孫鐘毓 龔 鶯 趙 琳 石 江 毛碧增

(1浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所,浙江杭州 310058；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點實驗室,浙江杭州 310021；3杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江杭州 310021)

我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國,據(jù)統(tǒng)計,甘薯種植面積達670萬hm2,年產(chǎn)量約1億t,甘薯已成為我國主要的經(jīng)濟和糧食作物之一[1]。但甘薯易受多種病毒病復(fù)合侵染,造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。美國、肯尼亞、以色列等國家相繼發(fā)現(xiàn)被甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)侵染的植株表現(xiàn)出矮化、皺縮、褪綠、葉片變窄、花葉明脈等癥狀[3]。1976年,Schaefers等[4]發(fā)現(xiàn)以上病癥是由甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)2種病毒共同侵染形成SPVD造成的。此后,大量研究者針對甘薯病毒病害進行了廣泛研究。

本文綜述了引起SPVD的2種病原的分子特征和部分基因功能及其遺傳變異的最新研究進展,初步探討了SPFMV和SPCSV這2種病毒的協(xié)同致病機制,旨在為SPVD和其他病毒病復(fù)合侵染的研究與防治奠定一定的理論基礎(chǔ),為闡明多種病毒混合侵染機制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 病毒生物學(xué)特性

SPCSV為長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus),目前在西班牙、美國、中國等國家的甘薯中分布較廣泛[5-7]。SPCSV病毒粒子呈彎曲線狀,其長度為850～950 nm,傳播介體主要為煙粉虱B型(Bemisia tabaci biotype B)和紋翅粉虱(Trialeurodes abutilonea),以半持久方式傳播,不經(jīng)汁液接種傳播,主要存在于寄主韌皮部細胞內(nèi),并在維管束內(nèi)堆積[8-9]；SPFMV為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)是甘薯上最常見的病毒之一,廣泛分布于世界各地的甘薯中,該病毒粒子為長絲狀,長約830～850 nm,是馬鈴薯Y病毒屬中病毒粒子最長的成員[10]。其可通過嫁接和機械摩擦傳播,也可由蚜蟲非持久性傳播,不經(jīng)種子、花粉或植物間接觸傳播。稀釋限點為10-3～10-4,體外存活期為12 h,熱滅活溫度為60～65℃,此外,SPFMV在寄主內(nèi)可誘導(dǎo)出胞質(zhì)風(fēng)輪狀內(nèi)含體[11]。

2 檢測方法

2.1 RT-PCR

雖然常規(guī)PCR、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、擴增產(chǎn)物的測序等技術(shù)可用于多種病毒的快速鑒定和分析,但由于甘薯富含多糖多酚物質(zhì),嚴重干擾核酸的提取質(zhì)量,用以上方法效果不佳[12]。Deng等[13]運用納米磁珠RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn),核酸吸附于納米磁珠上,從黏性懸浮樣品中抽離,提高了核酸提取質(zhì)量；王文重等[14]研究表明,免疫捕捉技術(shù)無需抽提病毒RNA便可將目標病毒與抗原結(jié)合后固定在固相上,經(jīng)洗脫處理后富集病毒,再進行RT-PCR反應(yīng),避免了從植物組織中分離核酸的繁瑣過程。表明納米磁珠RT-PCR技術(shù)和免疫捕捉RT-PCR技術(shù)很好地解決了核酸提取的質(zhì)量問題。

與常規(guī)PCR檢測技術(shù)相比,多重RT-PCR技術(shù)能夠在一次反應(yīng)中同時檢測多種病毒,極大縮短了反應(yīng)時間,提高了檢測效率。張盼等[15]建立了能同時檢測SPVD 2種病原的多重 RT-PCR方法,且能夠區(qū)分SPFMV的2個主要株系類型SPFMV-CH和SPFMVCH2。李華偉等[16]發(fā)現(xiàn)甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)單獨侵染甘薯時,癥狀不明顯,與SPFMV和SPCSV共同侵染時造成嚴重的災(zāi)害,因此建立了準確高效且可同時檢測這3種病毒的多重RT-PCR體系。多重RT-PCR具有成本低、效率高等特點,可將不同病毒的基因序列和特征進行對比分析并分離鑒定,能用于甘薯脫毒和病毒病快速檢測。

