李成，甘海寧，陳偉韜，陳玉興，畢曉黎，占心佾

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510095； 2.廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)，廣東 廣州 510095； 3.廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095)

“蟲(chóng)類(lèi)”藥材在我國(guó)是一類(lèi)特色的醫(yī)藥資源，其通常具有療效高、活性強(qiáng)、潛力大、應(yīng)用廣等特點(diǎn)，在動(dòng)物類(lèi)中藥材中占據(jù)重要地位[1]。 “蟲(chóng)類(lèi)”藥材具有多種功效且廣泛應(yīng)用于中藥處方中[2]，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《金匱藥略》、《本草綱目》等古代醫(yī)藥著作中以“蟅蟲(chóng)”入藥，已有近2 000年的入藥歷史。金邊土鱉為昆蟲(chóng)綱蜚蠊目姬蠊科昆蟲(chóng)，具有消瘀散結(jié)、抗凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經(jīng)等功效，婦科常用于逐瘀通結(jié)，內(nèi)科常用于散結(jié)消癥，傷科常用于續(xù)骨療傷，是中醫(yī)臨床中血瘀證的常用藥[3-4]，臨床上對(duì)抗血栓、祛風(fēng)濕、抗腫瘤等都具有良好的作用[5]，已被收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第2冊(cè))[6]。國(guó)外對(duì)其研究報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)僅對(duì)其生物學(xué)、生殖系統(tǒng)及抗癌抗菌等藥理作用進(jìn)行過(guò)研究[7-8]。本文采用不同提取方法提取金邊土鱉進(jìn)行活血化瘀實(shí)驗(yàn)研究，為金邊土鱉的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品

金邊土鱉(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào)161213)；阿司匹林腸溶片[拜耳醫(yī)藥(上海)有限公司，批號(hào)SH00358]、10%水合氯醛、鹽酸腎上腺素注射液(成都市科龍化工試劑廠(chǎng)，批號(hào)2016092901)；角叉菜膠(Sigma-Aldrich產(chǎn)品，批號(hào)SLBN6684V)；細(xì)菌脂多糖(International Laboratory產(chǎn)品，批號(hào)：374613)。

1.2 試劑

凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定試劑盒(批號(hào)1804056)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定試劑盒(批號(hào)1803037)、凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)定試劑盒(批號(hào) 1803057)、纖維蛋白原(FIB)測(cè)定試劑盒(批號(hào) 348170718)，均為北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

JJ500電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng))；JP-500B-8高速多功能粉碎機(jī)(永康市久品電器公司)；HH-6數(shù)顯恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；LXJ-11B低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；C2000-A高性能血凝儀(北京普利生儀器有限公司)；LBY-N7500A全自動(dòng)血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)；L-600臺(tái)式大容量低速離心機(jī)(江東儀器有限公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0002。

2 方法

2.1 金邊土鱉提取方法及給藥劑量

勻漿法：取金邊土鱉粉末50 g(六號(hào)篩)，加3倍量蒸餾水用組織攪拌機(jī)勻漿20 min，再離心20 min，取上清液備用濃縮至0.50 g/mL。冷浸法[9]：取金邊土鱉粉末50 g(六號(hào)篩)，每次加6倍量蒸餾水振搖3次，依次提取5 h、4 h、4 h，合并3次提取溶液，離心后濃縮至0.50 g/mL。水煮法：取金邊土鱉50 g碾碎后加蒸餾水煎煮40 min，濃縮后用紗布過(guò)濾使其含生藥0.50 g/mL。粉碎法：取50 g金邊土鱉粉末(六號(hào)篩)，加100 mL蒸餾水制成混懸液，使質(zhì)量濃度為0.50 g/mL。阿司匹林組劑量為4 mg/kg，金邊土鱉各工藝樣品高劑量為3.24 g/kg，低劑量為0.81 g/kg。

2.2 金邊土鱉對(duì)正常大鼠全血比黏度及凝血功能影響

取SD大鼠100只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，體質(zhì)量分層隨機(jī)分為對(duì)照組，阿司匹林組，勻漿高、低劑量組，水煮高、低劑量組，冷浸高、低劑量組，粉碎高、低劑量組，分組后每天上午各給藥組按劑量灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥前1 d，禁食24 h，末次給藥后1 h，腹腔注射10%(φ)水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血測(cè)定凝血功能和全血比黏度。

