李桂娟，夏偉，羅海希，程桂茹

（1海南科技職業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，海南?？?71126；2長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林長春130012）

椰殼含豐富的纖維，是椰子的副產(chǎn)物，具有可再生、來源豐富、價格低廉等優(yōu)勢，是納米纖維素晶須（NCW）制備的原料來源之一。納米纖維素晶須從結(jié)構(gòu)上看，是除去被水解的纖維素非晶部分后剩下的結(jié)晶部分，因此具有較高的結(jié)晶度和優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì)，其強度和彈性模量比普通纖維素呈指數(shù)級的增加，而且納米纖維素晶須還具有生物可降解性[1-2]。因此，自Favier 等[3]第一次將NCW作為增強相制備納米復(fù)合材料后，引起人們的高度關(guān)注，后來的研究者相繼制備了納米纖維素晶須增強的高分子復(fù)合材料[4-7]。納米纖維素晶須作為復(fù)合材料的添加劑，可以改善和提高材料的力學(xué)性能[8-10]。聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol)，PVA]和殼聚糖（chitosan，CS）都是醫(yī)用生物大分子材料，二者均具有生物相容性和生物可降解性，而且無毒，可以為組織的生長提供良好的條件，作為醫(yī)用材料一直受到關(guān)注[11-13]。為改善CS力學(xué)性能和可塑性差的不足，將力學(xué)性能優(yōu)良的PVA 與CS 共混制備復(fù)合材料[14-17]，將二者共混可發(fā)揮各自的特點，優(yōu)勢互補。為提高PVA/CS 復(fù)合材料的綜合性能，Xu 等[18]制備了納米纖維素晶體（CNC）增強的纖維膜，研究表明纖維膜的力學(xué)性能得到明顯提高。王棟等[19]將納米纖維素晶體（CNC）作為增強劑，通過靜電紡制備了纖維素納米晶須/殼聚糖-聚乙烯醇纖維，由于纖維素納米晶須未能充分分散在CS-PVA基體中，使得電紡過程中射流不穩(wěn)定，導(dǎo)致劈裂等問題，從而影響材料的性能。林鳳采等[20]研究表明，納米纖維素（CNF）是無規(guī)則的隨機分布的，通過溶液共混制備的復(fù)合材料，力學(xué)性能產(chǎn)生差異，作為增強相的纖維素納米纖維如果在基體中分布不均勻，會導(dǎo)致復(fù)合材料力學(xué)性能隨著CNF 含量的增大而降低。眾所周知，納米粒子由于尺寸效應(yīng)，常以團聚狀態(tài)存在，納米纖維素作為材料的添加劑，若不能夠均勻分散于復(fù)合材料中或與基體材料的極性不同，將會影響其與復(fù)合材料的均勻混合和基體的相容性，也會影響材料的力學(xué)性能。關(guān)于PVA/CS 復(fù)合材料的細胞相容性的研究報道相對較少[21-22]，而偶聯(lián)劑改性納米纖維素晶須增強PVA/CS復(fù)合材料進行細胞相容性的研究未見報道。

本文以海南產(chǎn)椰殼纖維為原料，制備了椰殼納米纖維素晶須，并對纖維素晶須進行偶聯(lián)改性，作為增強劑加入到CS、PVA 共混溶液中，制備了改性納米纖維素晶須-殼聚糖/聚乙烯醇復(fù)合膜。對膜的性能進行測試分析，將小鼠成纖維細胞在膜上培養(yǎng)，觀察和比較細胞在不同膜材料的黏附和增殖，研究了復(fù)合膜的綜合性能和細胞相容性，為其在醫(yī)用敷料和組織工程支架材料等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

CS，脫乙酰度＞95%，浙江澳興生物技術(shù)有限公司；聚乙烯醇（PVA1799），醇解度為98%～99%，阿拉丁試劑有限公司；椰殼，購于?？谑修r(nóng)貿(mào)市場；氫氧化鉀（AR 級），次氯酸鈉水溶液（AR 級，質(zhì)量分數(shù)≥8%），過氧化氫（AR 級），冰乙酸（AR級），均為西隴科學(xué)股份有限公司；硅烷偶聯(lián)劑（KH570），南京創(chuàng)世化工助劑有限公司；L929 細胞，美國，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；噻唑蘭（MTT），美國Amresco 公司；胎牛血清，美國GIBCO 公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma 公司；雙抗，美國HyClone；DMEM（高糖），北京?？寺?；胰蛋白酶，美國Invitrigen公司。

