劉普恒,韓 輝,王宇虹

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科,哈爾濱 100081)

免疫衰老是老年人高發(fā)病率和高死亡率的核心機(jī)制之一。 廣泛潛伏在老年人群骨髓干細(xì)胞的人巨細(xì)胞病毒CMV,通過一個(gè)分化依賴的反復(fù)痕量激活機(jī)制,長(zhǎng)期誘導(dǎo)并累積T 細(xì)胞的免疫衰老[1]。由于CMV 的痕量激活起始于骨髓干細(xì)胞,且病毒潛伏的骨髓干細(xì)胞比例很低,潛伏態(tài)CMV 的激活表達(dá)量也很低[2-3],而且這些骨髓干細(xì)胞表面不產(chǎn)生任何CMV 相關(guān)抗原標(biāo)記物,這個(gè)痕量激活通過偶聯(lián)CD34+全能干細(xì)胞的分化[4-5],通過細(xì)胞內(nèi)的傳遞幾近 “無(wú)痕” 的到達(dá)樹突狀細(xì)胞(dendric cell,DC)。 樹突細(xì)胞中痕量激活的CMV,通過一個(gè)細(xì)胞-細(xì)胞間接觸的方式進(jìn)行抗原提呈,“沉默” 地誘導(dǎo)T 細(xì)胞發(fā)生CMV 特異性的免疫應(yīng)答[6]。 雖然這種應(yīng)答不能有效地清除CMV 潛伏庫(kù),但是骨髓內(nèi)的CMV 在普通人群中(無(wú)免疫缺陷) 啟動(dòng)大量激活而產(chǎn)生急性CMV 病。 通過潛伏態(tài)病毒和宿主的痕量反復(fù)互作,純真(na?ve)T 細(xì)胞的多樣性逐漸耗竭,“無(wú)效” 記憶效應(yīng)T 細(xì)胞克隆擴(kuò)增大量累積,伴隨每次痕量＄應(yīng)答產(chǎn)生的低水平炎性因子,構(gòu)成了一個(gè)漫長(zhǎng)的免疫衰老的核心進(jìn)程[6-8]。 由于該過程隱蔽,痕量,反復(fù),病毒-宿主互作,CMV 誘導(dǎo)免疫衰老的分子調(diào)控機(jī)制,一直是全球公認(rèn)的難題。 伴隨單細(xì)胞RNA 測(cè)序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) 技術(shù)的發(fā)展, 免疫衰老的CMV 誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制正逐漸被揭示。

1 骨髓潛伏態(tài)巨細(xì)胞病毒反復(fù)痕量的激活誘導(dǎo)外周血T 細(xì)胞免疫衰老的概述

全世界絕大部分人會(huì)在不知不覺中攜帶感染人巨細(xì)胞病毒,老年人群的攜帶率接近100%。 人巨細(xì)胞病毒(HCMV) 是一個(gè)擁有巨大DNA 基因組的皰疹病毒,它初次感染后,即在骨髓干細(xì)胞(稱為允許細(xì)胞/ Permissive cell) 中建立終生潛伏感染。潛伏態(tài)CMV 能通過一個(gè)痕量反復(fù)激活的機(jī)制,誘導(dǎo)宿主發(fā)生反復(fù)痕量的免疫應(yīng)答,累積形成免疫衰老,其主要累及T 細(xì)胞的適應(yīng)性免疫衰老。 免疫衰老是老年人高發(fā)病率和高死亡率的核心機(jī)制之一。傳統(tǒng)定義的病毒潛伏期,是在不產(chǎn)生子代病毒的情況下維持病毒基因組,但具有為隨后的幾輪復(fù)制而重新激活的能力。 在潛伏期中,病毒僅轉(zhuǎn)錄有限數(shù)量的病毒RNA,蛋白質(zhì)和microRNA。 人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)潛伏在骨髓干細(xì)胞中,具有干細(xì)胞分化依賴的基因累積表達(dá)特點(diǎn),它的潛伏期激活機(jī)制,更為復(fù)雜[9]。 在普通人群中,CMV 的痕量反復(fù)激活能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但是宿主無(wú)法識(shí)別清除病毒潛伏庫(kù),這種痕量激活也不能導(dǎo)致宿主發(fā)生急性疾病。 這種 “病毒―宿主” 之間存在的百萬(wàn)年共進(jìn)化, 產(chǎn)生了復(fù)雜的共生( Co-pathogen)機(jī)制。