2.3 金邊土鱉對(duì)寒凝血瘀模型大鼠全血比黏度及凝血功能影響

根據(jù)文獻(xiàn)[9-11]進(jìn)行改進(jìn)建立急性寒凝血瘀模型。取SD大鼠110只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，體質(zhì)量分層隨機(jī)將110只大鼠按“2.2”分組、給藥。末次給藥前1 d，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠于灌胃給藥后1 h皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mL/kg 2次，2次注射時(shí)間間隔為4 h，第1次注射鹽酸腎上腺素后2 h，注射大鼠放入3～5 ℃低溫環(huán)境中30 min。末次給藥前各組大鼠均禁食不禁水16 h，末次給藥后1 h，麻醉取血測(cè)定凝血功能和全血比黏度。

2.4 金邊土鱉對(duì)熱毒血瘀模型大鼠全血比黏度及凝血功能影響

根據(jù)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行改進(jìn)建立熱毒血瘀模型。SD大鼠110只同上分組，分組后正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)，其余各組大鼠喂飼高脂飼料，各給藥組按劑量灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，正常對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)5 d。實(shí)驗(yàn)第3天，除正常對(duì)照組外，其余各組均皮下注射角叉菜膠(10 mg/kg)，24 h后腹腔注射給予細(xì)菌脂多糖(100 μg/kg)。末次給藥前禁食不禁水16 h，末次給藥后1 h，各組大鼠麻醉取血測(cè)定凝血功能和全血比黏度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 金邊土鱉對(duì)正常大鼠凝血功能的影響

與對(duì)照組比較，冷浸法高劑量組、粉碎法低劑量組大鼠全血比黏度(低切10)明顯降低(P<0.01)，粉碎法高劑量組降低(P<0.05)；勻漿法高劑量組、冷浸法高劑量組和粉碎法高、低劑量組大鼠全血比黏度(中切60)均降低(P<0.05)；4種方法高低劑量組全血比黏度(高切150)均無(wú)變化(P>0.05)；勻漿法高劑量組、冷浸法高劑量組大鼠APTT明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；阿司匹林組、勻漿法低劑量組、水煮法高、低劑量組、冷浸法低劑量組、粉碎法高、低劑量組APTT延長(zhǎng)(P<0.05)；粉碎法高劑量組PT明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；勻漿法高劑量組、冷浸法高、低劑量組，粉碎法高、低劑量組TT延長(zhǎng)(P<0.05)，阿司匹林組、勻漿法低劑量組TT延長(zhǎng)(P<0.05)；阿司匹林組、勻漿法高劑量組、冷浸法高劑量組、粉碎法高、低劑量組FIB明顯降低(P<0.01),阿司匹林組、冷浸法低劑量組FIB降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金邊土鱉對(duì)正常大鼠全血比黏度及凝血功能的作用Table 1 Effect of Opisthoplatia Orientalis Burm. on blood viscosity and coagulation function of normal rats

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.2 金邊土鱉對(duì)寒凝血瘀模型大鼠凝血功能的影響

與正常對(duì)照組比較，寒凝血瘀模型組全血比黏度(低切10、中切60、高切150)明顯增加(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，冷浸法高劑量組全血比黏度(低切10)降低(P<0.05)；與寒凝血瘀模型組比較，阿司匹林組，勻漿法高、低劑量組，水煮法高、低劑量組，冷浸法高、低劑量組，粉碎法高、低劑量組全血比黏度(中切60)均降低(P<0.05)；與寒凝血瘀模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組全血比黏度(高切150)無(wú)降低現(xiàn)象(P>0.05)；與對(duì)照組比較，寒凝血瘀模型組APTT明顯縮短(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，水煮法高、低劑量組APTT明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；阿司匹林組、勻漿法高劑量組、冷浸低劑量組、粉碎法高劑量組APTT延長(zhǎng)(P<0.05)；與對(duì)照組比較，寒凝血瘀模型組PT無(wú)縮短現(xiàn)象(P>0.05)；與對(duì)照組比較，寒凝血瘀模型組TT明顯縮短(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組TT明顯縮短(P<0.01)；與對(duì)照組比較，寒凝血瘀模型組FIB明顯增加(P<0.01)；與寒凝血瘀模型組比較，阿司匹林組、勻漿法低劑量組、水煮法低劑量組、冷浸法高、低劑量組FIB明顯降低(P<0.01)，勻漿法高劑量組、水煮法高劑量組、粉碎法高、低劑量FIB降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 金邊土鱉對(duì)熱毒血瘀模型大鼠的影響

