方金蘭，柴哲，陳保善，張木清

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；3.廣西生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004）

0 引言

赤霉素（Gibberellin,GAs）是調(diào)節(jié)種子萌發(fā)、莖伸長、開花等生長發(fā)育過程的四環(huán)二萜植物激素，DELLA蛋白是GA 信號途徑的負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子[1]。DELLA 蛋白由N 端DELLA 調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和C 端GRAS（GAI、RGA和SCRECROW）功能結(jié)構(gòu)域組成[2-5]。N端DELLA 調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含DELLA、TVHYNP和polyS/T/V，GRAS功能結(jié)構(gòu)域包含核定位信號肽，兩個(gè)亮氨酸七肽重復(fù)基序（LHR1和LHR2）以及PFYRE和SAW 基序[6]。N 端結(jié)構(gòu)域的缺失增加了DELLA抑制作用，導(dǎo)致植株出現(xiàn)半矮化[3]。GRAS功能域的突變導(dǎo)致缺失DELLA抑制功能，出現(xiàn)高或細(xì)長的植物表型。DELLA 蛋白與植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育等過程，例如PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR3（PIF3）、PIF4、PIF1/5、ALCATRAZ（ALC）、JASMONATE ZIM DOMAIN1(JAZ1)、SPATULA（SPT）、BRASSINOOZALE-RESISTANT1（BZR1）、SCARECROW-LIKE3（SCL3）[7-15]。DELLA 蛋白不僅在赤霉素信號途徑中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還參與乙烯信號響應(yīng)和脫落酸信號途徑。

近年來關(guān)于DELLA 蛋白的研究頗多。除了上述功能外，DELLA 蛋白在植物生物脅迫、非生物脅迫、下胚軸彎鉤結(jié)構(gòu)的形成等方面也發(fā)揮著重要作用。Huang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中，DELLA 蛋白通過與NAC蛋白互作影響纖維素的合成，并且說明了這一調(diào)控模式在植物中是保守的。在擬南芥中，RGL2能調(diào)節(jié)胚乳細(xì)胞的擴(kuò)增，調(diào)控種子過渡到幼苗的過程[17]。與野生型相比，過表達(dá)WRKY45基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株更早衰老，相反，wrky45突變體延遲衰老，而DELLA蛋白能抑制WRKY45蛋白降低衰老葉片的衰老速度[18]。

甘蔗是重要的糖料和能源作物，90%的糖產(chǎn)量來源于甘蔗（http://faostat.fao.org/）。除此之外，甘蔗還廣泛應(yīng)用于能源、有機(jī)肥料、飼料等[19]。甘蔗是一種C4禾本科作物，其遺傳背景復(fù)雜，迄今為止，對其研究較少。Tavares等[20]研究發(fā)現(xiàn)甘蔗中ScGAI蛋白能與ScPIF/ScPIF4 和乙烯信號元件ScEIN3/ScEIL1相互作用來調(diào)節(jié)甘蔗莖和葉的生長。在甘蔗中過表達(dá)ScGAI基因引起植株矮小，而ScGAI基因沉默則變高。2018 年，Zhang 等[21]解析了割手密基因組必定會加速對甘蔗的研究進(jìn)程。甘蔗中DELLA 蛋白如何與其他蛋白互作調(diào)控開花、參與脅迫應(yīng)答、種子萌發(fā)、纖維素合成等過程尚待解決。鑒于Tavares等表達(dá)的蛋白是包涵體，變性復(fù)性后會影響其活性。本試驗(yàn)通過將ScGAI基因分別克隆到不同蛋白表達(dá)載體，以期在上清中獲得穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，為ScGAI蛋白純化提供了思路，為后續(xù)加強(qiáng)對ScGAI基因功能的研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pSPK2721（廣西大學(xué)劉云峰實(shí)驗(yàn)室提供）；pMAL-c2Xh 和pET28a+MBP 表達(dá)載體(廣西大學(xué)明振華實(shí)驗(yàn)室提供）；大腸桿菌菌株TOP10（上海唯地生物技術(shù)有限公司）；BL21（DE3）和HIS 純化基質(zhì)（購自天地人和生物科技有限公司）；MBP 純化基質(zhì)(購自NEB 公司）；PCR 擴(kuò)增試劑、核酸內(nèi)切酶和In-Fusion HD Cloning Plus（購自Takara 公司）;蛋白marker（購自天根生化科技有限公司）；gateway 試劑盒（購自Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

