劉正泉，趙自剛

(河北北方學(xué)院 微循環(huán)研究所，河北 張家口 075000)

內(nèi)毒素休克這一臨床常見的急危重癥，由多種嚴(yán)重感染因素引起，以凝血功能紊亂、微循環(huán)障礙為特征，以細(xì)胞損害與器官結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙或衰竭為嚴(yán)重后果，進一步發(fā)展為膿毒癥，病死率高達70%，是目前危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點[1]。其中，致病因素引起的凝血功能紊亂是內(nèi)毒素休克發(fā)生微循環(huán)障礙、發(fā)展至膿毒癥的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是臨床防治內(nèi)毒素休克的一個關(guān)鍵切入點[2]。在內(nèi)毒素休克凝血功能紊亂的發(fā)病過程中，既有致病因素引起血液高凝、凝血物質(zhì)消耗帶來的血液低凝，又存在纖溶系統(tǒng)亢進引起的凝血與纖溶失衡，為此，眾多學(xué)者從降低血液高凝、補充凝血因子、抑制纖溶系統(tǒng)亢進等多個角度防治內(nèi)毒素休克引起的凝血功能紊亂，以期改善內(nèi)毒素休克的預(yù)后，降低病死率。

1 降低血液高凝防治內(nèi)毒素休克引起的凝血功能紊亂

一般來說，致病因素，特別是G-菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)以不同方式進入循環(huán)系統(tǒng)后，可直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)損傷，釋放組織因子(tissue factor，TF)，啟動外源性凝血系統(tǒng)；暴露膠原，活化XII因子，啟動內(nèi)源性凝血系統(tǒng)；LPS刺激白細(xì)胞高表達TF，啟動外源性凝血系統(tǒng)；LPS刺激可活化血小板，增強其黏附、聚集功能，釋放血小板磷酯，形成凝血酶原激活物；破壞紅細(xì)胞膜，釋放大量膜磷脂，形成凝血酶；紅細(xì)胞破壞釋放的大量二磷酸腺苷，也促進了血小板聚集，引起血液高凝。更為重要的是，VEC損傷增加了白細(xì)胞選擇素(L-selectin)、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(E-selectin)、血小板選擇素(P-selectin)等黏附分子的表達，促進了白細(xì)胞與VEC黏附、血小板黏附，發(fā)生血液高凝。這些因素互相作用，形成血液高凝的瀑布效應(yīng)，形成大量微血栓，引起凝血因子與血小板消耗，成為進一步發(fā)生消耗性低凝的基礎(chǔ)。在一項由志愿者參與、由LPS注射引起內(nèi)毒素血癥的研究中[3]，發(fā)現(xiàn)LPS引起了志愿者白細(xì)胞數(shù)目增多、C反應(yīng)蛋白增高、血小板消耗。為此，以防止VEC損傷、減少白細(xì)胞與血小板活化、降低紅細(xì)胞損傷、降低黏附分子表達為目的的一系列措施成為防治內(nèi)毒素休克血液高凝的主要手段。

研究發(fā)現(xiàn)[4]，中藥復(fù)方香芹湯(Xiang-Qi-Tang，XQT)及其有效成分香附酮α(Alpha-Cyperone，CYP)、黃芪甲苷IV、穿心蓮內(nèi)酯均能夠顯著抑制LPS刺激引起大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的生成，XQT與CYP抑制了TF的分泌，且XQT及其有效成分顯著抑制了心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的主要信號分子p38MAPK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-jun 氨基末端激酶(c-jun NH2-terminal kinase，JNK)以及核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65的磷酸化蛋白水平有關(guān)。這一研究結(jié)果表明，XQT及其有效成分改善凝血功能的作用是通過抑制心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的MAPKs與NF-κB信號通路實現(xiàn)的，也提示減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷是降低LPS引起血液高凝狀態(tài)的有效途徑之一。

Kim等[5]在一個體外豬肺灌注模型上，發(fā)現(xiàn)抑制血管假性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)與血小板糖蛋白Ib綁定從而抑制血小板黏附的金精三羧酸(aurintricarboxylic acid，ATA)，能劑量依賴性地抑制了人血清誘導(dǎo)的E-selectin表達以及人單核細(xì)胞與豬肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，抑制了凝血酶誘導(dǎo)的vWF分泌、補體活化、TF表達與血小板活化，改善了肺功能與白細(xì)胞在肺組織的聚集，與重組水蛭素聯(lián)合應(yīng)用更有利于改善凝血功能。進一步的研究[6]顯示，ATA能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)ICAM-1和E-selectin蛋白與mRNA的高表達，從而抑制了白細(xì)胞與HUVECs的黏附，同時發(fā)現(xiàn)這種作用與抑制HUVECs的NF-κB轉(zhuǎn)位與IκB降解有關(guān)。這些研究表明，抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附對于改善凝血功能具有一定的積極作用。

