吳心虹，李泰標(biāo)，廖秋菊，何毅琪，林友益

福建省廈門市第五醫(yī)院中醫(yī)科(廈門 361101)

中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(Neutrophil gelatinase-aussociated lipocalin，NGAL)是脂籠蛋白(lipocalin)家族的新成員。筆者在前期通過對非透析腎性貧血患者進行臨床觀察[1]，證實NGAL介導(dǎo)的鐵代謝途徑對慢性腎臟病與貧血具有重要作用。血NGAL與尿NGAL對腎性貧血鐵代謝的診斷更有臨床應(yīng)用價值，可能是反應(yīng)鐵代謝的新型指標(biāo)。血NGAL主要反應(yīng)腎功能下降和貧血程度，而尿NGAL是血NGAL升高的結(jié)果，亦反應(yīng)了腎小管的損傷情況，故血清NGAL可能是腎性貧血的潛在作用點。Kim等[2]通過臨床觀察亦證實血漿NGAL水平與慢性腎病患者透析前貧血的鐵狀態(tài)相關(guān)。

補腎養(yǎng)血祛濁中藥在臨床上治療腎性貧血取得較好的療效，聯(lián)合促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)治療更有利于腎性貧血的糾正。然而研究多圍繞療效觀察進行，具體機制研究文獻報道較少，分子生物依據(jù)少。本研究通過補腎養(yǎng)血祛濁方干預(yù)腎性貧血大鼠，觀察Scr、Hb、Fer、TAST改變，實時熒光定量 PCR (Real time，PCR) 檢測腎組織NGAL、EPOR水平，Western blot 檢測腎組織 NGAL及EPOR蛋白水平，從而闡述中藥糾正腎性貧血的作用機理。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：健康SPF級 SD雄性大鼠共70只(體重180～220 g)，由廈門大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SYXK(閩)2013-0006)。

1.2 主要試劑：RNA提取試劑盒(Promega)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(TOYOBO)；NGAL ELISA試劑盒(Abcom)；EPO ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；EPOR ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；鐵蛋白ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；兔抗大鼠NGAL、EPOR多克隆抗體(Proteintech)；蛋白提取試劑盒(Promega)。

2 研究方法

2.1 實驗分組：將75只健康的SPF級大鼠，運用標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，即正常組(N組)25只、模型組(M組)25只、中藥組(Z組)25只。

2.2 模型建立及動物處理

2.2.1 造模：參照相關(guān)文獻[3]，將1.5%腺嘌呤混懸液，以腺嘌呤300 mg/(kg·d)灌胃，共6周，正常組以等容量蒸餾水灌胃。造模期間15只大鼠死亡。造模6周后，隨機選取4只大鼠，眼眶取血，檢測Hb、Scr、BUN，證實造模成功。

2.2.2 本方組成：淫羊藿、鹿角膠、熟地黃、當(dāng)歸、黃芪、茯苓、大黃、補骨脂、雞血藤等組成，生藥制成濃縮湯劑。中藥制法：①稱取生藥255 g，用水浸泡30 min，煮沸后再煎30min，過濾；②得濾渣,加水，加熱(二煎)至沸騰后，再煎20 min，再過濾。每天上午灌胃給藥，用量均按臨床上成人每公斤體重用量的 6倍換算，予5 ml/(kg·d)灌胃；模型組予灌生理鹽水10 ml/(kg·d)，給藥時間為4周。

2.2.3 動物處理：采用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，開腹開胸后，取腎臟，處死前腹主動脈采血3 ml；左腎以多聚甲醛固定，梯度脫水、透明，進行石蠟包埋，制作石蠟切片，用于免疫組化檢測；右腎用消毒錫箔紙包好速凍于液氮中，后轉(zhuǎn)至-80°C 冰箱保存，用于實時熒光定量 PCR 及 Western blot檢測。

3 指標(biāo)檢測

3.1 常規(guī)實驗室法檢測血清Hb、Scr、BUN、Fe、總鐵結(jié)合力(TIBC)、血清鐵(SI)水平，TAST由TIBC、SI計算得出。

3.2 ELISA法檢測血清Fer、EPO、NGAL含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

3.3 實時熒光定量PCR檢測腎組織NGAL mRNA、EPOR mRNA表達變化：取腎組織依照TRIzol(invitrogen)法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(TOYOBO)以7500Software進行熒光擴增，檢測基因序列詳見表1，GAPDH作為內(nèi)參照;以正常組 mRNA 的表達量作為“1”，再根據(jù)校正值計算出模型組及中藥組mRNA相對含量，進行比較。見表1。

3.4 Western blot 檢測腎組織NGAL、EPOR蛋白表達：組織稱重，按比例加入相應(yīng)裂解液，勻漿離心，抽取上清，BCA 法測定蛋白濃度。加入buffer，100°C 使蛋白變性利于保存。電泳分離，切膠，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉1h，加入1∶1000一抗(NGAL、EPOR，Proteintech公司)，4°C搖床孵育過夜，次日TBST洗滌后，加入過氧化氫物酶標(biāo)記的二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)檢測標(biāo)本膜上信號。

表1 檢測基因引物序列和產(chǎn)物長度

結(jié) 果

1 各組大鼠血清指標(biāo)比較 與正常組比較，模型組Hb、EPO均明顯降低(P<0.01)，TAST降低(P<0.05)，NGAL水平升高(P<0.05)，Scr、BUN、Fer均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥組Hb、TAST、EPO水平明顯升高(P<0.01)，Scr、NGAL水平明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)er、BUN水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清指標(biāo)表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