2.2 實時熒光實時定量PCR

實時熒光定量PCR反應(yīng)可根據(jù)標準曲線對未知模板進行定量分析,實時監(jiān)測整個PCR過程。實時熒光定量PCR需要將mRNA的擴增或宿主基因的編碼序列分別作為RNA或DNA病毒檢測的內(nèi)部對照[17]。甘薯的內(nèi)參基因包括18S、26S rRNA、細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,COX)等,這些基因被用來測定實時熒光定量PCR反應(yīng)中不同樣品RNA和DNA濃度的差異。王麗等[18]應(yīng)用該方法對SPCSV-WA株系進行了定量檢測,結(jié)果表明通過1個TaqMan定量檢測系統(tǒng)可檢測出3.31個拷貝數(shù)的目的病毒,靈敏度較普通PCR高1 000倍。盧會翔等[19]采用雙內(nèi)參基因檢測引物,建立了快速檢測甘薯病毒病SPVD的實時熒光定量 PCR反應(yīng),與硝酸纖維素膜-酶聯(lián)免疫法(nitrocellulose membrane-enzyme-linked immunosorbent assay,NCM-ELISA)相比,更加準確高效。雖然實時熒光定量PCR技術(shù)較省時省力,檢測靈敏度也較高,但其引物和TaqMan探針的序列特異性以及昂貴的試劑和儀器,可能會限制該方法的推廣應(yīng)用。

3 病毒基因組特征及分子變異

3.1 基因組特征

SPFMV基因組長約10 kb,為正義單鏈RNA,5′末端非編碼區(qū)(untranslated regions,UTR)和共價結(jié)合的基因組連接蛋白(viral protein genome-linked,VPg)均對翻譯起著特定的作用,3′末端為poly(A)尾,該病毒基因組包含1個較大的開放閱讀框(open reading frame,ORF),翻譯成1個約360 kD的多聚蛋白,在蛋白水解酶的作用下催化裂解成10個成熟的蛋白質(zhì),即Pl、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb、CP[20-21]。有研究表明,SPFMV通過+2移碼在P1和P3內(nèi)部編碼1個額外的P3N-PIPO和P1N-PISPO蛋白[22](圖1)。且發(fā)現(xiàn)P1N-PISPO僅存在于SPFMV組成員中,而P3N-PIPO存在于所有馬鈴薯Y病毒科病毒中[23]；SPCSV基因組長約15.3～16.0 kb,為雙組份正義單鏈RNA,2個基因組RNA的3′端UTR基本一致。Kreuze等[24]測定RNA1和RNA2分別含有9 407和8 223個核苷酸,其中RNA1包含2個相互重疊的ORFs,編碼能抑制RNA沉默的RNase3和p22。RNA2具有典型的長線形病毒科特征,ORFs編碼熱激蛋白70(heatshockprotein70,Hsp70)、55～64 kD 蛋白質(zhì)產(chǎn)物、外殼蛋白(coat protein,CP)及外殼蛋白類似物(圖2)[25]。

RNA沉默(RNA silencing)是植物的抗病毒防御系統(tǒng),是針對病毒RNA、轉(zhuǎn)基因RNA、轉(zhuǎn)座子RNA、發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA等的一種防御機制,而RNA沉默抑制蛋白(RNA silencing suppressor,RSS)是病毒為了成功侵染植物演化而來的反防御系統(tǒng),是病毒與寄主之間共同進化的結(jié)果[26]。Llave等[27]將攜帶HC-Pro表達載體的土壤桿菌注射進GUS轉(zhuǎn)基因沉默的組織內(nèi),發(fā)現(xiàn)HC-Pro可抑制1個或多個沉默維持步驟；Untiveros[28]通過瞬時表達的SPFMV基因產(chǎn)物與標記基因在本氏煙草中的滲透過濾表明,P1和P1N-PISPO蛋白均有RSS的作用。P1N-PISPO可能用過阻斷傳播至鄰近細胞的信號,抑制沉默的細胞間移動,P1蛋白僅在局部抑制沉默,位于P1的P1N部分的保守甘氨酸/色氨酸基序在RSS活性中起關(guān)鍵作用,已發(fā)現(xiàn)SPCSV存在2種RNA沉默抑制蛋白,即 RNase3和 p22。Kreuze等[29]研究表明SPCSV的RNase3能增強p22的RNA沉默抑制活性,這2個獨立的蛋白質(zhì)共同參與RNA沉默抑制。RNase3是1種雙鏈RNA特異性內(nèi)切核酸酶,Cuellar等[30]研究表達RNase3的轉(zhuǎn)基因甘薯植株進一步發(fā)現(xiàn),單獨表達該蛋白質(zhì)可消除植株的抗性,且在SPFMV侵染植物后產(chǎn)生SPVD癥狀。推測RNase3是通過降解病毒防御中的雙鏈小干擾RNA分子(small interfering RNA,siRNA)來克服植物的防御反應(yīng)[31]。但目前關(guān)于RNase3具體作用機制尚不清楚,仍需進一步更深入的研究。

