張 帆，曹俊巖，王 菁，張 鑫，易 旭

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦科，貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550001)

隨著老齡化時代的到來，老年女性的身心健康成為社會極為關(guān)注的問題，絕經(jīng)綜合征成為研究的熱點之一。前期研究顯示[1-4]，自擬更年湯具有類雌激素樣作用，治療腎陽虛型及腎陰陽兩虛絕經(jīng)前后諸證臨床療效確切，同時能抑制腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子，促進(jìn)顆粒細(xì)胞發(fā)育，對改善卵巢功能有一定藥理作用。本課題在此基礎(chǔ)上以此信號通路為切入點，探討自擬更年湯通過調(diào)節(jié)腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢中PI3K/Akt/mTOR信號通路對卵泡和卵巢功能的影響，報道如下。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物

4月齡SD雌性大鼠，清潔級，30只，體重(250±30)g；10～12月齡170只，體重(300±30)g。大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，喂養(yǎng)期間光照、黑暗各12 h，自由飲水，攝食顆粒飼料，室溫18～22 ℃，濕度68%～70%。實驗動物由第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK2012-0003。

1.2 實驗藥品

1.2.1 自擬更年湯組方 熟地12 g，山藥12 g，棗皮12 g，仙茅12 g，仙靈脾12 g，巴戟天12 g女貞子12 g，桑寄生12 g，旱蓮草12 g，當(dāng)歸10 g，獨活9 g，防風(fēng)9 g，桂枝9 g，細(xì)辛3 g，炙甘草6 g。每次使用前按相關(guān)藥物濃度比例煎制后儲存于4 ℃冰箱，藥材由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥藥房提供。

1.3 主要實驗試劑及器材

蘇木素染液(140315)及伊紅染液(140315)由北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；大鼠免疫組化檢測試劑盒(2017060903)及免疫組化抗原修緩沖修復(fù)液(2017080301)由為基因科技(上海)股份有限公司生產(chǎn)；胰島素生長因子1(ab106836)及其受體(ab182408)免疫熒光試劑盒由艾搏抗(上海)貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；1510型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；TDZ4-WS醫(yī)用離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)；萊卡DM300顯微鏡(德國萊卡公司)；倒置熒光顯微鏡IX71(日本奧林巴斯株式會社)；101-2AB型干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。實驗用儀器均由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心試驗室提供。

1.4 動物造模

1.4.1 圍絕經(jīng)期模型大鼠制備 采集每只SD大鼠的陰道脫落細(xì)胞涂片，HE染色后在顯微鏡下觀察。連續(xù)觀察四個動情周期，共20天。若涂片底層細(xì)胞均在50%以上，為動情周期紊亂、動情間期延長，提示所觀察的大鼠符合圍絕經(jīng)期模型的標(biāo)準(zhǔn)[5]。將符合標(biāo)準(zhǔn)的149只圍絕經(jīng)期大鼠隨機(jī)分為5組，每組24只，剩余剔除備用。

1.4.2 腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠制備 圍絕經(jīng)期模型大鼠制備成功后，參考文獻(xiàn)[6-8]采用氫化可的松注射液進(jìn)行腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠制備，按照中醫(yī)臟腑辨證標(biāo)準(zhǔn)，外源性氫化可的松造成動物外觀的病態(tài)表現(xiàn)，符合中醫(yī)腎陽虛證的臨床表現(xiàn)。將圍絕經(jīng)期模型大鼠于臀部肌肉豐厚處消毒后，左右交替，肌注氫化可的松注射液5 mg/(kg·d)，連續(xù)9天，給藥前后測量體重。當(dāng)大鼠出現(xiàn)持續(xù)性萎靡不振、豎毛、脫毛、毛不光潔、拱背少動、反應(yīng)遲鈍、扎堆，即為腎陽虛大鼠模型造模成功。

1.5 分組及給藥方法

將腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠隨機(jī)分為5組，分別為自擬更年湯高、中、低劑量組，替勃龍組，模型組，加上4月齡大鼠為青年組，共6組。每日準(zhǔn)時給模型大鼠灌胃，給藥劑量按人與動物體表面積換算[20]，換算后給予更年湯高、中、低劑量組給藥劑量分別為26.4 g/(kg·d)、13.2 g/(kg·d)、6.6 g/(kg·d)，替勃龍組為0.22 mg/(kg·d)，模型組及青年組給予1 mL/100g生理鹽水灌胃，連續(xù)15日。