CMV 在骨髓的痕量機(jī)會(huì), 伴隨全能干細(xì)胞(CD34+CD14-)分化為單核系前驅(qū)/ 祖細(xì)胞(CD34+CD14+),并且繼續(xù)分化為單核/ 樹突細(xì)胞( CD34-CD14+)[9-10]的過程[5,11]。 大型DNA 病毒CMV 就是通過這種近乎完美的免疫逃避機(jī)制[12],將病毒從潛伏庫(kù)干細(xì)胞,傳遞至到抗原提呈DC 細(xì)胞/ 單核細(xì)胞中。 而且,骨髓干細(xì)胞中的CMV 潛伏細(xì)胞比例很低,應(yīng)用PCR 結(jié)合原位雜交技術(shù),預(yù)測(cè)其潛伏細(xì)胞陽(yáng)性率約為1 ∶10000 ～25000,每個(gè)潛伏感染細(xì)胞的CMV 拷貝數(shù)為2 ～13 個(gè)基因組[13]。 即使應(yīng)用基于單細(xì)胞的高敏感數(shù)字PCR,能提高人群的的陽(yáng)性率,使接近一半的HCMV 潛伏攜帶的骨髓干細(xì)胞中檢測(cè)到病毒基因組,但是細(xì)胞基因組的檢測(cè)陽(yáng)性率,也少于10 / 10000 個(gè)細(xì)胞[14]。 此外,通過檢測(cè)外周血中極少量干細(xì)胞來(lái)源的CD14+CMV 潛伏細(xì)胞中的CMV 基因載量,并未發(fā)現(xiàn)CMV 潛伏感染率的年齡相關(guān)[14],這提示潛伏態(tài)CMV 的痕量激活量,是一個(gè)與宿主免疫功能息息相關(guān)的互作機(jī)制。 目前的研究結(jié)果顯示,潛伏態(tài)CMV 在分化偶聯(lián)的痕量激活過程中,未檢測(cè)到足夠量的病毒轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達(dá)(無(wú)法通過普通PCR 或者Western blot 檢測(cè)到),也未檢測(cè)到細(xì)胞表面表達(dá)的病毒特征性蛋白(無(wú)法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)),這為潛伏態(tài)CMV 痕量反復(fù)激活誘導(dǎo)免疫衰老的機(jī)制,提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

