曹斯瓊，羅宇琴，吳文平，楊文慧，索彩仙，李國衛(wèi)

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

王不留行為石竹科植物麥藍菜Vaccariasegetalis(Neck.) Garcke的干燥成熟種子，具有活血化瘀、下乳消腫、利尿通淋的功效[1]。味苦，性平，歸肝、胃經(jīng)。除了華南地區(qū)以外，全國各地區(qū)均有分布。據(jù)文獻報道，王不留行的主要化學成分有黃酮苷、生物堿、三萜皂苷、環(huán)肽和揮發(fā)油等[2-4]。黃酮苷類成分是王不留行催乳的有效成分，具有促進乳汁分泌的作用[5]。另外，王不留行黃酮苷類成分還能保護血管內(nèi)皮細胞，而刺桐堿能抗炎、增強免疫和抗肝損傷[6-7]。

王不留行作為常用中藥材，具有較高的藥用價值。目前，對王不留行的質(zhì)量研究主要通過測定單一的成分含量對王不留行進行評價[8-9]。中藥成分復雜，僅以單個指標的含量作為質(zhì)量的評價指標是不全面的。中藥指紋圖譜是指中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后采用一定的分析手段，得到能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖[10]。2015年版《中國藥典》僅收載了王不留行的性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別及黃酮苷的含量測定等方法來評價王不留行藥材的品質(zhì)?！断愀壑兴幉臉藴省穂11]則除了收載性狀、顯微鑒別、薄層色譜鑒別及王不留行環(huán)肽A的含量測定外，增加了HPLC指紋圖譜的控制。本研究參考《香港中藥材標準》王不留行項下的指紋圖譜方法，建立王不留行UPLC指紋圖譜方法，可同時測定刺酮堿的含量，并結(jié)合相似度分析、聚類分析和主成分分析，對不同產(chǎn)地的王不留行藥材的質(zhì)量進行評價。

1 儀器與材料

王不留行藥材來源于全國不同的產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為石竹科植物麥藍菜Vaccariasegetalis(Neck.) Garcke的干燥成熟種子，具體來源見表1。

表1 王不留行藥材來源Table 1 Sources information of Vaccariae Semen

Waters超高效液相色譜儀(沃特斯公司)；Agilent 超高效液相色譜儀(安捷倫公司)；YMC Trait C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；ME204E萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

刺桐堿對照品(上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)：98.0%，批號：P26N6F6550)；王不留行黃酮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)：99.7%，批號：111853-201704)；甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水(實驗室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取刺桐堿對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得每1 mL含刺桐堿131.085 μg的儲備液。精密量取刺桐堿儲備液2.5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含32.771 μg的溶液。

取王不留行黃酮苷對照品適量，精密稱定，置20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得每1 mL含王不留行黃酮苷150.098 μg的溶液。

2.1.2 供試品溶液 取王不留行藥材粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%(體積分數(shù)，下同)乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：YMC Trait C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～5.5 min，10%～15%A；5.5～11 min，15%～30% A；11～16.5 min，30%～70% A)；流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：219 nm；進樣量：1 μL。

2.3 UPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取S3號供試品溶液，按“2.2”項色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以王不留行黃酮苷峰為參比峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取S3號供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別在0、2、4、6、12 h進樣，記錄色譜圖，以王不留行黃酮苷為參比峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 取S3號樣品粉末(過三號篩)6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取1 μL，按“2.2”項下色譜條件分析，記錄色譜圖，以王不留行黃酮苷為參比峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于1.0%，結(jié)果表明方法重復性良好。

2.4 王不留行藥材指紋圖譜的建立

2.4.1 共有峰的確定

取15批王不留行藥材樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下確定的色譜條件進樣測定，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》對15批王不留行藥材特征圖譜進行共有峰標識，并生成對照圖譜。結(jié)果見圖1、圖2。以2號峰為參照，各批樣品的共有峰的相對保留時間見表2?？梢?，各共有峰較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性，可初步定為王不留行藥材的指標成分群。經(jīng)與對照品對照，確認1號峰為刺桐堿峰，2號峰為王不留行黃酮苷峰。因王不留行黃酮苷峰分離效果好、出峰穩(wěn)定，選定為參照峰。

