陳瑞云，李 敏，彭 鶯，李遠(yuǎn)文，徐 詠

(深圳技師學(xué)院，廣東 深圳 518000)

香囊是中國傳統(tǒng)藝術(shù)文化特色之物品，在其漫長的歷史發(fā)展過程中，其外在形制、材料到內(nèi)在蘊(yùn)涵、象征、作用，都在演變。在香囊應(yīng)用的歷史進(jìn)程中，人們慢慢發(fā)現(xiàn)，香囊因其內(nèi)含物不同而具有不同的功用，可起前治病、辟穢之功用，并應(yīng)用于中醫(yī)外治法中。如：明代李時(shí)珍《本草綱目》記錄了用辰砂裝囊，戴身及髻中，治不寐。清代吳尚先的《理瀹駢文》亦收載了多個(gè)香佩方，如辟瘟囊、絳囊(內(nèi)盛七寶如意丹)、抗癆丸佩囊等。中藥香囊起防病治病的效果主要為其揮發(fā)性成分，現(xiàn)代研究表明，中藥揮發(fā)性成分對(duì)呼吸道有和平滑肌有作用、有中樞神經(jīng)作用、抗炎、抗過敏、抑菌殺菌、抗病毒等的藥理作用[1]。在含揮發(fā)油成份的中藥在功能歸類中多為解表類、芳香化濕類指示香囊可能對(duì)空氣菌落或治病菌有抑制或殺滅作用。同時(shí)，基于細(xì)菌的耐藥性與抗生素濫用有明顯相關(guān)，各衛(wèi)生行政部門及各級(jí)醫(yī)院對(duì)抗生素的合理使用進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控，此外，眾多學(xué)者致力于尋找其他新的有效的抗菌途徑[2]。由此，本文依常用中藥香囊配方如檀香、桂枝、白芷、蒼術(shù)等藥材制作香囊，研究其對(duì)靜態(tài)空氣中的菌落總數(shù)的影響及對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等的抑制作用；同時(shí)，研究其香囊中揮發(fā)性成分對(duì)為以上致病菌的抑制作用，最終為中藥香囊治未病和臨床運(yùn)用提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 藥材、儀器與試劑

藥材：檀香(深圳和順本草藥業(yè)有限公司，20161107)；蒼術(shù)(毫州大藥業(yè)有限責(zé)任公司，20180508)、艾葉(毫州大藥業(yè)有限責(zé)任公司，20180508)、白芷(毫州大藥業(yè)有限責(zé)任公司，20180508)、桂枝(康美藥業(yè)股份有限公司。170704361)、石菖蒲(陜西龍力藥業(yè)有限公司，20160512)、檀香揮發(fā)油(吉安華新天然植物有限公司，20190925)、蒼術(shù)揮發(fā)油( 吉安華新天然植物有限公司、20190925)、艾葉揮發(fā)油( 吉安華新天然植物有限公司、20190924)、肉桂揮發(fā)油(吉安華新天然植物有限公司、20190923)、白芷揮發(fā)油(吉安華新天然植物有限公司、20190921)、桂枝揮發(fā)油(吉安華新天然植物有限公司、20190925)、石菖蒲(吉安華新天然植物有限公司、20190925)。

試劑：(β)乙型溶血性鏈球菌(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司， CMCC(B)3221))；銅綠假單胞菌(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，ATCC9027)；大腸埃希菌(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，ATCC8739)；金黃色葡萄球菌(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司， ATCC6538)；白色念珠菌(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，C0055B)；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，3106042)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，1064381)；pH值7.0無菌氯化鈉溶液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，30105038)。

儀器：電子天平(昆山鈺恒電子衡量器有限公司，LBA-5200)；分析天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司，PB203-N)；立式壓力蒸氣滅菌鍋(重慶雅馬拓科技技有限公司，SQ810C)；三用恒溫水槽(上海精宏儀器設(shè)備有限公司，DK-600); 超凈工作臺(tái)(廣州市蘇秦空調(diào)凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)SM-CJ-2FD)；生化培養(yǎng)箱(上海恒一科學(xué)儀器有限公司，DHP-9272)。