1.2 儀器及測試

采用美國PE儀器公司的Spectrum400型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）對制備的膜材料進行測試，掃描范圍500～4000cm-1。采用日本理學(xué)公司D-MAX2200VPC 型的X 射線衍射儀（XRD）測試，CuKα，管壓40kV，管流40mA，步長0.02°，掃描速率4°/min，2θ為5°～50°。采用KYKY SBC-12型離子濺射儀對膜進行噴金，Thermoscientific apero S型掃描電子顯微鏡（SEM）進行膜表面形貌觀察，加速電壓300V。采用日本JEM-1011型透射電子顯微鏡（TEM）進行形貌觀察，將改性前后的納米纖維素晶須分散在去離子水中，超聲分散，分散液滴在銅網(wǎng)上，在電子顯微鏡下觀察納米纖維素晶須的分散情況。采用布魯克Bruker Edge 原子力顯微鏡在接觸模式下掃出材料表面的形貌圖。采用美國PERKIN-FLMER 公司DSC-7 型示差掃描量熱儀（DSC）進行膜材料測試，樣品用量6～8mg，氮氣氣氛保護，升溫速率10℃/min，降溫速率30℃/min，溫度為50～300℃。采用德國耐馳儀器制造有限公司STA409PC 型熱重分析儀進行膜材料TG 測試，氮氣流下以10℃/min 升溫至500℃，樣品量5～10mg。溫度為50～500℃。采用日本SHIMASH公司AG-1型電子式萬能試驗機測試膜材料的力學(xué)性能，按照GB 1040—79 測試，每組進行5 次平行實驗，拉伸速度為50mm/min，用統(tǒng)計學(xué)方法進行分析。采用德國KRUSS DSA30I型光學(xué)接觸角測試儀測試膜親水性，同一張膜上隨機選取四個點以蒸餾水靜滴進行測試，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。酶標儀，Synergy HT，美國BioTek 公司。培養(yǎng)箱，311型，美國Thermo fisher；超凈臺，SW-CJ-1F 型，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 椰殼纖維素晶須的制備

將干燥的椰殼切至3～5cm，按固液比1g∶10mL放入蒸餾水中，80℃下浸煮2h，洗滌，過濾，干燥。按固液比1g∶10mL 將干燥后的椰殼纖維浸入NaClO 和H2O2（體積比為3∶4）溶液中進行脫色，超聲3h，過濾，洗滌至濾液為中性，干燥。按30mL∶8g 稱取NaClO 和KOH，配置成200mL 溶液，將脫色后纖維放入溶液中，80℃超聲震蕩15h，離心，透析2天，將透析后懸浮液冷凍干燥，得到椰殼納米纖維素晶須NCW。

1.4 椰殼纖維素晶須表面改性

按1∶50（體積比）稱取硅烷偶聯(lián)劑KH570，加入到95%乙醇中，乙酸調(diào)節(jié)pH為4～5，磁力攪拌15min，然后加入0.3%納米纖維素晶須，30℃超聲攪拌2h，得到改性納米纖維素晶須混懸液，冷凍干燥，得到改性納米纖維素晶須（modified nano cellulose whisker），標記為MNCW。

1.5 改性納米纖維素晶須的分散性

將CS 溶于1%乙酸溶液制備成2%的CS 溶液（質(zhì)量分數(shù)），60℃磁力攪拌至溶解。將PVA 溶于1%乙酸溶液制備成2%的PVA 溶液（質(zhì)量分數(shù)），30℃磁力攪拌至溶解，按照CS/PVA 的體積比為3/7，量取CS和PVA溶液，混合后在60℃磁力攪拌至均勻。將質(zhì)量分數(shù)為3%的MNCW溶于上述混合液，攪拌均勻、靜置脫泡，澆筑法制膜，自然干燥得到MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜。同時制備了PVA 膜、CS 膜、CS/PVA 膜，將四種膜放入1mol/L 的NaOH溶液中浸泡處理，用蒸餾水充分洗滌，自然干燥。

1.6 細胞增殖實驗

分 別取PVA 膜、CS 膜、CS/PVA 膜、MNCWCS/PVA膜各18片，剪成直徑7mm圓片，膜兩側(cè)用紫外線消毒40min，然后用PBS 緩沖液清洗3 次，每次10min，吸干，放入96孔板中，每孔分別加入培養(yǎng)基高糖DMEM100μL浸泡2h，吸出培養(yǎng)基，取呈對數(shù)生長期的L929 細胞用2.5g/L 胰酶消化后，計數(shù)，每孔加入100μL含有3×103個L929細胞的培養(yǎng)液，4h 后每孔再加入100μL 的DMEM 培養(yǎng)液，在標準條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1天、3天、5天的時間點，每組隨機抽取6孔，吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗3 次，每孔加入20μL，5mg/mL 的MTT，放回孵箱繼續(xù)孵育4h 后終止培養(yǎng)，吸除上清液，每孔加入150μL的DMSO，放回培養(yǎng)箱再孵育5min后取出，用酶標儀在490nm波長下測定OD值。