將ScGAI(MK088091.1）與pMal-c2X 構(gòu)成重組質(zhì)粒。ScGAI和ScGAI-C與pSPK2721 載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，ScGAI-C與pET28a+MBP 表達(dá)載體連接構(gòu)成重組載體，連接后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)中，每個(gè)分別挑單菌落做菌液PCR檢測并測序驗(yàn)證。

1.2.2 重組融合蛋白質(zhì)的載體表達(dá)探究及純化

pMal-c2X-ScGAI 重組載體轉(zhuǎn)BL21 感受態(tài),以1∶100 比例加入10 mL LB培養(yǎng)基中分別在37℃1 mmol/L IPTG 培養(yǎng)3 h、25℃0.5 mmol/L IPTG 培養(yǎng)12 h、16℃0.1 mmol/L IPTG 培養(yǎng)20 h 后SDS-PAGE檢測總蛋白表達(dá)情況。pSPK2721-ScGAI、pSPK2721-ScGAI-C重組載體分別轉(zhuǎn)BL21菌株后加0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)，分別在37℃3 h、4 h、5 h 取樣，加入5×SDS page loading buffer，100℃煮沸10 min，SDS-PAGE 檢測；pET28a+MBP-ScGAI-C 表達(dá)載體轉(zhuǎn)BL21 菌株，16℃，1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)20 h，離心收集菌體，緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.2 mmol/L EDTA2Na，2 mmol/L β-巰基乙醇，5%甘油）與15 mmol/L 咪唑重懸菌體，超聲破碎，離心取上清與His 基質(zhì)結(jié)合，緩沖液A 洗除雜質(zhì)后，緩沖液A 分別與30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、300 mmol/L咪唑洗脫10 mL后，SDS-PAGE膠檢測。樣品濃縮后-80℃保存。

1.2.3 Western blot檢測

蛋白電泳結(jié)束后，凝膠轉(zhuǎn)膜1 h；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，先用PBST 洗滌4 次，每次5 min；將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，37℃；用PBST稀釋一抗，將膜在一抗稀釋液中過夜，4℃；然后將膜取出后用PBST沖洗4次，每次5 min；二抗稀釋后將膜置于二抗中37℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后將膜置于干凈的盒子中沖洗4 次，每次5 min，最后進(jìn)行ECT顯影，曝光，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建

所用引物如表1 所示。利用In-fusion 方法將ScGAI克?。▓D1A）后與酶切后的pMal-c2X（BamHI、SalI）膠回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)中，挑單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測（圖1B）并測序驗(yàn)證。利用gateway 方法將ScGAI和ScGAI-C（圖1C）分別與pDONR211 載體進(jìn)行BR 反應(yīng)（圖1D），提取質(zhì)粒Mlu 酶酶切（圖1E）后，與pSPK2721 載體進(jìn)行LR 反應(yīng)，轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)后，挑單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測（圖1F）并測序驗(yàn)證。利用In-fusion 方法將ScGAI-C（圖1G）與pET28a+MBP 載體（BamHI、XhoI雙酶切）連接轉(zhuǎn)化，挑單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測（圖1H）并測序驗(yàn)證。

表1 ScGAI 與ScGAI-C 連接在不同表達(dá)載體上的引物序列Table 1 Primer sequences of ScGAI and ScGAI-C linked to different expression vectors

圖1 甘蔗ScGAI與ScGAI-C基因原核表達(dá)載體構(gòu)建Fig.1 Construction of prokaryotic expression vectors of sugarcane ScGAI and ScGAI-C gene

圖2 不同載體、溫度和表達(dá)時(shí)間的蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.2 Protein expression in different vectors,temperatures and expression times