2 骨髓潛伏態(tài)巨細(xì)胞病毒痕量反復(fù)激活體外實(shí)驗(yàn)的單細(xì)胞研究進(jìn)展

CMV 的潛伏庫(kù)建立在骨髓全能造血干細(xì)胞中,而骨髓造血干細(xì)胞是一個(gè)具有動(dòng)態(tài)分化程序的異質(zhì)細(xì)胞群,而且對(duì)體外刺激很敏感。 這些CD34+造血干細(xì)胞分化依賴的細(xì)胞群中,僅很小一部分?jǐn)y帶CMV 轉(zhuǎn)錄本, 且始終伴隨干細(xì)胞的分化, 潛伏態(tài)HCMV 逐步發(fā)生了痕量復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化。 由于骨髓潛伏態(tài)CMV 的病毒載量和表達(dá)水平均極低,加上攜帶CMV 基因組的骨髓細(xì)胞群具有動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn),宿主的免疫功能又顯著影響 “病毒-宿主” 的互作模式,因此,應(yīng)用單細(xì)胞RNA 測(cè)序進(jìn)行CMV 基因表達(dá)的探索,具有突破的意義。 一個(gè)單細(xì)胞測(cè)序分析數(shù)據(jù)顯示,25 名CMV 血清陽(yáng)性的造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本庫(kù)(1.5×1010序列),未能成功比對(duì)獲取CMV序列[15]。 進(jìn)一步比對(duì)基因組織表達(dá)( Genotype-Tissue Expression / GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù),一個(gè)收集人類健康尸檢組織RNA 測(cè)序信息的數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)31 個(gè)組織549 個(gè)樣本(> 4.33 ×1012核苷酸)進(jìn)行CMV 序列比對(duì),僅從40 個(gè)樣本中比對(duì)得到了潛伏期激活基因( Immediate Early / IE ) 基 因 的 序 列[15]。 體 外 對(duì)3.655 個(gè)原代感染CMV 的CD14+細(xì)胞進(jìn)行經(jīng)時(shí)(time-dependent)單細(xì)胞測(cè)序,分別構(gòu)建宿主和病毒轉(zhuǎn)錄本庫(kù),發(fā)現(xiàn)CMV 的痕量激活僅發(fā)生在一個(gè)特定表達(dá)細(xì)胞集落刺激因子的細(xì)胞亞群,這些細(xì)胞富含線粒體激活基因,細(xì)胞增殖基因,RNA 加工基因和蛋白質(zhì)合成基因,且始終保持較高轉(zhuǎn)錄水平;同時(shí),干擾素相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào),提示CMV 發(fā)生集落刺激和分化誘導(dǎo)的激活[16]。 此外,這些單細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示CMV 從早期痕量表達(dá)狀態(tài)逐漸演進(jìn)為病毒裂解和大量表達(dá),是否存在一個(gè)演進(jìn)門檻值需要深入研究[15]。 需要指出的是,體外原代感染的CD14+細(xì)胞,主要顯示骨髓干細(xì)胞分化偶聯(lián)的從痕量潛伏期過渡至大量激活期的轉(zhuǎn)錄本的后期過程,無(wú)法模擬慢性潛伏態(tài)CMV 分化偶聯(lián)的痕量激活轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)[15]。 Galinato 等[16]對(duì)原代感染的7.000 個(gè)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)干細(xì)胞中檢測(cè)到了CMV 的DNA 序列,表明病毒的入侵潛伏不受限制,其激活可能受到宿主的限制。 Shnayder 等[17]分別檢測(cè)了造血干細(xì)胞(HSPC)和多系祖細(xì)胞中的CMV 轉(zhuǎn)錄本,證實(shí)CMV 轉(zhuǎn)錄僅在造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞祖細(xì)胞中檢測(cè)得到,且與宿主抗病毒免疫應(yīng)答降低有關(guān)。 這些單細(xì)胞RNA 測(cè)序數(shù)據(jù),明確了潛伏態(tài)CMV 干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的痕量激活機(jī)制。