圖1 SPFMV的基因組結(jié)構(gòu)圖[22]Fig.1 Genome organization of SPFMV[22]

圖2 SPCSV的基因組結(jié)構(gòu)圖[25]Fig.2 Genome organization of SPCSV[25]

3.2 病毒遺傳多樣性

CP蛋白氨基酸序列以及核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性分析表明,SPFMV可分為3個株系[32],分別為普通(ordinary,O),東非(East African,EA),和龜裂 RC(russet crack)。SPCSV分為2個株系[33],分別為東非(East African,EA)和西非(West African,WA)。Ishak等[34]分析了SPVD的2種病原物的遺傳多樣性,基于3′末端的基因組序列分析表明,SPFMV分離株屬于RC株系,利用單克隆抗體的血清學(xué)檢測和Hsp70基因的部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,SPCSV為非 EA株系。Kwark等[35]對侵染甘薯的SPFMV分離物進行RFLP分析,將其分為SPFMV-RC,SPFMV-O+SPFMV-RC和SPFMV-O共3種類型,且基于CP基因序列分析表明,其中17個SPFMV分離株可分為2組,組內(nèi)和組間的一致性分別為97%～99%和91%～93%。根據(jù)CP、Hsp70h基因序列和EA株系的單克隆抗體分析表明,非洲的SPCSV-EA核苷酸序列顯示出高度的保守性,CP核苷酸序列的兩兩比對顯示SPCSVEA分離株之間差異小于4%。但這些序列與已報道的SPCSV-WA的Hsp70h序列相比較,核苷酸序列一致性最高達34.6%,證實了EA和WA株系的Hsp70h序列之間的關(guān)系較遠[36]。

2012年,張振臣等[37]對來自廣東、江蘇、四川、安徽等地的10份SPVD分離株進行全面分析表明,SPFMVCP基因核苷酸序列一致性為77%～94%,SPCSVHsp70基因的核苷酸序列一致性達78%～99%,根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)我國甘薯的SPFMV和SPCSV均存在明顯的株系分化。Deng等[13]分析了四川甘薯SPFMV分離物的CP基因序列遺傳多樣性,結(jié)果表明,核苷酸序列一致性達77.3%～99.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析將SPFMV分離株分成RC、O和C組。包改麗等[38]研究表明云南甘薯上的SPFMV分離物存在EA、O株系,且與已發(fā)現(xiàn)的株系親緣關(guān)系較遠,有可能是新的株系。姜珊珊等[39]分析了來自山東的6個SPFMVCP基因序列,其核苷酸和氨基酸的相似性分別為77.43%～98.52%和82.86%～98.1%,并發(fā)現(xiàn)山東的 SPFMV種群發(fā)生了新變化。Qin等[40]基于Hsp70基因序列系統(tǒng)發(fā)育,研究了來自四川、安徽、江蘇、福建等地的20個SPCSV分離物的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)核苷酸和氨基酸序列的一致性分別為79%～100%和92%～100%,且大多數(shù)為WA株系,表明WA株系在我國的地理分布較EA株系更廣泛。