1.6 檢測方法

1.6.1 大鼠卵巢組織上IGF-1及受體蛋白表達(dá)檢測 采用免疫熒光法：①將切好的冰凍切片從-20 ℃取出置于室溫晾干15～30 min；②用標(biāo)記筆做好樣本的標(biāo)記，用實驗油筆將需染組織畫圈避免染色不均，范圍約為0.5～1 cm，再用磷酸緩沖液(PBS)覆蓋組織清洗3次，每次3 min；③洗好后用槍頭吸去或甩干組織周圍多余液體并放于保濕盒內(nèi)，每張玻片滴加配制好的10%山羊血清50～100 μL覆蓋組織，將保濕盒放于37 ℃的孵育盒中孵育1 h；④孵育好的組織用PBS清洗2次，每次3 min，洗好后吸去組織周圍多余的液體，滴加配制好的IGF-I及IGF-IR一抗工作液50～100 μL覆蓋組織(比例均為1∶200)，再次放于濕溫盒內(nèi)，并將濕溫盒放于4 ℃冰箱過夜；⑤次日將過夜的組織切片置于孵育箱內(nèi)37 ℃孵育1 h，孵育好后PBS清洗3次，每次3 min；⑥滴加配制好的二抗工作液50～100 μL覆蓋組織(比例1∶200)，滴加好后放于37 ℃孵育箱孵育2 h，孵育好后用PBS清洗3次，每次3 min(避光洗)；⑦洗凈后滴加DAPI染液 50～100 μL將組織覆蓋，將保濕盒放于孵育盒中避光染色5～10 min，染好色后PBS清洗3次，每次3 min，然后吸去或甩干多余液體用抗熒光減弱膠封片；⑧將切片放于熒光顯微鏡下觀察所需觀察指標(biāo)在卵巢組織中的定位表達(dá)并拍照。

1.6.2 圖片分析方法 免疫組化及熒光結(jié)果均用此方法分析，所拍下的圖片經(jīng)Image-pro plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計卵巢組織上所需觀察指標(biāo)的陽性表達(dá)強(qiáng)度，最終經(jīng)軟件計算后換算成平均OD(吸光度)值。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠卵巢組織中IGF-1及其受體表達(dá)結(jié)果

造模后大鼠卵巢組織中IGF-1及其受體表達(dá)明顯低于正常青年組(P<0.01)；經(jīng)藥物干預(yù)后，更年湯高劑量組、西藥組大鼠卵巢組織上IGF-1及其受體表達(dá)明顯得到增加(P<0.01)；更年湯中劑量也能增加模型大鼠卵巢組織上IGF-1R表達(dá)(P<0.05)；低劑量組則作用不大(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠卵巢組織中IGF-1及IGF-1R表達(dá)結(jié)果比較 (x±s)

注：單因素方差分析，P<0.01。經(jīng)LSD檢驗，與模型組比較，*P>0.05，◇P<0.05，■P<0.01；與低劑量比較，#P>0.05，▲P<0.01；與中劑量組比較，★P<0.01，◇P>0.05；與高劑量組比較，▼P<0.01，○P>0.05；與替勃龍組比較，※P<0.01。

3.2 免疫熒光檢測卵巢PI3K蛋白表達(dá)量

自擬更年湯高、中、低劑量組，替勃龍組，模型組與青年組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。自擬更年湯高劑量組及替勃龍組與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。自擬更年湯低劑量組與替勃龍組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。自擬更年湯低劑量組與自擬更年湯高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別nPI3K自擬更年湯低劑量組1411.45±5.61☆※△■▲自擬更年湯中劑量組1714.34±6.37☆※◇自擬更年湯高劑量組1221.33±7.70☆○替勃龍組1821.11±8.32☆○模型組149.94±4.71☆青年組2140.56±18.90