90080070060050040030020010005432(s)1RS15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S101234567891011121314151617t/minU/mV

1.刺桐堿； 2(s).王不留行黃酮苷。

圖115批王不留行藥材UPLC指紋圖譜疊加圖

Figure1Overlay chart of UPLC fingerprint of 15 batches of Vaccariae Semen

2.4.2 各產(chǎn)地藥材指紋圖譜相似度評價

以15批次王不留行藥材生成的共有模式(S0)為對照指紋圖譜，15批次王不留行藥材與對照指紋圖譜的相似度范圍為0.987～1.000，各批次藥材與對照指紋圖譜的相似度均在0.98以上，說明各產(chǎn)地藥材表現(xiàn)出了良好的相似度。不同產(chǎn)地王不留行藥材的相似度較為接近，說明各產(chǎn)地王不留行藥材質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

24022020018016014012010080604020012(s)543012345678910111213141516t/minU/mV

1.刺桐堿； 2(s).王不留行黃酮苷。

圖215批王不留行藥材UPLC指紋圖譜共有模式

Figure2Total mode of UPLC fingerprint of 15 batches of Vaccariae Semen

表2 15批王不留行藥材指紋圖譜相對保留時間

Table2Relative retention time analysis of common peaks in 15 batches of Vaccariae Semen

編號峰1峰2峰3峰4峰5S10.457 1.000 1.266 1.512 1.891 S20.456 1.000 1.266 1.513 1.894 S30.458 1.000 1.264 1.508 1.884 S40.461 1.000 1.256 1.489 1.858 S50.462 1.000 1.256 1.487 1.854 S60.467 1.000 1.255 1.489 1.857 S70.460 1.000 1.223 1.433 1.770 S80.465 1.000 1.257 1.491 1.859 S90.460 1.000 1.224 1.434 1.772 S100.461 1.000 1.225 1.435 1.773 S110.462 1.000 1.255 1.485 1.852 S120.462 1.000 1.256 1.486 1.853 S130.467 1.000 1.255 1.487 1.854 S140.467 1.000 1.255 1.486 1.852 S150.468 1.000 1.255 1.486 1.852

表3 15批王不留行藥材指紋圖譜相似度評價

Table3Similarity of fingerprints of 15 batches of Vaccariae Semen

編號相似度編號相似度S10.987 S90.998 S20.996 S100.999 S30.997 S110.995 S41.000 S121.000 S50.997 S130.999 S60.999 S140.998 S71.000 S150.998 S81.000 S01.000

2.4.3 王不留行樣品聚類分析

將各色譜峰峰面積相對于稱樣量進行量化，運用SPSS 20.0軟件對15批王不留行藥材樣品進行系統(tǒng)聚類，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式。聚類分析將王不留行藥材樣品分為4類，Ⅰ類包括S3、S4、S5、S6、S11、S12、S13、S14、S15，即安徽樣品與3批河北及1批河南樣品聚為一類；Ⅱ類包括S8、S10，即2批河南樣品聚為一類；Ⅲ類包括S7、S9，即2批河北的樣品聚為一類；Ⅳ類包括S1、S2，即甘肅的樣品聚為一類；總體看來，河北、河南和安徽的王不留行藥材質(zhì)量大體相近，不同來源的樣品亦能聚到一類，說明不同產(chǎn)地的樣品質(zhì)量差異不大，與相似度分析的評價結(jié)果相一致。結(jié)果見圖3。

1015202505S13S14S5S12S3S15S4S6S11S8S10S7S9S1S2

圖315批王不留行藥材樣品聚類分析結(jié)果

Figure3Dendrogram of clustering analysis of 15 batches of Vaccariae Semen

2.4.4 主成分分析

2.4.4.1 共有峰主成分分析

主成分分析(PCA)是一種通過降維技術(shù)把多個變量化為少數(shù)幾個主成分的統(tǒng)計方法，利用SPSS20.0軟件對15批王不留行指紋圖譜所得的5個共有峰進行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差，見表4?？梢?，前2個主成分對總方差的累積貢獻率達89.115%，故選擇主成分數(shù)為2，可代表王不留行指紋圖譜共有峰的大部分信息，說明前2個主成分的分析結(jié)果基本顯示出了不同批次王不留行藥材之間的相似度和差異性。