2 中藥香囊的制備

取檀香、蒼術(shù)、艾葉、白芷、桂枝、石菖蒲等中藥材各等份，干燥后混合粉碎，稱量20.00g裝進(jìn)棉布袋，封好。

3 中藥香囊對(duì)空氣菌落總數(shù)的影響

3.1 培養(yǎng)基配制

分別取TSA 、SDA各 40.00g，分別加入1000mL純化水，加熱煮沸溶解，取直徑為9cm的平皿，加10mL培養(yǎng)基液平皿，121℃，100KPa，滅菌20min，得TSA、SDA兩種培養(yǎng)基。

3.2 實(shí)驗(yàn)方法

選擇94.5m3房間，將含TSB的培養(yǎng)皿放置在房間的四周和中央，關(guān)閉門門窗，將制好的TSA平板置于在離地84cm的空氣中30min后取出，記錄此時(shí)為0h。再于房間內(nèi)四個(gè)角落各放入兩個(gè)香囊，離地面高43cm，而后分別于1,2,4,6,8,12,48h放入平皿開蓋暴露30min后，取出，蓋好，置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h，平行三次，觀察細(xì)菌生長情況并計(jì)數(shù)分析。

3.3 結(jié)果分析

比較香囊在靜態(tài)空氣放置時(shí)間對(duì)空氣菌落的影響作用：計(jì)算公式：

每立方菌落數(shù)(cfu/m3)=5000N/A×T 。(A：平板面積(cm2);T：暴露時(shí)間(min);N：平均菌落數(shù)(cfu)。

香囊在靜態(tài)空氣放置時(shí)間長短對(duì)空氣菌落總數(shù)影響見圖1。

每立方菌落數(shù)以( X±S )cfu/m3表示，則0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、48h分別為12111±2416cfu/m3、9280±1604cfu/m3、7707±2354cfu/m3、6606±1541cfu/m3、5033±1900cfu/m3、4405±1901cfu/m3、4091±1821cfu/m3。依統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，空氣中細(xì)菌從1小時(shí)后平均數(shù)均顯著小于0h的每立方空氣細(xì)菌平均數(shù)(且P<0.05) ，表明中藥香囊對(duì)空氣細(xì)菌有抑制或殺滅作用。依數(shù)據(jù)作圖，可知隨香囊放置時(shí)間的增加菌落總數(shù)遞減，同時(shí)，由數(shù)據(jù)處理較看出隨著香囊放置的時(shí)間越長，細(xì)菌平均數(shù)越來越少，直到12h后，達(dá)到平衡。由此說明香囊在空間放置時(shí)間與細(xì)菌抑制作用成正相關(guān)，而這個(gè)正相關(guān)并不一直延伸，抑制作用有最終有一個(gè)平衡值。

(橫坐標(biāo)：放置時(shí)間(h)；縱坐標(biāo)：菌落總數(shù)據(jù))

4 中藥香囊對(duì)致病菌的抑制作用

4.1 菌株菌液配制

將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血鏈球菌用TSB斜面進(jìn)行復(fù)蘇，取對(duì)數(shù)生長期的各菌液接種于TSA斜面進(jìn)行保存，在37℃培養(yǎng)24h，以pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液洗下菌苔，經(jīng)梯度稀釋后，采用平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，菌液濃度調(diào)制<300cfu/mL。白色念珠菌以SDB培養(yǎng)基復(fù)蘇，對(duì)數(shù)生長期的的各菌液接于SDA斜面，同法制成白色念珠菌液。

4.2 香囊預(yù)處理

取“2項(xiàng)下”的香囊，于260nm紫外殺菌燈照射1h，備用。

4.3 實(shí)驗(yàn)菌液配制

取“4.1項(xiàng)下”各菌液1mL在加入不同帶15mL的培養(yǎng)基的平皿中，制得陽性對(duì)照和供試樣，取16mL SDA和TSA培養(yǎng)基，分別作為陰性1、陰性2。陽性對(duì)照和供試樣各18份，陰性1和陰性2各20分。