3.3 病毒分子進化

RNA病毒依賴于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerse,RdRp)或復(fù)制酶,自身缺乏校正功能,導(dǎo)致RdRp錯配率接近10-4,植物RNA病毒通過點突變、重組、缺失、插入、重配等變異,以提高病毒適應(yīng)不同寄主能力和生存力[41]。研究表明重組是馬鈴薯Y病毒科病毒進化過程中的重要變異,因此識別重組熱點的基因組區(qū)域?qū)τ诶斫庵亟M在新病毒株進化中的作用具有重要意義[42]。Tugume等[43]對14種野生SPFMV分離株進行序列分析表明,SPFMV不同株系之間存在一定程度的重組現(xiàn)象,且6K2-Vpg-NIa-Pro區(qū)是SPFMV-EA基因組上的1個重組熱點區(qū)域,EA株系在東非國家有很高的遺傳多樣性。Kwak等[44]基于成熟蛋白質(zhì)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),P1蛋白是感染甘薯馬鈴薯Y病毒屬的種內(nèi)和種間高度可變的區(qū)域,且HC-Pro和NIa-Nib也被認為是重組中的熱點區(qū)域。

4 SPVD的協(xié)同作用侵染機制

目前,雖然對SPVD病毒引起的癥狀觀察、病原鑒定和檢測的研究較多,但對病毒分子水平的研究主要集中在全基因組測序和遺傳多樣性分析上,對病毒基因編碼蛋白的功能及其協(xié)同致病機理的研究還不夠深入。Kokkinos等[45]運用cDNA 微陣列技術(shù)比較SPFMV-RC和SPCSV的單一侵染與混合侵染對甘薯基因表達的影響,結(jié)果表明單獨侵染 SPFMV和SPCSV的植物中差異表達的基因數(shù)量分別僅有3個和4個,受SPVD侵染的植物有超過200個基因是差異表達的。

Karyeija等[46]發(fā)現(xiàn)甘薯植株感染 SPVD后,SPFMV的含量比單獨SPFMV侵染時大約高600倍,而SPCSV的含量卻幾乎不受影響或者稍微降低。馬鈴薯Y病毒屬病毒在協(xié)同作用中通常是增強子,P1和HC-Pro融合表達抑制RNA沉默,表明SPCSV增強了SPFMV的作用[47]。Choi等[48]發(fā)現(xiàn)SPCSV與SPMMV復(fù)合侵染甘薯的表現(xiàn)出的形狀與SPVD的2種病原SPFMV和SPCSV相互作用相似。通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),SPCSV使SPMMV含量提高了約1 000倍,而SPCSV含量降低了2倍,表明二者存在拮抗作用。Kokkinos等[49]發(fā)現(xiàn)SPCSV增強了甘薯Y病毒(Sweet potato virus Y,SPVY)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)的復(fù)制能力。

5 綜合防治策略

5.1 推廣應(yīng)用脫毒健康種苗

甘薯脫毒苗的培育過程是利用甘薯頂端分生組織無毒的原理,將莖尖分生組織離體培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗,并進行病毒檢測,確認完全脫除病毒后進行快繁、種植。目前,甘薯脫毒的主要技術(shù)有熱處理脫毒法、化學(xué)療法、組織培養(yǎng)脫毒法和超低溫脫毒法等[50]。馬代夫等[51]經(jīng)過多年多點鑒定生產(chǎn)上推廣面積較大的幾個甘薯品種的脫毒效果,發(fā)現(xiàn)不論地點、年份和品種,脫毒甘薯均表現(xiàn)出增產(chǎn),增產(chǎn)幅度為14.95%～91.61%。Wang等[52]利用莖尖結(jié)合超低溫冷凍療法脫除SPFMV和SPCSV,效果顯著,莖尖再生率為100%。但目前關(guān)于國內(nèi)將多種脫毒方法相結(jié)合脫除SPVD的研究尚未見報道。

5.2 SPVD抗病種質(zhì)的創(chuàng)制

篩選和種植抗病品種是經(jīng)濟有效的防治SPVD的方法之一,而建立科學(xué)的SPVD抗性鑒定方法是篩選抗病品種的基礎(chǔ)[53]。Mwanga等[54]利用劈接技術(shù)進行嫁接,可使接穗的成活率達100%,進而能快速鑒定甘薯群體對SPVD的抗性。王爽等[53]建立了田間人工嫁接病毒接穗的方法,有效地對12個甘薯品種進行了大規(guī)模的田間抗性鑒定。研究發(fā)現(xiàn)普遍侵染SPCSV的地區(qū)往往有抗SPVD的品種,如New Kawogo為SPCSV抗性最強的甘薯之一[55]。