1.7 細胞黏附實驗

實驗方法同1.6 節(jié)，不同的是用2.5g/L 胰酶消化后，計數(shù)，每孔加入100μL含有3×105個L929細胞的培養(yǎng)液，4h 后每孔再加入200μL 的DMEM 培養(yǎng)液分別在培養(yǎng)的1h、3h、5h 的時間點隨機抽取一組。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素晶須表面改性

纖維素晶須是具有較大長徑比的納米材料，比表面積大，表面活性高，羥基多，在氫鍵作用下常以團聚狀態(tài)存在，作為復(fù)合材料添加劑，如果在基體中分散不均勻，將會影響復(fù)合材料的力學(xué)性能。為了達到均勻分散的效果和提高其與聚合物之間的結(jié)合力，降低其表面極性，本實驗利用硅烷偶聯(lián)劑KH570 對纖維素晶須進行了表面改性，以提高其在混合物中的分散性，這樣不僅能夠改善納米纖維在基體中的分散效果，還可以改善纖維素晶須與基體間的界面性能[1]。圖1 是改性前后纖維素晶須在1%乙酸溶液中靜置一定時間后的分散狀態(tài)?？梢钥吹剑唇?jīng)改性的納米纖維素晶須在溶劑中出現(xiàn)了沉淀現(xiàn)象，改性后的纖維素晶須則保持均勻分散的懸浮狀態(tài)。圖2為改性后納米纖維素晶須的透射電鏡照片，未改性的納米纖維素晶須大部分處于團聚狀態(tài)，改性后則分散性較好。這是因為改性過程中硅烷偶聯(lián)劑先是水解，然后形成硅羥基，進一步發(fā)生脫水縮合，再與纖維素晶須表面上的羥基發(fā)生鍵合作用[23]。由于纖維素晶須表面的 OH 部分被 ONO 基團取代，使纖維素的表面被硅烷偶聯(lián)劑包覆，減少了納米纖維素晶須之間氫鍵作用，降低了纖維素晶須間的團聚和重力沉淀，所以能均勻分散和穩(wěn)定懸浮。從圖2中可見納米纖維素晶須長度約200nm，直徑約10～15nm。

圖1 NCW在溶劑中的分散情況

圖2 改性后纖維素晶須透射電鏡照片

2.2 改性前后納米纖維素晶須FTIR分析

圖3是改性前后纖維素晶須的紅外光譜圖。在改性后的MNCW 譜圖中，位于3310cm-1的吸收峰是羥基締合峰，2923cm-1處的吸收峰是的伸縮振動峰，位于1375cm-1處的兩個吸收峰分別是和的彎曲振動峰，1025cm-1是的伸縮振動峰，896cm-1的吸收峰為C H的彎曲振動峰和伸縮振動峰。均為納米纖維素晶須的特征峰[23]。1025cm-1處是C O 伸縮振動峰和鏈狀伸縮展動的特征吸收峰重疊，峰形較尖銳，在3310cm-1和2923cm-1的吸收峰與NCW 相比峰形收窄，可能是KH570 的羥基和納米纖維素的羥基之間形成了強烈的氫鍵。在1025cm-1處的吸收峰較強，所以較難辨認和的吸收峰[24]，在1732cm-1處出現(xiàn)了雙鍵伸縮振動吸收峰，1598cm-1處出現(xiàn)了的伸縮振動吸收峰，烷基化后吸收峰明顯增強，原因是KH570 中含有和，說明烷基化后納米纖維素晶須表面有KH570 存在，與納米纖維素晶須的吸收峰疊加后導(dǎo)致吸收峰增強，表明KH570 已接枝到NCW表面。

圖3 改性前后纖維素晶須紅外光譜圖

2.3 復(fù)合膜FTIR分析

圖4 為PVA 膜、CS 膜、CS/PVA 復(fù) 合 膜、MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜的紅外光譜圖，在CS 膜的紅外光譜圖中，3287cm-1處是CS 分子中鍵與鍵的伸縮振動峰，2923cm-1處為CS 分子中C H 鍵的伸縮振動峰，1552cm-1的吸收峰歸屬于酰胺Ⅱ帶的吸收峰[25]。PVA 膜中的3262cm-1和2923cm-1處的兩個吸收峰分別為和的伸縮振動峰，1090cm-1處為PVA 分子中C OH 鍵伸縮振動峰。CS/PVA 復(fù)合膜和MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜的紅外光譜圖相似，1699cm-1處的酰胺吸收峰強度減弱，3262cm-1的吸收峰歸屬于和的吸收振動峰收窄，并向低波數(shù)方向移動，表明CS分子與PVA之間存在著較強的氫鍵作用。