臨床研究顯示，急診感染患者發(fā)生膿毒癥的患者出現(xiàn)了血小板顯著降低，血小板的降低程度且與患者病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)[7]；血必凈注射液輔助治療在改善嚴(yán)重膿毒癥患者凝血功能及預(yù)后的同時，提高了血小板數(shù)量以及纖維蛋白原含量，降低了彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)的發(fā)生率[8]；烏司他丁、血必凈聯(lián)合治療亦顯著提高了燒傷后膿毒癥患者血小板的數(shù)量，降低炎癥因子水平，從而改善凝血功能[9]，也減輕了LPS處理后綿羊肺、肝、腎等臟器的損傷程度，降低了死亡率[10]；在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，輔助小劑量肝素鈉與低分子肝素鈣治療，在降低炎癥因子水平、改善凝血功能的同時，均顯著提高了膿毒癥患者血小板數(shù)量[11]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation-perforation，CLP)在引起動物器官損傷與失控炎癥反應(yīng)[12]的同時，也引起凝血功能障礙，表現(xiàn)為凝血時間延長、凝血因子活性抑制、血小板數(shù)量減少、D-二聚體增多[13]；血必凈注射液在有效改善盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation-perforation，CLP)動物的凝血功能、提高纖維蛋白原含量的基礎(chǔ)上，降低LPS靜脈注射引起的炎癥反應(yīng)[14]；白藜蘆醇治療可顯著改善內(nèi)毒素休克后的微循環(huán)灌注狀態(tài)，同時可顯著提高LPS腹腔攻擊大鼠的血小板數(shù)量[15]。研究顯示，LPS體外刺激血小板，可劑量依賴性地引起血小板凋亡[16]，這可能是內(nèi)毒素休克后血小板功能降低的又一個因素。這些研究結(jié)果說明，抑制血小板消耗、提高血小板數(shù)量對改善膿毒癥凝血功能可發(fā)揮積極的有益作用。

此外，包括血栓調(diào)節(jié)蛋白、抗凝血酶III(antithrombin III，AT-III)、蛋白C等在內(nèi)的機體抗凝系統(tǒng)，對于維持凝血穩(wěn)態(tài)也發(fā)揮著積極作用。臨床研究顯示[17]，加味四妙勇安湯輔助治療顯著提高了膿毒癥患者血清AT-Ⅲ水平，從而改善了凝血功能。Iba等[18]在靜脈注射LPS建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型上，活體腸系膜微循環(huán)觀察發(fā)現(xiàn)AT(125 IU/kg)、重組血栓調(diào)節(jié)蛋白聯(lián)合注射顯著降低了白細(xì)胞與內(nèi)皮的黏附和血栓形成、改善了小靜脈的微血流，單獨或聯(lián)合治療顯著抑制了凝血系統(tǒng)的活化，反映器官損傷的血清標(biāo)志物未發(fā)生明顯變化，也降低了血中晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)的水平。一項全國性的臨床研究表明，分別或聯(lián)合應(yīng)用重組血栓調(diào)節(jié)蛋白或AT-III，均顯著改善了膿毒癥患者的凝血功能，降低了DIC的發(fā)生率以及住院死亡率[19]。研究發(fā)現(xiàn)[20]，來自細(xì)菌的外膜小泡(outer membrane vesicles，OMVs)啟動了感染因素引起膿毒癥的炎癥反應(yīng)，同樣OMVs與HUVECs共同孵育后，在明顯提高TF、P-selectin、E-selectin表達的同時，也顯著提高了血栓調(diào)節(jié)蛋白表達；同時OMVs處理HUVECs后的上清液作用于全血標(biāo)本，也顯著提高了單核細(xì)胞與血小板的聚集，可見OMVs促進了內(nèi)毒素休克或膿毒癥后血液高黏狀態(tài)的形成。研究也發(fā)現(xiàn)[21]，LPS持續(xù)靜脈注射6 h引起了家兔凝血功能障礙，丹酚酸B靜脈注射提高了纖維蛋白原、血小板、蛋白C以及AT-III水平，從而改善了家兔的凝血功能；丹參酮IIA也發(fā)揮了與丹酚酸B相同的作用，降低了家兔的死亡率(從80%降低至26.7%)[22]。蛋白C活性也成為監(jiān)測膿毒癥患者器官與凝血狀態(tài)的一個重要標(biāo)志物[23]。這些研究均表明，提高機體抗凝系統(tǒng)的功能，有利于對抗LPS攻擊或膿毒癥引起的血液高凝狀態(tài)。