4.4 實(shí)驗(yàn)過程

用新潔爾滅(1:14)對(duì)0.50m3的超凈臺(tái)進(jìn)行消毒，并開啟層流凈化裝置和紫外燈照射30min后，放入兩個(gè)陰性樣空白，30min后取出，然后放入香囊、陽性樣、供試樣、陰1、陰2。分別于0,30,60,120,180,240,300min，取出陽性樣、供試樣、陰1、陰2各3份。

完成以上實(shí)驗(yàn)后，將各樣品于32.5℃下培養(yǎng)3天；含SDA培養(yǎng)基的樣品于25.5℃下培養(yǎng)5天。

4.5 結(jié)果

依統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析，陽性組與供試組各組時(shí)間相比較采用t檢驗(yàn)，得P<0.05，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明香囊中揮發(fā)性成份對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌有抑制作用。

依圖2、表1可看出，香囊揮發(fā)性成分與致病菌接觸到一定時(shí)間菌落總數(shù)下降明顯，因此用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)供試組中各接觸時(shí)間較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，得：腸供試30min與120min及其后三組時(shí)間對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05，金供試30min與180min及其后兩組時(shí)間對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05，銅供試30min與300min對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05，乙供試30min與300min對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05，說明香囊的揮發(fā)性成份與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌接觸時(shí)間長短會(huì)影響抑菌效果；白供試不同接觸時(shí)間之間t檢驗(yàn)P>0.05，隨著接觸時(shí)間的延長抑菌效果沒有顯著差異。

表1 香囊對(duì)致病菌的抑制作用結(jié)果

圖2 香囊揮發(fā)性成分對(duì)致病菌的影響

檢驗(yàn)結(jié)果所有供試組與陽性兩組組間差異P<0.05。大腸桿菌供試30min與120min及其后三組t檢驗(yàn)P<0.05；金黃色葡萄球菌供試30min與180min及其后兩組時(shí)間對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05，銅綠假單胞菌供試30min與300min對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05，乙型溶血性鏈球菌供試30min與300min對(duì)比t檢驗(yàn)P<0.05；白色念珠菌供試不同接觸時(shí)間之間t檢驗(yàn)P>0.05。

5 中藥香囊揮發(fā)性成分抑菌性研究

5.1 菌株菌液配制

菌液一：將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血鏈球菌用TSB進(jìn)行復(fù)蘇，取對(duì)數(shù)生長期的各菌液接種于TSA進(jìn)行保存，在37℃培養(yǎng)24h，以pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液洗下菌苔，經(jīng)梯度稀釋后，采用平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，菌液濃度調(diào)制< 10000cfu/mL。

菌液二：將白色念珠菌(白)用SDB培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，取對(duì)數(shù)生長期的各菌液接種于SDA斜面進(jìn)行保存，在37℃培養(yǎng)24h，以pH值7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液洗下菌苔，經(jīng)梯度稀釋后，采用平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，菌液濃度調(diào)制< 10000cfu/mL。

5.2 實(shí)驗(yàn)過程

5.2.1 準(zhǔn)備供試品

模擬香囊和香囊棉球香味揮發(fā)特點(diǎn)，利用濾紙法，研究香囊中中藥的揮發(fā)性成分對(duì)致病菌的抑制效果。

5.2.1.1 混合揮發(fā)油供試品

將檀香、桂枝、石菖蒲、蒼術(shù)、白芷、艾葉揮發(fā)油各100μL經(jīng)無菌濾過后，加入棕色試劑瓶，混勻，將滅菌過的直徑為6mm濾紙片試劑瓶，待濾紙潤濕后，取出，自然揮干，備用。

