尹晨飛，孫海飚，張子楠，馮志國，韓曉強(qiáng)

（1．山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2．山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院，山西 太原 030001）

骨質(zhì)疏松癥可增加患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致死亡率升高。盡管使用了諸多促進(jìn)骨骼健康的治療方法，但是全球骨質(zhì)疏松癥患者的數(shù)量仍在增加。傳統(tǒng)的藥物治療具有副作用，目前益生菌在治療骨質(zhì)疏松方面表現(xiàn)出光明的前景，可以通過調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）信號(hào)通路干預(yù)骨質(zhì)疏松。本文通過回顧近些年的相關(guān)研究結(jié)果，綜述骨、益生菌和mTORC1 之間的關(guān)系。

1 骨質(zhì)疏松癥

骨質(zhì)疏松癥是一個(gè)世界性難題，已經(jīng)成為一種越來越常見的慢性骨骼疾病，全世界＞2 億患者受其影響[1]。其主要特征是骨密度和骨質(zhì)量的進(jìn)行性下降，以及骨微結(jié)構(gòu)的破壞，這些改變導(dǎo)致了骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。因此，骨質(zhì)疏松癥的早期診斷、預(yù)防和治療都極為重要[3]。盡管已使用了諸多促進(jìn)骨骼健康的治療方法，但全球骨質(zhì)疏松癥患者的數(shù)量仍在增加。美國最新數(shù)據(jù)顯示，美國＞50 歲成年人中10.3%患有骨質(zhì)疏松癥，43.9%成年人有骨量降低[4]。目前治療骨質(zhì)疏松主要依賴傳統(tǒng)藥物，但是這些藥物并不總是有效，并且?guī)砹讼喈?dāng)大的安全問題[5]。因此，尋找增加骨形成和維持骨強(qiáng)度的替代療法至關(guān)重要。

2 mTORC1 信號(hào)通路

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以形成mTORC1 和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2）。mTORC1 與mTORC2 的區(qū)別在于對雷帕霉素的不同敏感性：mTORC1 對雷帕霉素更敏感，它整合了多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)，包括Wnt、胰島素/胰島素樣生長因子-1、氧、能量、應(yīng)激或氨基酸水平等信號(hào)分子，通過多種下游效應(yīng)器調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和代謝[6]。雷帕霉素是一種從土壤鏈球菌中提取的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，與相對分子質(zhì)量為12 kD 的FK506結(jié)合蛋白具有高親和力，其形成的復(fù)合物可作用于mTOR，從而抑制mTORC1[7]。結(jié)節(jié)硬化蛋白復(fù)合物（tuberous sclerosis complex, TSC）是mTORC1 信號(hào)通路上游的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，包括TSC1 和TSC2 兩種形式，是一種鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP）酶激活蛋白，可以激活小G 蛋白R(shí)heb 的GTP 酶活性，從而促進(jìn)Rheb/GTP 結(jié)合態(tài)向Rheb/GDP 結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化，TSC1/TSC2 磷酸化會(huì)抑制這種作用，從而導(dǎo)致胞質(zhì)中Rheb/GTP 的聚集[8]；而Rheb/GTP 結(jié)合態(tài)會(huì)使mTORC1 發(fā)生磷酸化而激活[9]。mTORC1 的下游信號(hào)分子主要包括70 kD 的核糖體蛋白S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase, P70S6K）、真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1, eIF4E-BP1）。活化的mTORC1 使eIF4E-BP1 和P70S6K 發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)生物合成增加，促進(jìn)細(xì)胞分化增殖[10]。