2.2 蛋白原核表達(dá)及純化

將菌液PCR 鑒定及測序正確的pMal-c2X-ScGAI 重組載體轉(zhuǎn)入BL21 感受態(tài)后，分別在37℃1 mmol/L IPTG、25℃0.5 mmol/L IPTG、16℃0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下取樣，離心，8 mol/L 尿素重懸100℃煮沸10 min，離心取上清SDS-PAGE 膠檢測。結(jié)果表明，pMal-c2X-ScGAI在有/無IPTG 條件下，不同溫度、不同誘導(dǎo)濃度培養(yǎng)的總蛋白無明顯變化，而空載在IPTG 誘導(dǎo)下，總蛋白在有明顯表達(dá)（圖2A）。更換pSPK2721 表達(dá)載體，在37℃1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)3 h、4 h、5 h 后取樣，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 膠檢測，pSPK2721-ScGAI 有/無IPTG 誘導(dǎo)無明顯變化，但pSPK2721-ScGAI-C 有或無IPTG 誘導(dǎo)的總蛋白在63～75 kD 之間有明顯區(qū)別（圖2B）。因此在37℃1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)5 h 后，收集菌液，超聲破碎，離心后與MBP 基質(zhì)混合2 h，Column buffer洗除雜質(zhì)后，10 mmol/L麥芽糖進(jìn)行洗脫收集。將pSPK2721-ScGAI-C的沉淀、上清和純化后的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 膠檢測，結(jié)果顯示，目的蛋白在上清中無表達(dá)。重新?lián)QpET28a+MBP 進(jìn)行表達(dá)，pET28a+MBP-ScGAI-C在低溫16℃、1 mmol/L IPTG 條件下誘導(dǎo)20 h收集菌體，超聲破碎，離心，取上清與His 基質(zhì)結(jié)合，取上清、沉淀、基質(zhì)1（與上清結(jié)合后的基質(zhì)）、不同咪唑洗脫的溶液、基質(zhì)2（洗脫后的基質(zhì)）進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，從30 mmol/L 到300 mmol/L 不同濃度咪唑洗脫液在100 kD 處都有一條蛋白條帶，可能是目的蛋白有表達(dá)（圖2C）。

2.3 Western bloting檢測

利用免疫印記（western bloting,WB）技術(shù)，對獲得的蛋白進(jìn)行檢測，GST標(biāo)簽蛋白作為對照，結(jié)果顯示（圖3），anti-His抗體能識別pET28a+MBP-ScGAI-C，但不能識別GST 標(biāo)簽蛋白，表明本次研究獲得了正確的His-MBP-ScGAI-C融合蛋白。

圖3 pET28a+MBP-ScGAI-C蛋白WB檢測Fig.3 Western bloting detection of pET28a+MBP-ScGAI-C protein

3 討論

在開花植物中，DELLA 蛋白作為GA 依賴的生長與發(fā)育等多個(gè)途徑的主要轉(zhuǎn)錄抑制子，發(fā)揮著重要作用。盡管前人對于GA 如何緩解DELLA 蛋白產(chǎn)生的抑制作用有了很多的了解，但是對蛋白質(zhì)作用機(jī)制的了解還不多。Li 等[22]通過研究Os-SCL7的GRAS 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，對其結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)研究展現(xiàn)了GRAS蛋白的結(jié)構(gòu)和DNA 相互作用機(jī)制。本研究通過gateway 和Infusion 方法將ScGAI或ScGAI-C分別與pRSPK2721、pMal-c2X、pET28a+MBP構(gòu)建表達(dá)載體連接，探究不同溫度下最適表達(dá)時(shí)間和IPTG 誘導(dǎo)濃度，結(jié)果表明ScGAI 全長表達(dá)較困難，因此參照Li 等[22]研究方法，嘗試表達(dá)ScGAI的C 端GRAS 功能域。pMalc2X-ScGAI-C 蛋白表達(dá)純化后上清無表達(dá)，在沉淀和總蛋白泳道48～63 kD 之間有明顯較粗一條帶，猜測可能是表達(dá)過程與標(biāo)簽斷裂形成包涵體。重新選擇pET系列載體，pET載體在原核表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平最低。由于ScGAI-C 在原核表達(dá)體系中易形成包涵體，因此選擇改造后的pET28a 載體（添加MBP 標(biāo)簽），ScGAI-C 能在上清中表達(dá)，并且由western bloting 進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，pET 載體和促溶蛋白MBP 有助于ScGAI-C 蛋白在上清中穩(wěn)定表達(dá)，MBP 起到了很好的促溶效果。本次試驗(yàn)為DELLA 蛋白可溶性的表達(dá)純化提供了思路，為甘蔗DELLA蛋白功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。