5.2.1.2 單方揮發(fā)油供試品

取檀香、石菖蒲、桂枝、白芷、蒼術(shù)、艾葉揮發(fā)油各600μl經(jīng)無菌濾過后，分別加入不同棕色試劑瓶，將滅菌過的直徑為6mm濾紙片分別裝入含不同揮發(fā)油的棕色試劑瓶，待濾紙潤濕后，取出，自然揮發(fā)5min后，備用。

5.2.2 菌液培養(yǎng)基配制

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血鏈球菌選TSA，白色念珠菌選SDA，取培養(yǎng)基20mL加入平皿，待培養(yǎng)基凝固后，加入對(duì)應(yīng)的菌液5mL，搖勻，各菌分供試平皿和陽性平皿；同法制作不含菌液的陰性平皿(平行三份)。

5.2.3 抑菌圈試驗(yàn)

混合揮發(fā)油，檀香揮發(fā)油、石菖蒲、蒼術(shù)揮發(fā)油、白芷揮發(fā)油、艾葉揮發(fā)油采用十字交叉法制做供試品。經(jīng)前期試驗(yàn)，桂枝樣品抑菌作用較強(qiáng)，需單獨(dú)用四個(gè)平皿做。用滅菌未沾揮發(fā)油的濾紙，同法制作陰性樣品(平行三份)。

5.3 結(jié)果與分析

結(jié)果顯示(見表2)，依實(shí)驗(yàn)方法下的制得含各種揮發(fā)油的濾紙片，對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌有抑制作用，其中除檀香揮發(fā)油外，混合揮發(fā)油、石菖蒲揮發(fā)油、白芷揮發(fā)揮發(fā)油、桂枝揮發(fā)油、艾葉揮發(fā)油、蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)大腸埃菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念珠菌有抑制作用。依表4揮發(fā)抑菌圈大小排序得，桂枝揮發(fā)油制得濾紙片抑對(duì)五種致病菌抑制作用最強(qiáng)，混合油第二，石菖蒲揮發(fā)油第三，蒼術(shù)揮發(fā)油、白芷揮發(fā)油、艾葉揮發(fā)油對(duì)五種致病菌抑制作用相當(dāng)，檀香在實(shí)驗(yàn)方法下對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌沒有抑制作用。

表2 香囊揮發(fā)性成分對(duì)致病菌的抑制作用

表3 揮發(fā)油抑圈大小排序

6 討論

6.1 依實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)條件下，中藥香囊對(duì)空氣細(xì)菌有抑制或殺滅作用。同時(shí)，由數(shù)據(jù)看出隨著香囊放置的時(shí)間越長，細(xì)菌平均數(shù)越來越少，直到12h后，達(dá)到平衡。由此說明香囊在空間放置時(shí)間與細(xì)菌抑制作用成正相關(guān)，而這個(gè)正相關(guān)并不一直延伸，抑制作用有最終有一個(gè)平衡值。

在對(duì)致病菌抑制方面，相對(duì)于沒有與香囊揮發(fā)性成分接觸的陽性樣品，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明香囊中揮發(fā)性成份對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌有抑制作用。同時(shí)，香囊揮發(fā)性成分與大腸接觸到一定時(shí)間菌落總數(shù)下降明顯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，說明香囊的揮發(fā)性成份與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌接觸時(shí)間長短會(huì)影響抑菌效果，而香囊與白色念珠菌接觸30min基本達(dá)到平衡。

由此說明，香囊在防病治病方面，其中一個(gè)機(jī)理是對(duì)致病菌的抑制作用。同時(shí)，由于香囊與大部分實(shí)驗(yàn)菌的接觸時(shí)間成正比關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