與正常對(duì)照組比較，熱毒血瘀模型組全血比黏度(低切10、中切60)明顯增加(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組全血比黏度(低切10)均降低(P<0.05)；與熱毒血瘀模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組全血比黏度(中切60)明顯降低(P<0.01)；與正常對(duì)照組比較，熱毒血瘀模型組全血比黏度(高切150)未增加(P>0.05)；與正常對(duì)照組比較，熱毒血瘀模型組APTT明顯縮短(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，冷浸法高劑量組、粉碎法高劑量組APTT明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，阿司匹林組、勻漿法高、低劑量組、水煮法高劑量組、冷浸法低劑量組、粉碎法低劑量組APTT延長(zhǎng)(P<0.05)；與對(duì)照組比較，熱毒血瘀模型組PT縮短(P<0.05)；與熱毒血瘀模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組PT無(wú)變化(P>0.05)；與對(duì)照組比較，熱毒血瘀模型組TT明顯縮短(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，水煮法高、低劑量組、冷浸法低劑量組、粉碎法低劑量組TT明顯縮短(P<0.01)，勻漿高劑量組、冷浸高劑量組TT縮短(P<0.05)；與對(duì)照組比較，熱毒血瘀模型組FIB明顯增加(P<0.01)；與熱毒血瘀模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組FIB明顯降低(P<0.01)。 結(jié)果如表3。

4 討論

清代唐容川在《血癥論》中記載：瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，則為癥瘕，癥之為病，總是氣和血膠合而成……”?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，凡離經(jīng)之血不能及時(shí)消散而瘀滯于人體組織內(nèi)，或血液運(yùn)行受阻，瘀滯于經(jīng)脈或器官之內(nèi)則稱(chēng)為瘀血?，F(xiàn)代研究表明，血瘀證的形成與血液系統(tǒng)，特別是血小板、纖溶、抗凝血酶系統(tǒng)密切相關(guān)，存在血液流變性和微循環(huán)異常等病理生理改變。血瘀時(shí)，血液黏度大，流動(dòng)性差，表現(xiàn)為濃、黏、凝、聚狀態(tài)，血液有效灌注量少，影響了氣血的運(yùn)行[15-17]。

金邊土鱉為中醫(yī)臨床治療血瘀證的常用中藥，常以水煎內(nèi)服或以黃酒送服、或者烘焙磨粉后入藥治療血瘀證，臨床效果較佳。本實(shí)驗(yàn)對(duì)金邊土鱉采用水煮法、粉碎法、勻漿法和冷浸法作為提取方法制備不同樣品，對(duì)比觀(guān)察不同工藝樣品的活血化瘀效果，可為臨床應(yīng)用金邊土鱉提供多種更便利的使用方式，也可為金邊土鱉中藥新藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供更合理的制備制劑方式。

表2 金邊土鱉對(duì)寒凝血瘀模型大鼠血流變及凝血功能的作用

組別劑量/(g·kg-1)全血比黏度/(mPa·s)低切[10]中切[60]高切[150]凝血4項(xiàng)APTT/sPT/sTT/sFIB/(g·L-1)正常對(duì)照組-8.61±0.915.21±1.044.24±0.6928.20±5.1520.40±5.5725.82±4.26938.50±297.34寒凝血瘀模型組-15.19±2.75##8.15±1.32##5.87±1.26##14.32±1.93##14.09±1.5912.73±2.48##1548.46±234.84##阿司匹林組0.00410.60±2.726.36±0.86?4.36±0.5420.88±4.10?15.25±1.3622.49±2.40??1032.26±207.75??勻漿高劑量組3.2412.55±4.306.68±0.87?4.47±0.5719.03±2.47?15.81±1.1023.42±4.53??1168.26±223.22? 低劑量組0.8111.74±3.546.67±0.91?4.51±0.5517.70±1.9717.04±2.6921.90±1.43??1100.80±180.68??水煮高劑量組3.2411.19±2.226.78±1.52?4.70±1.0518.84±1.74??16.48±2.3721.83±3.25??1144.36±273.46? 低劑量組0.8111.87±2.696.39±0.94?4.38±0.6219.25±2.47??15.63±0.9524.12±3.97??1065.29±236.32??冷浸高劑量組3.2411.01±1.38?6.41±1.02?4.55±0.6619.91±4.0318.30±5.9223.03±3.59??811.53±350.40?? 低劑量組0.8110.80±2.136.51±0,95?4.54±0.6620.43±3.50?18.31±3.1522.87±2.36??1072.64±334.38??粉碎高劑量組3.2412.06±1.576.58±1.21?4.71±0.6017.53±1.30?16.46±3.2024.31±3.71??1241.74±239.56? 低劑量組0.8111.84±1.826.97±1.48?4.79±1.0517.91±4.3615.84±3.1624.71±2.74??1210.41±345.56?