3 研究現(xiàn)狀

目前許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，益生菌治療骨質(zhì)疏松有確切的療效[11-17]，但其干預(yù)骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制尚不十分明確，其是通過調(diào)節(jié)哪些信號(hào)分子的表達(dá)來發(fā)揮作用，以及這些信號(hào)分子如何影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性都有待進(jìn)一步的探索。mTORC1 普遍存在于人體細(xì)胞中，控制著許多細(xì)胞的生長過程，最近的研究也發(fā)現(xiàn)，mTORC1 與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切，已成為調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生長與繁殖的主要效應(yīng)物，而目前尚未發(fā)現(xiàn)mTORC2 有這種功能[9]。因此探索益生菌與mTORC1 的關(guān)系成為未來研究的一個(gè)主要方向。通過了解益生菌干預(yù)骨質(zhì)疏松的mTORC1 信號(hào)通路將有助于人們制訂出更有效的治療策略。

4 益生菌干預(yù)骨質(zhì)疏松的mTORC1 信號(hào)通路

4.1 益生菌通過IGF1-PI3K-mTORC1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性

胰島素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞在細(xì)胞和分子水平的增殖和分化，從而促進(jìn)新骨形成[18]。研究發(fā)現(xiàn)，給長期缺乏營養(yǎng)的小鼠喂養(yǎng)植物乳桿菌可以增加血清中的IGF1 水平[11]。IGF1 可作用于成骨細(xì)胞表面胰島素樣受體（insulin-like receptor, IR）激活I(lǐng)R 的酪氨酸激酶活性，活化的IR 通過磷酸化胰島素受體底物1（insulin receptor substrates, IRS1）使磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3K）激活，活化的PI-3K 可以催化細(xì)胞膜磷脂中的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate, PIP2）生成三磷酸磷脂酰肌醇，繼而招募磷脂酰肌醇依賴性激 酶1（phosphatidylinositol-dependent kinase, PDK1）和一種絲/蘇氨酸激酶-蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）形成二聚體，其中PDK1 可以使PKB 磷酸化而激活[19]?；罨腜KB 使TSC1/TSC2 發(fā)生磷酸化致胞質(zhì)中Rheb/GTP 聚集，從而激活mTORC1，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[9]。因此，益生菌可以通過上調(diào)體內(nèi)IGF1的表達(dá)，激活成骨細(xì)胞中mTORC1 信號(hào)通路。

4.2 益生菌通過TNF-α/OPG-RANKLmTORC1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性

破骨細(xì)胞來源于骨髓單核/巨噬細(xì)胞系造血祖細(xì)胞，其異常激活可以導(dǎo)致多種骨骼疾病，包括骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎及骨腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，其中核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL）被證明是破骨細(xì)胞分化所必須的細(xì)胞因子[20]，其腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族的成員，可作用于核因子κB 受體活化因 子（receptor activator of nuclear factor-κB, RANK），誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞系造血祖細(xì)胞形成破骨細(xì)胞[21]。RANKL 主要由成骨細(xì)胞和T 細(xì)胞分泌，RANK 主要表達(dá)于破骨細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[22]。研究發(fā)現(xiàn)，RANKL會(huì)激活破骨細(xì)胞中的mTORC1 信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟[23]。其具體機(jī)制為：RANKL 與RANK 在破骨細(xì)胞上的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致TNF 受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF）的募集而活化。TRAF 家族蛋白包括TRAF2、5、6，其中TRAF6 最重要（因?yàn)橹挥蠺RAF6 缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥），可以激活PKB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）[24]，活化的PKB 和MAPK 分別促使TSC1/TSC2 復(fù)合物磷酸化，繼而引起細(xì)胞質(zhì)中Rheb/GTP 聚集，促進(jìn)mTORC1 活化，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化[25]。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致RANKL 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生[26]。BRITTON 等[12]用羅伊乳桿菌（lactobacillus reuteri, LR）喂養(yǎng)去卵巢（Ovariectomized, OVX）小鼠可以預(yù)防OVX 小鼠模型的骨丟失。通過對比LR 喂養(yǎng)的OVX 小鼠和未喂養(yǎng)的OVX 小鼠，發(fā)現(xiàn)LR 喂養(yǎng)的OVX 小鼠體內(nèi)T 細(xì)胞和非T 細(xì)胞來源的RANKL 顯著減少。此外，DAR 等[13]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用LR 喂養(yǎng)小鼠可以抑制其體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-, IL-6）、白細(xì)胞介素-7（Interleukin-7,IL-17）、TNF-α。而這些炎癥因子被證明可以上調(diào)成骨細(xì)胞中RANKL 的表達(dá)，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化成熟和骨吸收，其中TNF-α 發(fā)揮最主要的作用[27]。OHLSSON 等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，用益生菌治療小鼠不僅降低了炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1 的表達(dá)，而且增加了OVX 小鼠皮質(zhì)骨中骨保護(hù)素（Osteoprotegerin,OPG）的表達(dá)。已知OPG 是腫瘤壞死因子受體（tumor necrotic factor receptor, TNFR）超家族成員之一，在許多組織中都有表達(dá)，如肺、心臟、腎臟和骨骼，可通過結(jié)合RANKL 防止破骨細(xì)胞中mTORC1 信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用[28]。因此，益生菌可通過減少炎癥因子（例如TNF-α 和IL-1）的表達(dá)和增加OPG 的表達(dá)，間接抑制RANKL 對破骨細(xì)胞mTORC1的活化，從而到達(dá)到干預(yù)骨質(zhì)疏松的目的。