5.3 轉(zhuǎn)基因培育抗病品種

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,自20世紀90年代中期以來,基因工程已被廣泛應(yīng)用于培育甘薯抗病品種。如Cipriani等[56]利用水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因水解馬鈴薯Y病毒屬的多聚蛋白功能,誘導(dǎo)甘薯產(chǎn)生對SPFMV的抗性。Okada等[57]成功將SPFMV的CP基因?qū)氲绞荏w細胞中,并發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因植株嫁接到不同地域的分離物中同樣具有抗性。近年來,RNA沉默介導(dǎo)誘導(dǎo)抗性植株的技術(shù)已應(yīng)用于多種植物抗病毒的轉(zhuǎn)基因育種中,但對于甘薯植株中抗病毒的轉(zhuǎn)基因報道較少。Kreuze等[29]以靶向SPCSV和SPFMV的復(fù)制酶編碼序列為目標,利用內(nèi)含剪接發(fā)夾的結(jié)構(gòu)對秘魯甘薯Huachano進行改造。在3次轉(zhuǎn)化試驗中,利用高毒性農(nóng)桿菌菌株和胚胎再生獲得了28個獨立的轉(zhuǎn)基因植株,其中10個轉(zhuǎn)基因植株在感染后表現(xiàn)出輕微或無任何癥狀,且SPCSV含量顯著降低。采用RNA干擾技術(shù)同時靶向引起SPVD的SPFMV、SPCSV編碼的RSS,為未來抗病分子育種的研究提供了新方向。

5.4 加強病害流行學(xué)檢測與引種的檢疫

甘薯是無性繁殖作物,種苗和種薯調(diào)運是SPVD遠距離傳播的主要材料,減少跨區(qū)調(diào)運可有效減少病害遠距離傳播,蚜蟲和煙粉虱分別是SPFMV、SPCSV近距離傳播的介體,由于 SPFMV普遍存在,防治SPCSV的傳播是控制SPVD流行的根本。而加強對甘薯大田煙粉虱的防治,可有效防控SPVD的流行,加強產(chǎn)地檢疫,此外,采用高效快速的檢測技術(shù)也可有效預(yù)防SPVD的傳播與流行[58]。

6 展望

我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國,已發(fā)現(xiàn)SPCSV與大多數(shù)馬鈴薯Y病毒科病毒如SPMMV、SPVG等共同侵染甘薯,在SPVD的基礎(chǔ)上引起更嚴重的病毒侵染病害。但目前關(guān)于SPVD的2種病毒的非典型性協(xié)同作用機制的研究尚鮮見報道,對SPVD的綜合防控能力較弱。新發(fā)現(xiàn)的RSS蛋白P1N-PISPO可能與SPVD有關(guān),但需要更深入的研究,才能闡明SPCSV的RNase 3和SPFMV的P1N-PISPO在SPVD協(xié)同侵染中的具體作用機制。

目前,培育栽培抗病甘薯品種的進程緩慢,耗時較長,而病毒進化又會進一步干擾抗病品種的選育。采用RNA干擾技術(shù)同時靶向引起 SPVD的 SPFMV、SPCSV編碼的主要RSS,是未來抗病分子育種研究的新方向。建立甘薯脫毒健康種苗體系已是十分成熟的常規(guī)實驗操作技術(shù),脫毒苗生產(chǎn)基地已初具規(guī)模,但仍存在生產(chǎn)上所用脫毒甘薯品種單一、莖尖分生組織培養(yǎng)的再生率比較低、耗時長等問題。脫毒效果因甘薯品種的基因型不同存在較大差異,傳統(tǒng)的脫毒方法已無法滿足多種病毒侵染的甘薯健康種苗培育體系的建立,因此采用生物技術(shù)對進一步開拓和完善多種病毒侵染的機制具有重要意義。本文為甘薯多種病毒侵染機制的研究提供了方向,同時也為遺傳育種工作提供了一定的理論依據(jù)。