2 各組大鼠PCR表達情況 與正常組比，模型組腎臟NGAL mRNA明顯升高(P<0.01)，EPOR mRNA明顯降低(P<0.01)，中藥組腎臟NGAL mRNA升高(P<0.05)，EPOR mRNA升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組腎臟NGAL mRNA減少(P<0.05)，EPOR mRNA明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠PCR表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

3 各組大鼠Western blot檢測水平 模型組較正常組腎臟NGAL 蛋白水平升高(P<0.05)，中藥組較模型組腎臟NGAL 蛋白水平減少(P<0.05)；模型組較正常組EPOR蛋白水平降低(P<0.05)，中藥組較模型組EPOR蛋白水平明顯升高(P<0.01)。見表4及圖1-2。

表4 各組大鼠各蛋白表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

討 論

CKD發(fā)生的貧血是由于促紅細胞生成素和鐵缺乏、慢性炎癥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進和紅細胞縮短半衰期[4-5]。鐵缺乏是CKD患者貧血的第二大原因，首要原因是促紅細胞生成素缺乏。EPO 是紅細胞生成的主要調(diào)控因子，通過和EPOR 結(jié)合發(fā)揮其促進紅系祖細胞的增殖、分化與成熟的生物學(xué)效應(yīng)[6-7]。在本實驗中，模型組大鼠血清中Scr、BUN、Fer升高，Hb、血清EPO及腎臟EPOR水平降低，腎性貧血模型成立，但在造模過程中，大鼠死亡15只，考慮與該造模方法腺嘌呤用量較大有關(guān)。

NGAL是一個25kDa的中性粒細胞明膠酶單體，循環(huán)的NGAL可透過腎小球濾過膜。NGAL與腎臟病關(guān)系的相關(guān)研究報道已有不少，其水平與腎損害程度相關(guān)[8-9]，而NGAL亦參與貧血的發(fā)生發(fā)展，早期研究認為NGAL可通過Tf轉(zhuǎn)鐵途徑參與慢性病貧血[10]，隨著研究的進展，人們通過體外實驗發(fā)現(xiàn)NGAL

也是調(diào)節(jié)紅細胞生長機制的重要因素[11-12]。我們前期研究[1]，觀察透析前CKD貧血患者NGAL與鐵狀態(tài)指數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果支持血漿NGAL與CKD貧血患者的鐵狀態(tài)有關(guān)，與Fer、TAST呈正相關(guān)，且特異性及敏感性均高于Fer。本實驗中，模型組血漿及腎臟NGAL均升高，故考慮血漿NGAL升高與腎臟NGAL升高有關(guān)。

腎性貧血有關(guān)的病名如“虛勞”、“腎勞”、“血虛”等病名[13]。歷代醫(yī)家多認為本病病機為：腎精虧虛，脾氣衰憊，后天無以滋養(yǎng)先天，脾腎俱虛，氣血生化不足，濁邪內(nèi)蘊，瘀血阻滯，可將其概括為正虛邪實?！稄埵厢t(yī)通》曰“血之源頭在乎腎”而《侶山堂類辨》云“腎為水臟，主藏精而化血”。腎藏精，腎虛精虧，精不生血，則致血虛。《宣明論方》謂：“濕氣先傷人之陽氣，陽氣傷不能調(diào)通水道，亦使人真陰不能生長而耗陰液?！苯蜓矗幰汉膭t陰血生化乏源。治療多以補腎填精，健脾益氣，養(yǎng)血瀉濁為主。本方以補腎養(yǎng)血瀉濁法為主，選用淫羊藿、阿膠、熟地黃、當(dāng)歸、黃芪、茯苓、大黃等藥物組成方。方中藥物有以下特點：淫羊藿溫腎陽而不燥；淫羊藿、阿膠配合使用，意在陰中求陽，陽中生陰，陰陽生化無窮，以期陰平陽秘、腎元充裕之功。熟地黃味甘微溫質(zhì)潤，既補血滋陰，又能補精益髓；當(dāng)歸多糖能提高動物白細胞和網(wǎng)織紅細胞水平，促進紅細胞及血紅蛋白的生成，療效優(yōu)于鐵劑。黃芪、茯苓健脾益氣升清、補后天以助先天，生化有源，佐以大黃通腑降濁。全方共奏益精補血之功，更添溫腎降濁之效，對腎性貧血有好的治療作用。

包曉星等[14]運用健脾益腎瀉濁方配合EPO治療腎性貧血，結(jié)果表明能有利于體內(nèi)肌酐、尿素氮等代謝產(chǎn)物的排除，減少毒素對造血細胞的抑制和破壞，改善貧血程度。范軍等[6]研究發(fā)現(xiàn)補腎生血方可通過提高骨髓有核細胞 EPOR mRNA 表達量達到治療腎性貧血的作用。有許多實驗證明[15]，中醫(yī)藥可通過降低NGAL水平減少相關(guān)炎癥細胞因子表達、抑制炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡、誘導(dǎo)細胞自噬、抗腎間質(zhì)纖維化等方式減輕腎小管損傷、腎小球硬化，抑制腎小球系膜細胞的增殖，保護腎組織，然而未見對腎性貧血的治療作用。本實驗中，中藥組較模型組Scr、BUN明顯降低，Hb、血清EPO明顯升高，說明補腎養(yǎng)血祛濁方對腎性貧血有治療作用。同時，與模型組比較，中藥組Fer降低，TAST升高，血清NGAL、腎臟NGAL mRNA及蛋白水平均降低，說明該方可降低NGAL水平，改善腎性貧血鐵代謝情況。

實驗表明，補腎養(yǎng)血祛濁方能降低血清及腎臟NGAL水平，改善鐵代謝情況，從而保護腎功能，糾正腎性貧血。為進一步了解NGAL在腎性貧血中的變化意義，今后將從細胞分子水平進一步研究。