圖4 四種膜的紅外光譜圖

2.4 復(fù)合膜的結(jié)晶行為

圖5 為PVA 膜、CS 膜、CS/PVA 復(fù) 合 膜、MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜的XRD 譜圖，純CS 膜的X射線衍射圖譜與文獻報道一致[26]，衍射峰分別出現(xiàn)在2θ為19.41°和21.29°處，PVA 為高結(jié)晶性高分子，PVA 膜 的 衍 射 峰 分 別 出 現(xiàn) 在2θ為9.35°，21.29°，23.7°，26°，28.6°，36.1°處，從CS/PVA復(fù)合膜的XRD曲線中可以看到，CS和PVA的特征結(jié)晶峰強度減弱，只有19.41°和21.29°處的峰可見，其他峰幾乎消失。說明膜的各組分之間存在著較強的相互作用，使晶體結(jié)構(gòu)受到影響，從而使結(jié)晶度下降。與CS/PVA復(fù)合膜相比較，加入MNCW后，MNCW-CS/PVA復(fù)合膜的結(jié)晶行為有顯著提高，結(jié)晶峰強度增強，在CS/PVA 復(fù)合膜中消失的結(jié)晶峰都顯現(xiàn)出來。這可能是MNCW本身具有高結(jié)晶度，同時在與CS 和PVA 共混中起到異相成核的作用。通過計算PVA 膜結(jié)晶度為34.18%，CS 膜結(jié)晶度為20.36%， CS/PVA 復(fù)合膜結(jié)晶度為15.31%，MNCW-CS/PVA復(fù)合膜結(jié)晶度為17.85%。

圖5 四種膜的XRD曲線

2.5 復(fù)合膜的熱性能

2.5.1 DSC分析

圖6 為PVA 膜、CS 膜、CS/PVA 和MNCW-CS/PVA復(fù)合膜的DSC曲線。從圖6中可見，PVA膜的熔點Tm為246.4℃，CS膜的熔點Tm為143.6℃，二者混合后復(fù)合膜熔點Tm為238.7℃，加入MNCW 后，MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜熔點Tm為239.9℃，表明MNCW加入后，復(fù)合膜的熱性能有所提高。

圖6 四種膜的DSC曲線

2.5.2 TG-DTG分析

圖7 四種膜的TG-DTG曲線

圖7 為CS 膜、PVA 膜、CS/PVA 和MNCW-CS/PVA復(fù)合膜的TG-DTG曲線。由圖7可以看出，四種膜失重有兩個階段，第一階段發(fā)生在200℃之前，在120℃附近，四個樣品膜都有少量失重，分析可能是膜中少量自由水的蒸發(fā)及未脫除的微量乙酸揮發(fā)，表明膜在此溫度下是穩(wěn)定的，不發(fā)生分解。第二階段是膜的降解，這部分損失的質(zhì)量歸因于聚合物主鏈的降解，CS 最大失重速率對應(yīng)的分解溫度為287.39℃，PVA最大失重速率對應(yīng)的分解溫度為307.60℃，CS/PVA 最大失重速率對應(yīng)的分解溫度為284.82℃，MNCW-CS/PVA 最大失重速率對應(yīng)的分解溫度為294.88℃，可見，加入纖維素晶須使復(fù)合膜的熱分解溫度提高約10℃。表明添加MNCW后膜熱穩(wěn)定性提高，與DSC 分析結(jié)果相同。熱穩(wěn)定提高歸因于硅烷偶聯(lián)劑的一端水解后的硅醇與納米纖維素表面的羥基發(fā)生了反應(yīng)，另一端與大分子CS和PVA的形成化學(xué)結(jié)合，偶聯(lián)劑作為一種橋梁，實現(xiàn)納米纖維素和高分子基體形成較強的交聯(lián)作用[27]，一定程度改善了復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性。