注：與青年組比較，☆P<0.01；與模型組比較，○P<0.01，※P>0.05；與替勃龍組比較，△P<0.01，P>0.05；與高劑量組比較，■P<0.05，◇P>0.05；與中劑量組比較，▲P>0.05。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為絕經(jīng)前后諸證，腎虛是發(fā)病之本。但通過長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，貴州地處高原，寒濕較重，寒性收引易傷陽氣，易致腎陽虛衰，氣化無力，濕性重著，阻遏全身氣機(jī)，氣機(jī)不暢則全身經(jīng)脈氣血津液暢行受阻，甚或凝結(jié)阻滯不通，出現(xiàn)因腎陽虛衰而經(jīng)絡(luò)閉塞，氣不固衛(wèi)，陽不外達(dá)，出現(xiàn)一系列陽虛內(nèi)寒的癥狀，并且易感受寒濕之邪，出現(xiàn)內(nèi)寒與外寒共見之狀。在臨床遣方用藥中發(fā)現(xiàn)此類患者單以補腎溫陽滋陰臨床癥狀改善效果欠佳，故腎陽虛及腎陰陽兩虛患者可采用補腎溫陽、祛風(fēng)散寒之更年湯，全方貫穿補腎溫陽之法，并加入袪散風(fēng)寒的藥物，使腎陽得以內(nèi)滋，內(nèi)寒得以溫煦；同時，外寒得以驅(qū)散，經(jīng)絡(luò)得以通暢，氣機(jī)得以疏暢，能明顯改善絕經(jīng)前后諸證的腎陽虛、腎陰陽平衡失調(diào)所造成的寒證[2]。自擬更年湯由六味地黃丸、二仙湯、二至丸與獨活寄生湯四方化裁而成，全方由15味藥組成，方中君藥仙茅、熟地，二者共同溫腎陽、補腎精；臣藥仙靈脾、巴戟天，二者溫腎壯陽、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨；當(dāng)歸、桑寄生、棗皮、女貞子、旱蓮草四者同補肝腎、益腎精、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨，淮山共補腎肝脾三陰，填先天、補后天、調(diào)肝氣，以上八味藥共同配伍壯腎中之陽氣，溫而不燥，平補腎中陰陽，共奏補腎中陽氣、填精益髓、強(qiáng)固筋骨之功；佐藥獨活、防風(fēng)、細(xì)辛三者散外風(fēng)，加以桂枝，溫經(jīng)脈、助陽氣，共同驅(qū)散寒濕之邪，溫通經(jīng)脈；使藥炙甘草，健益后天脾氣，調(diào)和諸藥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸能夠促進(jìn)女性調(diào)節(jié)HPO軸的功能，提高雌激素水平釋放，改善絕經(jīng)前后諸證。研究發(fā)現(xiàn)二仙湯及其組方可上調(diào)卵泡顆粒細(xì)胞中雌激素β受體表達(dá)水平，改善卵巢功能，促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟及排卵，同時能通過改善卵巢供血，促進(jìn)抗苗勒氏管激素和抑制素的分泌，進(jìn)而提高卵泡募集和成熟，減少卵泡閉鎖，改善卵巢儲備功能。二至丸干預(yù)更年期模型大鼠能降低 FSH、LH、PRL水平表達(dá)，升高E2水平表達(dá)，達(dá)到改善絕經(jīng)綜合征癥狀的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，二至丸與二仙湯均可提高機(jī)體卵巢顆粒細(xì)胞的分泌功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)。

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛存在于細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、調(diào)控機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均存在完整的PI3K/AKT信號系統(tǒng)，它們共同協(xié)調(diào)卵泡的生長發(fā)育、成熟和周期性排卵。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)自擬更年湯可以通過提高腎陽虛圍絕經(jīng)期模型大鼠卵巢中PI3K、Akt、mTORmRNA和蛋白表達(dá)水平，而其中間介質(zhì)可能是通過IGF-1及IGF-1R來發(fā)揮作用，進(jìn)而促進(jìn)PI3K/Akt/mTOR信號通路活性增加，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，抑制卵泡閉鎖，促進(jìn)卵泡生長發(fā)育，這也從另一方面驗證了自擬更年湯可促進(jìn)卵泡發(fā)育，進(jìn)而使卵巢功能得到一定程度的改善。