針對細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附或血小板黏附在內(nèi)毒素休克或膿毒癥凝血功能紊亂發(fā)展中的作用，研究發(fā)現(xiàn)L-selectin抗體可抑制LPS攻擊后白細(xì)胞黏附，E-selectin的單克隆抗體也可降低LPS攻擊小鼠白細(xì)胞滾動及其與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而降低LPS引起的炎癥反應(yīng)[24]。但是，目前還沒有這些黏附分子抗體使用后，通過抑制炎癥反應(yīng)改善凝血功能的直接報道，還需要進一步關(guān)注。

此外，激肽釋放酶(kallikrein，KLK)-激肽系統(tǒng)參與了凝血的調(diào)節(jié)，KLK通過激活XⅡ因子，引起凝血。Kolte等[25]在LPS攻擊大鼠前，應(yīng)用KLK抑制劑PF-04886847進行前處理，阻斷了LPS引起的循環(huán)血中的粒細(xì)胞數(shù)量增多以及血漿6-keto PGF1α水平增高，降低了球囊損傷家兔的血栓形成、延長了APTT與TT，但對LPS引起的血小板數(shù)量減少、血漿纖維蛋白原降低、D-二聚體水平增高以及肝、腎損傷沒有明顯的作用。結(jié)果表明，PF-04886847具有一定的抗血栓形成的作用，也說明抑制KLK可調(diào)節(jié)LPS后的凝血穩(wěn)態(tài)。

上述研究表明，針對引起血液高凝的諸多因素進行治療，對于內(nèi)毒素休克或膿毒癥后的血液凝固穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著積極有效的作用。但這些動物實驗研究多集中于某一因素的觀察，缺少整體治療效果的評價；一些臨床試驗研究也多集中在小樣本的現(xiàn)象描述，還缺乏大樣本的綜合性觀察。因此，對內(nèi)毒素休克后血液高凝的防治研究，還需要基礎(chǔ)與臨床聯(lián)合研究的深入。

2 補充凝血因子防治內(nèi)毒素休克引起的凝血功能紊亂

由于內(nèi)毒素休克導(dǎo)致的血液高凝引起了凝血因子消耗，因此及時有效地補充凝血因子成為防治內(nèi)毒素休克凝血功能紊亂的重要舉措。新鮮冷凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)富含大量的凝血因子，對于多種原因?qū)е碌哪δ苷系K治療效果很好。Letourneau等[26]的一項體外研究顯示，解凍后儲存在1℃～6℃冰箱0 d或5 d中的FFP，均顯著提高了LPS處理的人肺內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM、VCAM、P-selectin、E-selectin的表達，提示輸入FFP可能提高了白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。Shamsudin等[27]檢測了FFP中凝血因子含量隨著儲存時間延長的變化情況，發(fā)現(xiàn)活化的VII因子(activated factor VII，F(xiàn)VIIa)自解凍后即刻以及儲存在4℃冰箱6 h、3 d、5 d等四個時間點的活性依次保持原有的73.43%、73.73%、71%、69.8%，F(xiàn)VIII活性依次為177.63%、144.37%、80.8%、70.97%，纖維蛋白原含量依次為3.24 g/L、3.24 g/L、3.21 g/L、3.20 g/L，說明FFP儲存后凝血物質(zhì)的有效性。但FFP對內(nèi)毒素休克后凝血功能紊亂中的作用還需進一步觀察。

研究發(fā)現(xiàn)，活化的VII因子(activated factor VII，F(xiàn)VIIa)能降低LPS誘導(dǎo)肺、腎組織的血管滲漏，該作用在內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor，EPCR)缺陷鼠上沒有表現(xiàn)出來，應(yīng)用EPCR單克隆抗體則完全抑制了FVIIa對血管屏障的保護作用，結(jié)果表明FVIIa保護血管屏障的作用是通過EPCR實現(xiàn)的[28]。同樣，F(xiàn)Xa通過形成凝血酶參與了凝血的瀑布效應(yīng)，在LPS刺激的HUVECs模型以及CLP導(dǎo)致的膿毒癥模型上，F(xiàn)Xa后處理降低了HUVECs產(chǎn)生HMGB1、TNFα、IL-1β的能力，降低了膿毒癥小鼠HMGB1釋放及其介導(dǎo)的血管高通透性與白細(xì)胞遷移，下調(diào)了IL-6產(chǎn)生，降低死亡率[29]。Ku等[30]的研究也表現(xiàn)，F(xiàn)Xa前處理通過其受體——有效的細(xì)胞蛋白酶受體抑制了LPS引起的分泌型磷脂酶A2 IIA高表達與活性，該作用是通過抑制LPS誘導(dǎo)的胞漿磷脂酶A2及ERK1/2活化實現(xiàn)的。但這些研究均沒有觀察活化的凝血因子在消耗性凝血功能障礙中的作用，因此，今后應(yīng)進一步研究。