4.3 益生菌通過Wnt-GSK3-mTORC1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性

在過去的幾十年中許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，Wnt 信號(hào)對骨小梁和骨皮質(zhì)的形成都至關(guān)重要。已知的Wnt信號(hào)通路包括Wnt 配體、單程跨膜脂蛋白受體相關(guān)蛋白（lipoprotein receptor-related protein, LRP）、七次跨膜受體卷曲蛋白（Frizled, FZD）。此外，細(xì)胞質(zhì)中還存在一種異源四聚體破壞復(fù)合物，組成成分包括軸抑制蛋白、酪蛋白激酶1、腺瘤性息肉病蛋白、糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3, GSK3）[29]。關(guān)于Wnt 信號(hào)通路，目前研究最深入的是其經(jīng)典途徑——Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過抑制轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白的降解，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育的目的。然而最近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt 配體與FZD 和LRP的結(jié)合也能激活mTORC1 信號(hào)通路[30]。其具體機(jī)制為：當(dāng)WNT 與LRP 和FZD 結(jié)合后，會(huì)招募Dishevelled 蛋白結(jié)合到FZD 的胞質(zhì)尾部，導(dǎo)致破壞復(fù)合物的分解，從而抑制GSK3 活性，而GSK3 可以通過磷酸化TSC1/TSC2 復(fù)合物而抑制mTORC1 的激活，這一作用與Akt磷酸化TSC1/TSC2 復(fù)合物激活mTORC1 不同，因此Wnt 可以通過抑制GSK3 活性而激活mTORC1 信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[31]。Wnt10b 是公認(rèn)的Wnt信號(hào)激活劑，屬于Wnt 的一種亞型。其過度表達(dá)會(huì)使成骨細(xì)胞數(shù)量增加，從而導(dǎo)致骨小梁過度形成。然而破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性并沒改變，這表明Wnt10b 只作用于成骨細(xì)胞，增加骨形成[32]。KANG 等[33]研究也表明，Wnt10b 提高小梁骨質(zhì)量是通過增加成骨細(xì)胞的數(shù)量而實(shí)現(xiàn)的，其對破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性無影響。研究發(fā)現(xiàn)，給正常幼鼠補(bǔ)充鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus GG, LGG）會(huì)增加小鼠的小梁骨體積。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這是由于LGG 可以引起骨髓和腸道中T 細(xì)胞數(shù)量增加，并導(dǎo)致其分泌的Wnt10b 增加[15]。ZHANG 等[16]的研究也證實(shí)，益生菌可以使1 型糖尿病患者體內(nèi)成骨細(xì)胞中Wnt10b 表達(dá)增加。這些研究結(jié)果都表明益生菌可以上調(diào)成骨細(xì)胞中Wnt10b 表達(dá)，從而間接激活mTORC1 信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，達(dá)到干預(yù)骨質(zhì)疏松的作用。由于Wnt 配體可以通過經(jīng)典信號(hào)通路和mTORC1 兩種信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，因此，關(guān)于具體是哪一種信號(hào)通路占據(jù)主導(dǎo)作用目前尚未可知，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.4 益生菌通過BMP-c-Abl-PI3K- mTORC1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性。

