羅林根，朱明揚(yáng)，黃謙，劉劍波

(岳陽市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，湖南 岳陽 414000)

生物防腐劑是從生物體通過生物培養(yǎng)、提取和分離技術(shù)獲得的，具有抑制和殺滅微生物作用的一類高效防腐劑，在食品中的應(yīng)用越來越受關(guān)注。乳酸鏈球菌素(Nisin)是某些乳酸鏈球菌和乳酸乳球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素，能夠有效抑制金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、肉毒梭狀芽孢桿菌等大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌，在一定條件下(加熱、冷凍及經(jīng)EDTA等其他表面活性劑處理)也能有效抑制大腸埃希氏菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌[1]。1969年，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)Nisin為安全、高效、可靠的食品防腐劑。

1 Nisin結(jié)構(gòu)

Nisin由34個氨基酸殘基組成，其中含有脫氫丙氨酸、脫氫酪氨酸、羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸等4種特殊的氨基酸，通過硫醚鍵形成5個內(nèi)環(huán)。Nisin是一種帶正電的熱穩(wěn)定疏水性多肽，有6種分子類型，其中Nisin A和Nisin Z研究較多。Nisin A和Nisin Z的差異僅在于第27位氨基酸的不同，Nisin A上的氨基酸為組氨酸，Nisin Z為天冬酰胺，第27位氨基酸的不同造成其在熱穩(wěn)定性、耐酸性、蛋白酶敏感度、抑菌譜上的差異。天冬酰胺側(cè)鏈比組氨酸側(cè)鏈極性更強(qiáng)，導(dǎo)致Nisin Z溶解度更好[2-3]。

2 Nisin物理化學(xué)性質(zhì)

Nisin在水中溶解度較低，在酸性條件下的溶解度更好。pH 2.5時，Nisin溶解度為12%；pH 5.0時，Nisin溶解度為4%；當(dāng)pH接近中性時，其溶解度幾乎為零。Nisin穩(wěn)定性與pH密切相關(guān)，Nisin在酸性條件下穩(wěn)定性好，pH 2條件下121 ℃滅菌后依然保持抑菌活性，pH 11條件下63 ℃滅菌30 min，Nisin的抑菌活性完全喪失。隨著pH升高，Nisin分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生不可逆的變性，其穩(wěn)定性大大降低；當(dāng)pH值大于等電點時，分子結(jié)構(gòu)的變化更為突出[4]。

3 Nisin生物學(xué)活性

Nisin主要對革蘭氏陽性細(xì)菌尤其是芽孢桿菌具有抑制作用。Nisin可抑制葡萄球菌、明串球菌和微球菌等不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，對酵母、真菌、病毒無抑制作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，Nisin的作用機(jī)理類似于陽離子表面活性劑，帶正電荷的Nisin和帶負(fù)電荷的磷脂發(fā)生靜電相互作用，Nisin親水性C端和疏水性N端能夠插入細(xì)胞膜中而改變其通透性，疏水性N端插入細(xì)胞膜后，使細(xì)菌細(xì)胞膜形成孔洞，打破質(zhì)子動力平衡，細(xì)胞質(zhì)外泄，細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓改變，引起細(xì)胞裂解，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。也有研究認(rèn)為，Nisin可與細(xì)胞壁前體Lipid II形成復(fù)合物，隨后插入細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿孔。革蘭氏陰性菌能夠抵抗Nisin的抑制作用，可能是因為其細(xì)胞壁外層的脂多糖具有屏障作用，可有效阻擋Nisin對細(xì)胞膜的損傷[5]。

4 Nisin作為食品防腐劑的應(yīng)用

Nisin因為其易被消化道中的胰凝乳蛋白酶分解成氨基酸，不會改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群，無任何毒副作用，也不會改變食物的感官特性，因而被廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、水產(chǎn)品、飲料、釀酒工藝、生鮮果蔬保鮮中。目前，已有60多個國家和地區(qū)將Nisin作為天然的食品防腐劑。

4.1 在肉制品中的應(yīng)用

通常使用適量的硝酸鹽、亞硝酸鹽對肉制品進(jìn)行防腐和護(hù)色。微生物發(fā)酵會使部分硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，從而抑制肉毒梭菌等微生物的生長。亞硝酸鹽與仲胺或叔胺在一定條件下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生高濃度的致癌物亞硝胺。Nisin應(yīng)用于肉類制品中，可以改善其質(zhì)地和外觀，達(dá)到更好的防腐效果，延長肉制品的保存時間，還可明顯降低硝酸鹽的使用，有效抑制肉毒梭菌等其他雜菌的生長。有研究表明，Nisin對真空包裝的桶子雞具有很好的保鮮作用，在室溫條件下，可有效抑制雞肉中腐敗微生物的生長，延長其貨架期[6]。

4.2 在乳制品中的應(yīng)用

乳制品營養(yǎng)豐富，易受到微生物的污染，從而降低其營養(yǎng)價值和風(fēng)味。經(jīng)巴氏消毒的乳品中仍然有耐熱的芽孢，即使是經(jīng)過高溫滅菌的乳及乳制品，也會殘留極少量的芽孢。Nisin可有效抑制芽孢的萌發(fā)及其毒素的形成，延長食品保質(zhì)期，同時可降低殺菌溫度，縮短殺菌時間，提高產(chǎn)品品質(zhì)。目前，Nisin已成功應(yīng)用于硬質(zhì)干酪、巴氏殺菌干酪、巴氏殺菌奶、罐裝濃縮牛奶、高溫滅菌牛奶、高溫處理風(fēng)味奶、酸奶、乳制甜點等制品中。在接種單增李斯特氏菌(104CFU·g-1)的干酪中，加入Nisin(50 μg·g-1)后20 ℃放置7 d，單增李斯特氏菌減少3個數(shù)量級[7]。