與正常對(duì)照組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

表3 金邊土鱉對(duì)熱毒血瘀模型大鼠血流變及凝血功能的影響

組別劑量/(g·kg-1)全血比黏度/(mPa·s)低切[10]中切[60]高切[150]凝血4項(xiàng)APTT/sPT/sTT/sFIB/(g·L-1)正常對(duì)照組-8.80±1.845.51±0.524.62±0.4836.66±4.6727.98±7.1830.73±6.60657.62±227.58模型組-12.56±2.91##7.42±1.28##5.14±0.9717.98±3.11##16.62±2.04##18.48±2.31#1341.94±251.09##阿司匹林組0.0048.61±2.55?5.08±1.06??4.23±0.8528.15±5.04?21.78±9.0030.47±9.28768.01±199.38??勻漿高劑量組3.248.83±2.34?5.09±1.08??4.32±0.7827.06±4.21?17.44±2.6930.03±7.21?824.24±162.82?? 低劑量組0.819.35±2.37?5.46±0.72??4.58±0.5925.76±3.38?17.51±5.0628.30±6.72879.72±215.73??水煮高劑量組3.249.25±2.08?5.32±0.94??4.48±0.7426.49±5.33?17.48±4.0528.45±3.38??793.69±211.52?? 低劑量組0.819.98±2.63?5.95±1.18??4.85±0.8226.30±9.2319.16±6.5825.20±2.94??860.10±267.34??冷浸高劑量組3.249.01±1.95?5.08±0.75??4.28±0.5935.14±8.64??18.16±3.3426.05±4.50?586.43±303.42?? 低劑量組0.819.24±1.61?5.29±0.74??4.48±0.5430.79±8.52?19.36±5.2826.12±2.93??845.83±304.42??粉碎高劑量組3.249.74±1.78?5.80±1.16??4.82±0.8428.95±5.28??20.18±4.8425.02±4.50950.04±282.18?? 低劑量組0.8110.02±1.73?5.89±0.91??4.87±0.6724.46±3.78?18.30±5.2529.94±1.93??991.97±200.20??

與正常對(duì)照組比較：#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金邊土鱉4種不同制法的樣品對(duì)正常大鼠、急性寒凝血瘀模型大鼠、熱毒血瘀模型大鼠都具有明顯的改善血液流變性的作用，其作用主要與延長(zhǎng)APTT、TT和降低FIB含量等有關(guān)。金邊土鱉4種不同提取法樣品之間比較，彼此間均無(wú)顯著性差異，均可作為臨床應(yīng)用方式。綜合考慮4種金邊土鱉樣品作用程度，勻漿樣品、冷浸樣品、粉碎樣品作用稍好些，水煮樣品作用稍差些；從綜合考慮制劑合理性、便利性來(lái)看，冷浸工藝耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，粉碎工藝體積過(guò)大，水煮工藝作用稍弱，勻漿工藝更適合金邊土鱉中藥制劑的制備。

本文僅對(duì)金邊土鱉開(kāi)展了初步的工藝篩選和藥效作用探索研究，為金邊土鱉中藥制劑開(kāi)發(fā)和合理應(yīng)用提供了初步參考依據(jù)，下一步將開(kāi)展金邊土鱉活血化瘀有效成分的分離及其相關(guān)作用機(jī)制研究。