2.6 力學(xué)性能分析

復(fù)合膜作為醫(yī)用支架材料或敷料，要具有一定的力學(xué)性能。表1為MNCW-CS/PVA復(fù)合膜的力學(xué)性能數(shù)據(jù)，加入MNCW 后復(fù)合膜的拉伸強度和彈性模量分別提高了5.7%和31.9%。斷裂伸長率則下降，這可能是因為改性后的MNCW 能夠在CS/PVA 共混液中均勻分散，形成了具有三維網(wǎng)絡(luò)的納米復(fù)合結(jié)構(gòu)[28]，提高了CS 與PVA 的分子間氫鍵作用點，使CS 與PVA 的相互作用加強，使復(fù)合膜的拉伸強度和彈性模量提高。

表1 復(fù)合膜的力學(xué)性能數(shù)據(jù)

2.7 水接觸角和復(fù)合膜形貌分析

水接觸角大小可表明材料潤濕性能，細胞的黏附與材料表面的親、疏水性能有著密切的關(guān)系，對膜材料表面進行接觸角測試可以分析其親水性能。從圖8中可以看出，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析后，PVA膜的接 觸 角 為（90.3°±0.30°），CS 膜 的 接 觸 角 為（83.6°±0.22°），CS/PVA膜的接觸角為（70.6°±0.31°），MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜的接觸角為（68.7°±0.31°），可見，采用硅烷偶聯(lián)劑KH570 改性納米纖維素，可降低MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜的接觸角，即增加了MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜的潤濕性。即MNCW 的加入，使CS/PVA 復(fù)合膜的親水性得到提高。一般認為，材料潤濕性能與材料的表面粗糙度有關(guān)。圖9(a)和圖9(b)分別為CS/PVA 復(fù)合膜、MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜掃描電鏡照片，圖10(a)和圖10(b)分別為CS/PVA 復(fù)合膜、MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜原子力顯微鏡照片，從圖中可以看到，加入納米纖維素晶須后，CS/PVA 膜的表面粗糙度增加了，即粗糙度越大，接觸角越小。也可能是MNCW 的加入，增強了水和極性羰基之間的相互作用，復(fù)合材料潤濕性的提高有助于細胞的黏附和增殖。

圖8 四種膜與水接觸角的圖像

2.8 細胞形貌分析

圖11 分別是小鼠成纖維細胞L929 在CS 膜、PVA 膜、CS/PVA 復(fù) 合 膜、MNCW-CS/PVA 復(fù) 合 膜上的分布和表面細胞形態(tài)的掃描電鏡照片，在四張照片中可看到，細胞數(shù)目較多，鋪展充分，形成了單層細胞層，細胞邊緣清晰完整，細胞呈梭形生長，分布均勻，密度相近，表現(xiàn)出一定的生理形態(tài)?？梢娝姆N膜均與成纖維細胞相容性較好。在CS 膜、CS/PVA 和MNCW-CS/PVA 復(fù)合膜中，細胞的尺寸較大一些，表明CS或含有CS組分的膜中成纖維細胞生長更好一些。這是因為殼聚糖屬于一種優(yōu)良的具有生物活性的天然高分子，能夠促進傷口愈合和皮膚組織修復(fù)的材料[26]。

圖10 CS/PVA復(fù)合膜、MNCW-CS/PVA復(fù)合膜原子力顯微鏡照片

2.9 細胞的黏附與增殖

圖12(a)和圖12(b)分別為細胞L929 在四種膜材料上培養(yǎng)時間與黏附、增殖的關(guān)系，從圖12(a)中看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，四種材料上的細胞數(shù)量都在提高。在同一時間點上，細胞在含有CS 組分的膜材料上的細胞數(shù)值較高，且隨著時間的延長，黏附數(shù)量增加。圖12(b)可以看出細胞的增殖隨著培養(yǎng)時間的增加而提高，尤其是第5天黏附數(shù)量提高更明顯，L929 在三種膜材料的黏附與增殖和培養(yǎng)時間呈線性關(guān)系，黏附數(shù)量大小順序為CS＞CS/PVA＞PVA＞MNCW-CS/PVA。成纖維細胞在三種膜材料增殖作用與成纖維細胞黏附的規(guī)律相同?？梢姡姆N膜無毒性，是一種很好的生物相容性材料。

3 結(jié)論

通過FTIR 分析表明偶聯(lián)劑KH570 已成功接到NCW 表面，改性后NCW 在溶液中分散性較好，MNCW 的加入使CS/PVA 復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性提高，熱分解溫度提高10.04℃，力學(xué)性能有了改善，其中彈性模量較為顯著，提高了155.4MPa，成纖維細胞在復(fù)合膜上均有較好的黏附和增殖?？梢?，椰殼纖維素晶須是較好的高分子材料增強劑。

圖12 細胞L929在四種膜材料上的黏附、增殖與時間的關(guān)系