4.3 在水產(chǎn)品中的應(yīng)用

近年來，Nisin作為食品防腐劑在水產(chǎn)品中應(yīng)用廣泛。水產(chǎn)品在捕撈、貯藏、加工等過程中極易受到微生物的侵襲而腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致其貨架期縮短，商品價值降低。鄭玉秀等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Nisin能有效抑制美國紅魚片中魚腐微生物菌群，顯著緩解魚片鮮度指標(biāo)的變化，從而減緩魚片的酸敗速度，提高美國紅魚片品質(zhì)。裘帥波等[9]采用0.5 g·L-1Nisin保鮮液浸漬處理青占魚，貯藏8 d后青占魚感官品質(zhì)無顯著變化，仍能達(dá)到鮮度標(biāo)準(zhǔn)，貨架期延長4～5 d。

4.4 在乙醇飲料中的應(yīng)用

啤酒在生產(chǎn)中易受到乳酸桿菌和片球菌污染，發(fā)生渾濁、發(fā)黏、變酸等現(xiàn)象。Nisin作為一種生物防腐劑，由于對酵母菌沒有抑制作用，可以用于啤酒、果酒等發(fā)酵酒中。添加Nisin的啤酒，可以降低巴氏滅菌的溫度，縮短巴氏滅菌的時間，延長啤酒的保質(zhì)期[4]。

5 Nisin與其他方法結(jié)合使用

Nisin可與其他方法共同作用，提高抑菌效果。(1)與溶菌酶同時使用。在制作奶酪的過程中，將溶菌酶添加到牛奶中用來抑制芽孢桿菌的生長，通過掃描電鏡觀察，溶菌酶和Nisin結(jié)合使用比單獨使用Nisin造成了更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷[10]。在巴氏殺菌乳中，Nisin和溶菌酶對芽孢桿菌和嗜冷菌表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用，使樣品的保質(zhì)期延長到15 d[11]。(2)與乳過氧化物酶系統(tǒng)(LPS)同時使用。LPS和Nisin能夠協(xié)同抑制脫脂牛奶中的單增李斯特氏菌，可使牛奶在25 ℃保存15 d后仍檢測不出病原菌[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Nisin先使細(xì)胞膜穿孔，LPS產(chǎn)生次硫氰根離子，與病原菌中一些重要蛋白質(zhì)的巰基作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。(3)與熱處理同時使用。在熱處理過程中，加入Nisin是延長食品的保質(zhì)期、保持食品的感官特性的有效方法。在殺菌處理過程中，Nisin通過改變D值來影響微生物的耐熱性。當(dāng)溫度在80～100 ℃時使用Nisin，牛奶中的蠟樣芽孢桿菌的D值平均降低了40%[13]。Nisin與熱處理相結(jié)合可抑制冷藏龍蝦中的李斯特氏菌，接種的單增李斯特氏菌數(shù)量減少3～5個數(shù)量級，而單獨的熱處理或Nisin作用細(xì)菌數(shù)量僅減少1～3個數(shù)量級[14]。(4)與非熱處理方法結(jié)合使用。目前，Nisin與非熱處理方法結(jié)合使用已成為趨勢，例如高靜壓加工技術(shù)(HHP)和脈沖電場處理技術(shù)。HHP處理能滅活大腸埃希氏菌、熒光假單胞菌等革蘭氏陰性菌，但是李斯特氏菌等革蘭氏陽性菌具有一定的耐受性。在250～500 MPa壓力下處理添加了不同濃度Nisin的脫脂牛奶，對細(xì)菌的存活力進(jìn)行評估表明，兩種處理的組合使用比單獨處理獲得更好的殺菌效果。Nisin的添加導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜受損，增加細(xì)菌對壓力的敏感程度[15]。

6 影響Nisin活性的因素

當(dāng)Nisin直接添加到食品中后，其活性受到系統(tǒng)中高pH、高脂肪、大顆粒物、蛋白酶等物理和化學(xué)因素的影響，這些因素可以與Nisin發(fā)生相互作用，導(dǎo)致Nisin失活、沉淀、在食物內(nèi)分布不均勻。Nisin的效力還取決于污染食物的微生物類型和微生物生理狀態(tài)。非生長階段的細(xì)胞可能更具抗性，已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境變化的細(xì)胞往往對細(xì)菌素不敏感。Nisin與某些物理因子或化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合使用，其抗菌活性能大幅度提高，可以抑制甚至殺滅革蘭陰性菌。EDTA是一種二價陽離子的螯合劑，能螯合細(xì)胞表面膜蛋白的二價金屬離子，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其暴露出疏水性磷脂。EDTA與Nisin的螯合作用，使Nisin對致病性大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌效果[16]。吐溫80等表面活性分子的使用也可以顯著地提高Nisin活性，兩親性的吐溫80能夠使Nisin在水脂界面移動，從而增強(qiáng)其對細(xì)菌細(xì)胞膜的吸附作用[17]。

7 小結(jié)

Nisin是一種天然的食品防腐劑，可延長食物的保質(zhì)期，減少病原微生物傳播的風(fēng)險，減少鹽類、酸類和其他化學(xué)防腐劑的使用，能夠更好地保持食物原有的風(fēng)味和感官特性。由于Nisin被蛋白酶降解或者與脂質(zhì)化合物相互作用，其抑菌活性迅速降低。今后的工作應(yīng)在改善Nisin的穩(wěn)定性和抑菌效力和抑菌譜方面進(jìn)行更深入的研究。