3 巨細(xì)胞病毒激活誘導(dǎo)外周血免疫衰老的單細(xì)胞水平研究進(jìn)展

T 細(xì)胞受體(TCR)提供的抗原特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞,是宿主抗病毒的核心機(jī)制。 這些TCR 多樣性通過一個(gè)建立在基因重排基礎(chǔ)上的單個(gè)細(xì)胞抗原特異性受體儲(chǔ)備庫(kù)實(shí)現(xiàn)。 因此,TCR 多樣性儲(chǔ)備的逐漸降低,是T 細(xì)胞免疫衰老的核心機(jī)制。 巨大DNA 病毒CMV 的痕量反復(fù)激活,能誘導(dǎo)產(chǎn)生外周血最龐大的TCR 記憶效應(yīng)T 細(xì)胞克隆擴(kuò)增。Atsushi 等利用熒光標(biāo)記的抗原肽四聚體技術(shù),結(jié)合高識(shí)別度單細(xì)胞微矩陣,篩選人CMV 的抗原特異性TCRβ 儲(chǔ)備庫(kù),獲取了外周血比例約0.05% ～8.5%的CMV-pp65 克隆擴(kuò)增[18]。 檢測(cè)感染鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)的小鼠脾以及腸道淋巴組織中病毒特異性T 細(xì)胞,得到了MCMV 特異性記憶效應(yīng)CD8+T 細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜[19],這些腸道淋巴組織內(nèi)的循環(huán)CD8+T 記憶細(xì)胞(TPM)克隆擴(kuò)增相關(guān)基因(KLRC1,KLRK1(NKG2D),KLRG1,CX3CR1) 以及常駐記憶T 細(xì)胞( resident memory T-cells ( TRM), S1PR1,S1PR5,ITGAE,KLRG1) 相關(guān)基因存在交互表達(dá)。與循環(huán)記憶T 細(xì)胞高表達(dá)CX3CR1 而不表達(dá)KLRG1 相比,CMV 抗原激活的T 細(xì)胞克隆顯示出相對(duì)靜止( activated yet resting) 的免疫衰老相關(guān)特點(diǎn),即高表達(dá)KLRG1 和CX3CR1。 通過外周血TCR的單細(xì)胞數(shù)據(jù),進(jìn)一步證實(shí)了CMV 反復(fù)痕量激活誘導(dǎo)T 細(xì)胞免疫衰老的特點(diǎn)[19]。 研究者比較了潛伏感染MCMV 的老年小鼠和無(wú)MCMV 潛伏的老年鼠針對(duì)新抗原( OVA) 的特異性CD8+T 細(xì)胞受體β(TCRβ)轉(zhuǎn)錄本,克隆擴(kuò)增多樣性最廣泛的宿主,是老年MCMV 潛伏感染小鼠,這些小鼠識(shí)別新抗原肽的能力更高;老年MCMV 潛伏感染的小鼠發(fā)生了針對(duì)OVA 的強(qiáng)烈適應(yīng)性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答,而無(wú)MCMV潛伏感染的小鼠,其TCR 多樣性明顯降低。 這些單細(xì)胞數(shù)據(jù)提示,潛伏態(tài)CMV 痕量反復(fù)激活可能對(duì)老年人群的適應(yīng)性免疫發(fā)揮 “疫苗樣” 積極影響,證實(shí)了與宿主長(zhǎng)期共進(jìn)化的病毒與宿主衰老之間的復(fù)雜關(guān)系[20]。 另一個(gè)單細(xì)胞RNA 測(cè)序研究則顯示,針對(duì)新抗原入侵的高親和力TCR 在TCR 組譜(TCR repertoire)中優(yōu)先擴(kuò)增,這種進(jìn)化依賴的親和力適應(yīng)性,能被潛伏態(tài)CMV 的反復(fù)痕量激活削減[21]。 因此,為了揭示宿主共進(jìn)化CMV 的終身潛伏激活,宿主TCR 多樣性和TCR 親和力,以及新抗原入侵的T細(xì)胞免疫應(yīng)答之間的關(guān)系,需要更多基于單細(xì)胞RNA 測(cè)序的研究數(shù)據(jù)。 外周血人類自然殺傷(NK)細(xì)胞也在免疫衰老中也發(fā)揮重要作用,由于NK 的功能細(xì)胞表型非常復(fù)雜,通過對(duì)NK 細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,能獲取伴有或不伴有CMV 潛伏感染的NK細(xì)胞表型差異表達(dá)譜。 CMV 的潛伏感染能顯著改變NK 細(xì)胞的功能集簇,提高適應(yīng)性NK 亞群的比例,誘導(dǎo)CMV 適應(yīng)性的NK 應(yīng)答[22]。