3 抑制纖溶系統(tǒng)亢進防治內(nèi)毒素休克引起的凝血功能紊亂

一般認(rèn)為，致病因素作用于機體引起大量微血栓形成后，激活纖溶系統(tǒng)，有利于降解聚集的纖維蛋白，防止微血管阻塞。但是，過度的纖溶系統(tǒng)激活，形成的大量纖維蛋白降解產(chǎn)物會進一步加重微血管損害，引起微循環(huán)障礙與出血，導(dǎo)致病情惡化。為此，抑制纖溶系統(tǒng)亢進對于防治內(nèi)毒素休克引起的凝血功能紊亂具有積極的作用。

靜脈注射纖溶酶抑制劑凝血酸(tranexamic acid，TA)可有效抑制靜脈快速注射LPS提高大鼠血漿D-二聚體、纖溶酶α2-抗纖溶酶復(fù)合物水平的作用，但并沒有影響LPS引起凝血活化、粒細(xì)胞增多、中性粒細(xì)胞活化或脫顆粒、內(nèi)皮細(xì)胞活化、炎癥因子釋放。紅花黃色素降低了CLP大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β的同時，降低了血清TF水平、提高了組織因子途徑抑制物水平，從而改善了大鼠的凝血功能[31]。植物成分Ankaferd不會影響凝血因子的含量，但能夠雙向調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)EPCR與PAI-1表達，表現(xiàn)在早期(LPS作用1 h)抑制EPCR與PAI-1表達，晚期(LPS作用6 h后)上調(diào)EPCR與PAI-1表達，從而發(fā)揮良好的抗出血作用[32]。針對LPS誘導(dǎo)家兔DIC模型的研究[33]發(fā)現(xiàn)，來自蝮蛇的纖維蛋白原溶解酶(fibrinogenase，又稱為FIIa)降低了LPS引起肝、腎損傷，提高了纖維蛋白原濃度、蛋白C活性、血小板數(shù)量、AT-III和組織纖溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator，t-PA)含量，降低了PAI-1水平，延長了凝血時間，從而提高了存活率。體外實驗[33]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IIa上調(diào)了HUVECs的t-PA和尿激酶型纖溶酶原激活劑的表達、下調(diào)了PAI-1表達，直接活化蛋白C。這些研究結(jié)果表明，TA、紅花黃色素、Ankaferd、FIIa從調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的角度干預(yù)了LPS誘導(dǎo)的凝血功能異常。

可見，以糾正纖溶系統(tǒng)活性為切入點，探尋相關(guān)治療策略，對于改善內(nèi)毒素休克或膿毒癥后凝血穩(wěn)態(tài)具有積極的作用。

4 小結(jié)

總之，凝血功能紊亂貫穿了多種致病因素導(dǎo)致內(nèi)毒素休克或膿毒癥的整個發(fā)病過程，與患者的器官損傷、死亡率密切相關(guān)[34]，從早期對抗血液高凝以減少微血栓形成與凝血物質(zhì)消耗、微血栓發(fā)生后補充凝血物質(zhì)以糾正低凝、晚期抑制纖溶系統(tǒng)亢進以避免纖溶產(chǎn)物對微血管的損害等多角度、全方位糾正凝血功能紊亂，對于改善內(nèi)毒素休克預(yù)后具有積極意義。新冠肺炎疫情發(fā)生以來，針對發(fā)展為膿毒癥的重癥患者的臨床研究顯示，以抗凝為治療靶向恢復(fù)患者凝血功能的治療措施可有效改善患者的預(yù)后[35]，進一步提示改善患者機體凝血穩(wěn)態(tài)的重要性。從目前的研究結(jié)果來看，中藥復(fù)方如血必凈注射液，可能多靶點地調(diào)節(jié)內(nèi)毒素休克或膿毒癥后的凝血穩(wěn)態(tài)，以中藥治療為臨床策略防治內(nèi)毒素休克，可能是今后的一個方向。但是，內(nèi)毒素休克或膿毒癥后凝血功能紊亂的發(fā)病機制復(fù)雜，病情變化多端。這也提示我們，在重視凝血功能的同時，要密切關(guān)注其變化規(guī)律，選擇有針對性的藥物與治療時機。一些具有調(diào)節(jié)機體凝血功能但尚未應(yīng)用于內(nèi)毒素休克或膿毒癥治療的藥物，也是今后關(guān)注的熱點。同時，也要探索新的治療措施與方法，以期為內(nèi)毒素休克的防治提供新思路。