)準(zhǔn)化殘差分布均在預(yù)期直線周圍，未發(fā)現(xiàn)較大偏離值如圖12。通過上述3 項(xiàng)檢驗(yàn)，說明用于休藥期估算所采用的24 個(gè)數(shù)據(jù)符合線性回歸分析要求。

表8 肌肉殘留方差分析Table 8 ANOVA for muscle

圖12 殘差正態(tài)分布檢驗(yàn)Q-Q 圖Fig.12 Resdiuals normality test Q-Q plot

以正態(tài)分布單側(cè)95%置信限95%容許上限計(jì)算藥物在組織中不同時(shí)間點(diǎn)殘留量水平，繪制曲線如圖13。該曲線低于最高殘留限量（MRL=50 μg/kg）對(duì)應(yīng)時(shí)間50 h，即2.08 d。因此，休藥期確定為3 d。

圖13 肌肉休藥期計(jì)算結(jié)果（95%置信度95%容許上限）Fig.13 Withdrawal period calculation for muscle(95%tolerance limit with 95% confidence)

3 討論

3.1 丁香酚殘留檢測方法

目前，動(dòng)物體內(nèi)丁香酚殘留檢測方法主要包括液相色譜法[24-25]、氣相色譜法[26]和質(zhì)譜聯(lián)用法[27-28]，其前處理方法主要為均質(zhì)震蕩提取、液-液分配萃取、固相萃取等。近年來有學(xué)者采用QuEChERS 法前處理[29]，以簡化前處理過程，提高檢測效率。因此，本研究運(yùn)用QuEChERS 技術(shù)檢測前處理樣品，采用GC-MS/MS 進(jìn)行定量檢測。

3.2 丁香酚在斜帶髭鯛體內(nèi)累積及代謝動(dòng)力學(xué)特征

本研究表明，麻醉過程中各組織丁香酚達(dá)峰時(shí)間血液最小，肌肉和肝臟次之，說明藥物先進(jìn)入血液循環(huán)，隨血液分布到肌肉和肝臟；肝臟中丁香酚濃度峰值遠(yuǎn)高于其他組織，說明丁香酚在肝臟蓄積，丁香酚可能主要在肝臟中代謝；升溫加快了丁香酚在魚體內(nèi)的蓄積并提高其峰值濃度，Kildea等[19]用 15 mg/L 丁香酚麻醉銀鱸（Bidyanus bidyanus）時(shí)發(fā)現(xiàn)，高溫也導(dǎo)致銀鱸魚體內(nèi)丁香酚蓄積濃度有所提高。梁政遠(yuǎn)等[13]和陳德芳等[14]研究認(rèn)為，溫度升高會(huì)加快麻醉液經(jīng)鰓絲或體表滲入魚的速率，縮短麻醉作用時(shí)間，與本研究結(jié)果一致。

斜帶髭鯛經(jīng)丁香酚麻醉8 h 后放入海水中復(fù)蘇，體內(nèi)丁香酚濃度快速下降。血漿、肌肉和肝臟中丁香酚濃度在10 h 內(nèi)下降超過50%，這與丁香酚在虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）[17]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[18]、銀鱸（Bidyanus bidyanus）[19]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[20]中消除規(guī)律類似。斜帶髭鯛在復(fù)蘇過程中丁香酚在血漿、肌肉和肝臟中表現(xiàn)出滯留的現(xiàn)象，在其他動(dòng)物體也有類似特點(diǎn)，如丁香酚在蛙（Xenopus laevis）血漿中半衰期為4 h[30]，在大鼠（Rattus norvegicus）血漿中半衰期為18.3 h[31]。復(fù)蘇過程斜帶髭鯛血漿、肌肉和肝臟中丁香酚降解均出現(xiàn)濃度反復(fù)現(xiàn)象，可能是丁香酚在魚體內(nèi)存在肝腸循環(huán)、胃腸循環(huán)現(xiàn)象所致。類似情況也出現(xiàn)在凡納濱對(duì)蝦[20]和大鼠[32]中，丁香酚等苯酚共軛化合物在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程中，往往出現(xiàn)再循環(huán)現(xiàn)象。

研究表明，經(jīng)丁香酚麻醉的鯉魚（Cyprinus carpio）[13]和鯽魚（Carassius auratus)[14]復(fù)蘇時(shí)間隨溫度的升高而縮短，本研究中，溫度升高亦加快丁香酚在魚體內(nèi)的代謝速度?？赡苁且?yàn)殡S著水溫升高，魚體的心跳和呼吸頻率加快，新陳代謝較低溫時(shí)期增強(qiáng)，加快了丁香酚在魚體內(nèi)的代謝，符合魚類的代謝規(guī)律[14]。