4 針對(duì)骨髓CMV 潛伏感染調(diào)控機(jī)制的單細(xì)胞研究展望

通過單細(xì)胞的研究,研究者發(fā)現(xiàn)骨髓CMV 潛伏期的轉(zhuǎn)錄,其實(shí)并非休眠和沉默[1,23],越來(lái)越多的CMV 潛伏期轉(zhuǎn)錄信息通過單細(xì)胞技術(shù)的改良而獲得。 需要指出的是,普通單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)僅提供基因表達(dá)的 “快照”,無(wú)法動(dòng)態(tài)傳達(dá)轉(zhuǎn)錄的過程,而且每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的RNA 譜只能分析一次,因此,大部分體外原代感染的CD14+細(xì)胞內(nèi)未測(cè)到CMV 的基因表達(dá)(< 0.1% HCMV 讀數(shù))。 這個(gè)結(jié)果或提示CMV 基因組受到高度抑制,或者提示該細(xì)胞并未被感染,因?yàn)楣撬韪杉?xì)胞中的CMV 細(xì)胞陽(yáng)性率很低。同時(shí), CD34+干細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)錄水平, 顯著低于CD14+細(xì)胞,提示骨髓干細(xì)胞能抑制CMV 的激活。為了鑒別低水平CMV 轉(zhuǎn)錄本是 “ 真正的” 的零轉(zhuǎn)錄,還是初始潛伏在干細(xì)胞病毒拷貝比例低,需要?jiǎng)討B(tài)比較CD34+干細(xì)胞與CD14+單核細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜。 這種同時(shí)描繪病毒和宿主異質(zhì)性的單細(xì)胞RNA 測(cè)序平臺(tái),能夠揭示宿主細(xì)胞環(huán)境與病毒基因表達(dá)之間的功能聯(lián)系,已經(jīng)用于多個(gè) “ 宿主-病毒” 互作研究,對(duì)宿主免疫應(yīng)答的復(fù)雜性和病毒的細(xì)胞允許性,提出了很多新穎的見解[16,24-30]。

需要指出的是,針對(duì)無(wú)偏見轉(zhuǎn)錄組的單細(xì)胞測(cè)序敏感度,需要細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄≥50000 個(gè)核苷酸序列[31],很多病毒低水平激活達(dá)不到這個(gè)水平。 骨髓CMV 的痕量激活轉(zhuǎn)錄組,甚至低于1.0000 個(gè)核苷酸,這導(dǎo)致單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)稀疏( sparsity of the data), 即零讀數(shù)的占比( proportion of zero read counts)過高[32-33]。 “稀疏” 的病毒轉(zhuǎn)錄本很可能因?yàn)榈拓S度表達(dá)而 “ 被棄( dropouts)”[32]。 通過基于單細(xì)胞的液滴樣數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,DDPCR),理論能夠測(cè)到低于100 個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本,從而檢測(cè)到極低水平的核苷酸拷貝數(shù)[34]。 然而,單細(xì)胞測(cè)序,無(wú)論單細(xì)胞RNA 測(cè)序,還是單細(xì)胞DDPCR,均存在固有的隨機(jī)性,需要加強(qiáng)樣品的質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)化。 基于唯一分子標(biāo)識(shí)符(UMI) 技術(shù),理論上可以消除測(cè)序深度偏差[35],但是UMI 仍然無(wú)法解決捕獲效率或細(xì)胞mRNA 含量差異的問題。

伴隨單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的迭代,用光反應(yīng)核苷類似物(4sU) 進(jìn)行核苷代謝標(biāo)記(U-to-C conversion)的單細(xì)胞測(cè)序(scSLAM-seq),通過區(qū)分生化核苷代謝程度(轉(zhuǎn)錄順序的早晚),對(duì)每個(gè)細(xì)胞中數(shù)千個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性(核苷生化代謝程度) 和表達(dá)差異進(jìn)行同步可視化。 用scSLAM-seq 動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠成纖維細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒原代感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本,能建立宿主轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)( TBP-TATA-box 相互作用和DNA 甲基化)相關(guān)的基因表達(dá)差異,通過RNA 轉(zhuǎn)錄時(shí)間(新舊程度)推斷細(xì)胞周期狀態(tài),結(jié)合病毒感染劑量,獲取由CMV 感染誘導(dǎo)所致的單個(gè)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性,得到病毒相關(guān)的宿主轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù),是目前針對(duì)CMV 轉(zhuǎn)錄的最全面數(shù)據(jù)[36]。 總之,單細(xì)胞測(cè)序研究平臺(tái)的發(fā)展和迭代,為揭示潛伏態(tài)CMV痕量反復(fù)激活誘導(dǎo)免疫衰老的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制,展示了光明的前景。