自從骨形態(tài)發(fā)生蛋白（the bone morphogenetic protein, BMP）在骨骼中被發(fā)現(xiàn)以來，BMP 已經(jīng)被證明能夠刺激多種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的成骨細(xì)胞分化。研究表明，BMP 可以激活mTORC1 從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化過程中的蛋白合成能力[34]。雖然BMP2 可以通過誘導(dǎo)Wnt 的分泌來介導(dǎo)BMP2 的成骨功能[35]，但是BMP誘導(dǎo)成骨細(xì)胞蛋白的合成卻不依賴于這些新分泌的Wnt 因子，提示BMP2 激活mTORC1 的信號(hào)通路不同于Wnt 途徑[36]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2 在成骨細(xì)胞中可以激活酪氨酸激酶c-Abl，而用伊馬替尼抑制c-Abl 可阻止BMP2 誘導(dǎo)的PKB、eIF4E-BP1 和P70S6K 磷酸化，有效抑制BMP2 誘導(dǎo)的蛋白合成和與蛋白合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)，該結(jié)果提示BMP2 通過c-Abl 激活mTORC1 信號(hào)通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PKB 的上游信號(hào)分子是PI3K，eIF4E-BP1 和P70S6K 的上游信號(hào)分子是mTORC1。為進(jìn)一步證實(shí)PI3K 和mTORC1 在介導(dǎo)BMP2 功能中的作用，又使用LY294002（一種PI3K抑制劑）抑制PI3K，發(fā)現(xiàn)完全抑制了BMP2 誘導(dǎo)的蛋白合成，也消除了BMP2 誘導(dǎo)的與蛋白合成代謝相關(guān)的基因的表達(dá)，使用mTORC1 抑制劑Torin1 也達(dá)到了相同的效果。因此，根據(jù)以上結(jié)果可以得出結(jié)論：BMP2 通過c-Abl 激活PI3K/PKB/mTORC1 信號(hào)通路，增加成骨細(xì)胞中蛋白合成，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[35]。研究發(fā)現(xiàn)，用益生菌（長雙歧桿菌）喂養(yǎng)OVX 大鼠，可以減少OVX 大鼠的骨吸收并且增加骨形成，增強(qiáng)OVX 大鼠的骨密度。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，該作用通過上調(diào)BMP-2基因?qū)崿F(xiàn)[17]。因此，益生菌可以通過上調(diào)BMP-2基因的表達(dá)間接激活mTORC1 信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，干預(yù)骨質(zhì)疏松。

5 總結(jié)與展望

骨質(zhì)疏松癥可以引起各種骨骼的嚴(yán)重并發(fā)癥，對人們的生活質(zhì)量有著深遠(yuǎn)的影響。有必要制訂新的、安全、有效的策略來預(yù)防或治療由不同條件和變量（包括年齡、生物學(xué)性別、疾病、遺傳背景）引起的骨質(zhì)疏松癥。近年來發(fā)表了多項(xiàng)關(guān)于益生菌干預(yù)骨質(zhì)疏松的研究，表明口服益生菌可安全有效地預(yù)防各種情況下的骨質(zhì)流失，顯示了益生菌對骨骼健康的潛在益處。然而，益生菌干預(yù)骨質(zhì)疏松的機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其可能的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)IGF1、炎癥因子、Wnt 和BMP 的表達(dá)水平間接影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的mTORC1 活性，但更具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究去闡明。相信未來通過研究益生菌干預(yù)骨質(zhì)疏松的相關(guān)信號(hào)通路可以制訂出更加有效的治療策略。