6.2 在現(xiàn)代文獻(xiàn)研究方面，香囊中各組分單方揮發(fā)油的抑菌性研究如下：檀香揮發(fā)油對(duì)幽門螺旋桿菌，白色念珠球菌、金黃色釀膿葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、克雷白氏桿菌，枯草芽胞桿菌、傷寒沙門氏桿菌、分支桿菌、腋菌、犬小孢子菌、須毛癬菌、紅色發(fā)癬菌、黑曲霉和煙曲霉等細(xì)菌和真菌有不同程度的抑制作用；桂枝揮發(fā)油能抑制多種細(xì)菌的生長，如大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒病菌、炭疽桿菌、肺炎球菌、霍亂弧菌、志賀痢疾桿菌等致病菌[17-18]；石菖蒲揮發(fā)油，對(duì)表皮葡萄球菌、A 群鏈球菌、福氏志賀菌抑菌，白色念珠菌及金黃色葡萄球菌有抑制作用，而對(duì)大腸埃希菌抑制作用的有無，不同文獻(xiàn)有一定的爭議[27-28]。蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、青霉、黑曲霉、黃曲霉、幽門螺旋桿菌有抑制作用，對(duì)沙門氏菌沒有抑制作用[43-44]；艾葉揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、銅綠假單孢菌、土生克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、炭疽桿菌、綠膿桿菌有抑制作用，而對(duì)巴氏桿菌、鏈球菌、沙門氏菌的抑菌效果不明顯[40-42]；文獻(xiàn)指出白芷脂溶性成分香豆素類成分對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、根霉、黑曲霉、釀酒酵母的抑菌效果明顯[30]，但現(xiàn)代文獻(xiàn)對(duì)白芷揮發(fā)性成分的抑菌性研究較少。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)除文獻(xiàn)所述的各揮發(fā)油抑菌作用外，檀香揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用；桂枝對(duì)銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念珠菌抑制作用；石菖蒲對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌有抑制作用；白芷對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念珠菌有抑制作用；蒼術(shù)對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型溶血性鏈球菌有抑制作用；艾葉揮發(fā)油對(duì)白乙型溶血性鏈球菌有一定抑制作用，填補(bǔ)了體外抑菌實(shí)驗(yàn)的空白。

6.3 對(duì)香囊中各組分的現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，各組分除了具有抑菌作用外，還具有其他功能如：檀香揮發(fā)性成份，可以抑制新斯的明導(dǎo)致的腸亢進(jìn)[3]，可以快速緩解突發(fā)性心絞痛的癥狀[4]；具有抗炎抗氧化抗腫瘤作用[5-7]，還具有降血糖、抗高血脂方面藥理作[8-9]。同時(shí)已經(jīng)得到多方面證實(shí)抗病毒方面藥理作用，現(xiàn)檀香揮發(fā)油已廣泛應(yīng)用于疣、瘢[10-16]。桂枝的揮發(fā)性成分有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抗過敏作用[18-20]。石菖蒲揮發(fā)性成分可以增加血腦屏障的通透性，能興奮中樞神經(jīng)作用；能保護(hù)心臟，降低血栓發(fā)生幾率；還具有抑制呼吸系統(tǒng)過敏作用、緩解支氣管平滑肌痙攣?zhàn)饔肹21-26]。蒼術(shù)早于1979年,Endo K等[31]已報(bào)道關(guān)其揮發(fā)油成分具有抗炎，因此對(duì)蒼術(shù)揮發(fā)油研究多在抗炎方面，現(xiàn)已明確其機(jī)制與抑制組織 PGE2生成有關(guān)[32]，蒼術(shù)揮發(fā)性還具有保肝、利尿作用和對(duì)中神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用[33-34]。還有文獻(xiàn)研究表明，蒼術(shù)揮發(fā)性成β-桉葉醇[35]抗缺氧能力。艾葉揮發(fā)性成分具有抗炎，抗過敏和鎮(zhèn)痛作用，抗肝纖維化作用， 抗疲勞作用，增加免疫力作用[36-39]。白芷揮發(fā)性成分具有抑制黑色素、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗驚厥、抗痙攣等藥理作用[29]。由此可見，中藥香囊除了對(duì)外界菌落有影響外，還能調(diào)節(jié)人本機(jī)，以達(dá)到防病治病的效果。