Kildea 等[19]研究表明，首次使用丁香酚麻醉銀鱸，48 h 后在魚肉中未檢出丁香酚；二次充分麻醉，一周后仍可在銀鱸肌肉中檢出丁香酚。方曉磊等[22]研究認(rèn)為，活魚對(duì)初次吸收的丁香酚消除能力強(qiáng)，魚肉中丁香酚殘留消除快，但也削弱了魚體對(duì)丁香酚消除能力，二次給藥后的魚肉中丁香酚殘留消除時(shí)間長。本研究長時(shí)間藥浴麻醉類似于連續(xù)多次給藥，導(dǎo)致丁香酚在魚體內(nèi)保持低濃度長時(shí)間殘留。這可能是麻醉過程中丁香酚隨血液分布到組織中與蛋白結(jié)合的結(jié)果。由于麻醉時(shí)間長，丁香酚與蛋白充分結(jié)合，魚體內(nèi)結(jié)合型丁香酚遠(yuǎn)高于游離型，起藥庫的作用。將魚放入海水復(fù)蘇后，體內(nèi)游離丁香酚濃度逐漸降低，與蛋白結(jié)合的丁香酚緩慢釋放，同時(shí)還存在肝腸循環(huán)、胃腸循環(huán)等現(xiàn)象，導(dǎo)致低濃度游離丁香酚在魚體內(nèi)長時(shí)間存在。

溫度對(duì)低濃度藥物在動(dòng)物體內(nèi)長時(shí)間殘留影響不顯著。Kildea 等[19]研究不同溫度下復(fù)蘇麻醉的銀鱸（Bidyanus bidyanus），結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚體內(nèi)低濃度丁香酚殘留量差異也不顯著。筆者認(rèn)為可能是由于魚體內(nèi)結(jié)合型丁香酚和游離丁香酚之間的化學(xué)平衡，在15～ 25 ℃范圍內(nèi)受溫度影響小，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 丁香酚休藥期估算

孫宇航等[18]根據(jù)丁香酚在羅非魚血漿消除規(guī)律方程估算8 d 后血漿中丁香酚低于檢測限，確定休藥期為8 d；彭勤等[20]根據(jù)經(jīng)丁香酚麻醉后的凡納濱蝦48 h 后體內(nèi)丁香酚濃度降低至0.8～1 μg/kg，得出休藥期不少于48 h；Kildea 等[19]檢測麻醉一周后的銀鱸肌肉濃度平均值為0.32 mg/kg，依據(jù)每日允許攝入量（ADI）推算該濃度不會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。這些關(guān)于休藥期的估算是以用藥后某個(gè)時(shí)間點(diǎn)丁香酚殘留量低于安全限為依據(jù)，未充分考慮到該時(shí)間點(diǎn)藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝所處階段、生物個(gè)體間代謝能力差異和統(tǒng)計(jì)學(xué)上合理偏差范圍。以這種方式估算的休藥期可能與實(shí)際情況存在一定偏離。本研究參照EMA 估算動(dòng)物休藥期指南，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將可能導(dǎo)致結(jié)果偏離的不確定因素考慮在內(nèi)，繪制95%置信度95%容許上限曲線，以日本對(duì)魚體中最大殘留限量50 μg/kg 限量標(biāo)準(zhǔn)為界，得出3 d 休藥期的結(jié)果。由于不同種類水產(chǎn)動(dòng)物生理特點(diǎn)不同，對(duì)丁香酚代謝能力較大差異，丁香酚的使用濃度差別大。因此確定水產(chǎn)品運(yùn)輸合理的丁香酚休藥期，還應(yīng)對(duì)不同種類水產(chǎn)品開展休藥期研究，按水產(chǎn)動(dòng)物類別綜合考慮制定休藥期。

4 結(jié)論

1）在15℃以上水溫條件下，經(jīng)丁香酚麻醉8 h的斜帶髭鯛，放到海水中3 d 復(fù)蘇，肌肉中丁香酚濃度在95%置信度95%容許上限低于50 μg/kg，符合日本對(duì)魚體最大殘留限量要求。建議經(jīng)丁香酚麻醉運(yùn)輸?shù)男睅邗犘菟幤跒? d。

2）經(jīng)丁香酚長時(shí)間麻醉的斜帶髭鯛，該藥物在魚體內(nèi)保持低濃度長時(shí)間存在。