表4 主成分特征值及貢獻率結(jié)果 Table 4 Eigen value and contribution rate of principal component analysis主成分特征值貢獻率/%累積貢獻率/%13.41368.25068.25021.04320.86589.11530.2625.24894.36340.2054.10498.46750.0771.533100.000

2.4.4.2 不同產(chǎn)地王不留行藥材的綜合評價

針對前2個主成分對王不留行藥材進行綜合評價，按方差貢獻率加權(quán)計算綜合得分，結(jié)果見表5。可見，排名前3的3批樣品均為河北產(chǎn)的樣品；排名前6的樣品中，河北的4批、河南的1批、安徽的1批。總體來說，甘肅產(chǎn)地的王不留行藥材質(zhì)量較差，綜合排名倒數(shù)；河北和河南產(chǎn)地的王不留行整體上質(zhì)量較優(yōu)且穩(wěn)定。

另外，對15批不同產(chǎn)地的王不留行樣品的前2個共有峰(刺桐堿、王不留行黃酮苷)的質(zhì)量分數(shù)進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘肅產(chǎn)地的2批樣品中，刺桐苷和王不留行黃酮苷質(zhì)量分數(shù)均較低，分別為0.11%、0.10%和0.44%、0.40%，表明甘肅產(chǎn)王不留行藥材整體質(zhì)量較差，與指紋圖譜結(jié)果一致。

表5 15批王不留行藥材綜合得分排序表Table 5 Sorting table of integrated scores of 15 batches of Vaccariae Semen

3 討論

本研究分別考察了Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、YMC Trait C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)、Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)3種色譜柱，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)YMC Trait C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)的分離效果最好，峰型更好?？疾炝艘译?0.1%磷酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-水、甲醇-水4種流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水分離效果最好。采用PDA檢測器進行全波長掃描，比較了219、280、310 nm波長下各色譜峰的響應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)219 nm波長下基線平穩(wěn)，峰信息量較大，各色譜峰峰型較好，故選擇219 nm作為王不留行藥材指紋圖譜檢測波長。考察了33、35、37 ℃ 3個柱溫對王不留行指紋圖譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個柱溫對王不留行藥材指紋圖譜相對保留時間基本無影響?？疾炝?.18、0.20、0.22 mL/min 3種微小流速的變動對王不留行藥材指紋圖譜的影響，以相對保留時間、相對峰面積為指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此方法下流速±0.02 mL/min對王不留行藥材指紋圖譜基本無影響，說明流速微小的變動能滿足系統(tǒng)適應性要求。

本研究運用相似度分析、聚類分析對不同產(chǎn)地的王不留行藥材UPLC指紋圖譜進行分析，15批王不留行藥材的指紋圖譜相似度在0.98以上，說明不同產(chǎn)地的王不留行藥材質(zhì)量比較一致。聚類分析將王不留行藥材樣品分為4類，Ⅰ類包括S3、S4、S5、S6、S11、S12、S13、S14、S15，即安徽樣品與3批河北及1批河南樣品聚為一類；Ⅱ類包括S8、S10，即2批河南樣品聚為一類；Ⅲ類包括S7、S9，即2批河北的樣品聚為一類；Ⅳ類包括S1、S2，即甘肅的樣品聚為一類，總體看來，河北、河南和安徽的王不留行藥材質(zhì)量大體相近，但不同來源的樣品亦能聚到一類，說明不同來源的樣品質(zhì)量差異不大，與相似度分析的評價結(jié)果相一致。

本研究運用指紋圖譜分析方法，較全面地評價了不同產(chǎn)區(qū)的王不留行藥材的質(zhì)量，可為王不留行藥材的質(zhì)量控制提供參考。