龔恒 陳連旭 黃斌

1 清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（北京100084）

2 清華大學(xué)附屬北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院（北京102218）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種發(fā)生于中老年人群的常見肌骨系統(tǒng)疾病，其發(fā)生率及病情進(jìn)展隨年齡的增大而提高。由于該疾病以關(guān)節(jié)軟骨退化、半月板磨損和骨贅形成為突出特征，因而被認(rèn)為是一種退行性改變。KOA在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率很高，在全球范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)的291種疾病中，該病的患病人數(shù)從1990年的1050 萬增加到2010年的1710 萬[1]。流行病學(xué)研究報(bào)告顯示我國(guó)KOA 的發(fā)病率為5.5%～10.8%[2]。目前所應(yīng)用的KOA 治療手段都無法從根本上逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展進(jìn)程，在疾病晚期，常常需要全膝關(guān)節(jié)置換等手術(shù)治療。目前針對(duì)非終末期的骨關(guān)節(jié)炎患者，國(guó)際上興起了以間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植技術(shù)為主的治療方法，在國(guó)外廣受關(guān)注并應(yīng)用于臨床，在國(guó)內(nèi)還僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和較小規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)階段。本綜述主要通過Pubmed數(shù)據(jù)庫，以“Mesenchymal Stem Cells、Intra-Articular Injection、Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，主要關(guān)注了＜Stem cells＞、＜Osteoarthritis Cartilage＞、＜Transplantation＞等雜志發(fā)表的有關(guān)MSCs 的基礎(chǔ)、動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)，就MSCs促進(jìn)軟骨再生的機(jī)制、關(guān)節(jié)腔注射MSCs的療效、給藥的不同方法及MSCs 注射的副反應(yīng)等方面進(jìn)行總結(jié)，為國(guó)內(nèi)進(jìn)行MSCs的研究和應(yīng)用提供參考。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具備向軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞等間葉組織分化的能力，對(duì)人體結(jié)締組織的支持維護(hù)起部分作用的成體干細(xì)胞，在人體骨髓、脂肪、滑膜等組織中廣泛存在[3]。從不同部位收集并培養(yǎng)出的MSCs 在免疫表型、多向分化能力上存在不同程度的差異。Barry 等[4]分析了膝關(guān)節(jié)周圍不同組織來源的MSCs的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived MSCs，AD?MSCs）和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow de?rived MSCs，BM-MSCs）都具備很強(qiáng)的增殖分化能力，而其他部位干細(xì)胞的增殖分化活性相對(duì)較弱。因此，臨床上也常用脂肪和骨髓來源的MSCs 作為“種子細(xì)胞”來對(duì)患者進(jìn)行治療。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制

針對(duì)MSCs 和KOA 的關(guān)系研究較多。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MSCs 在結(jié)締組織的再生和損傷修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)MSCs組織修復(fù)的機(jī)制主要表現(xiàn)在兩方面：自身分化形成組織細(xì)胞和促進(jìn)周邊細(xì)胞向缺損組織轉(zhuǎn)化。

一方面MSCs 能直接分化形成相關(guān)組織來補(bǔ)充該損傷部位的缺損[6]。干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)表明，MSCs 作為一種多能干細(xì)胞，其本身具備多向分化的能力。將MSCs 進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β），MSCs 可向軟骨細(xì)胞方向分化[7]，研究人員可通過檢測(cè)培養(yǎng)基中關(guān)節(jié)軟骨的特殊成分如：硫酸軟骨素、Ⅱ型膠原蛋白等直接觀測(cè)到軟骨組織的生成。由于MSCs 本身所具備的分化能力，也催生了生物支架技術(shù)：將MSCs 植入到生物支架中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，再將生物支架植入軟骨缺損部位，以其本身的軟骨化能力，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)。

另一方面，MSCs 在受到周邊微環(huán)境的作用時(shí)，可以分泌細(xì)胞活性因子促進(jìn)其周圍的細(xì)胞再生，這種旁分泌作用稱為營(yíng)養(yǎng)作用（trophic）[8]。目前認(rèn)為，MSCs這種對(duì)周邊細(xì)胞的旁分泌作用是促使軟骨修復(fù)的主要途徑[9]。研究表明[10]，MSCs 通過細(xì)胞的出胞作用，形成大量外泌體（exosome），這些外泌體攜帶各種營(yíng)養(yǎng)因子及MicroRNA（miRNA），通過旁分泌作用，促進(jìn)周圍細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。將MSCs 所形成的外泌體分離單獨(dú)培養(yǎng)，同樣可以達(dá)到軟骨修復(fù)的目的[11]：研究人員構(gòu)建了關(guān)節(jié)軟骨缺損的大鼠模型，分別注射MSCs外泌體和磷酸鹽緩沖液，在第6周和第12周解剖膝關(guān)節(jié)，在大體和鏡下可以觀察到明顯再生的關(guān)節(jié)軟骨。因此，有研究者[9]認(rèn)為，直接分離MSCs 中針對(duì)軟骨細(xì)胞修復(fù)而形成的外泌體并將其應(yīng)用于臨床，可能會(huì)是未來治療OA的新方向。但目前MSCs所生成的外泌體成分復(fù)雜，很難將其徹底完全解析。有研究者發(fā)現(xiàn)[12]，將人臍帶血MSCs 內(nèi)的血小板反應(yīng)蛋白-2（thrombospondin-2，TSP-2）基因表達(dá)阻斷后，與軟骨母細(xì)胞共同培養(yǎng)，會(huì)使后者合成的硫酸軟骨素和軟骨生成減少；而在培養(yǎng)基中加入外源性的TSP-2 后，會(huì)使軟骨母細(xì)胞的軟骨化能力增強(qiáng)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)將TSP-2 單獨(dú)注入該模型中，軟骨缺損處將出現(xiàn)少量的透明軟骨，而將臍帶血MSCs 的TSP-2 分泌進(jìn)行阻斷，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則會(huì)發(fā)現(xiàn)透明軟骨生成明顯減少。因此，他們認(rèn)為TSP-2是MSCs 生成的外泌體中促進(jìn)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的有效成分之一。此外，miRNA 作為一種可以特異性抑制目標(biāo)蛋白基因表達(dá)的小分子備受關(guān)注，相關(guān)研究也表明外泌體中所含有的多種miRNA 在誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生成、抑制骨關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展等方面也扮演了重要角色，例如miRNA-23b 可以通過下調(diào)蛋白激酶A（pro?tein kinase A，PKA）促進(jìn)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[13]，miR?NA-145 可以特異性抑制Smad3 基因的表達(dá)以減少基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinases，MMP-13）的產(chǎn)生[14]。因此，依靠這種旁分泌作用，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠作為組織細(xì)胞的儲(chǔ)存庫，當(dāng)組織發(fā)生損傷時(shí)，可以再生出受損組織以保證人體正常的生理活動(dòng)。

此外，間充質(zhì)干細(xì)胞也可參與調(diào)控T 細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步抑制骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥反應(yīng)，從而減緩KOA 的病程進(jìn)展[4，6，8]。研究發(fā)現(xiàn)，從終末期膝關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)提取出的MSCs，其分裂分化活性都顯著低于正常人體中的MSCs[15]。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體內(nèi)各部位MSCs的成軟骨能力會(huì)逐漸下降[4]。有研究構(gòu)建了退行性膝關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型[16]，研究人員用超順磁性氧化鐵納米粒子對(duì)BM-MSCs進(jìn)行標(biāo)記，然后將其注射到膝關(guān)節(jié)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然沒能觀測(cè)到新的軟骨形成，但在MRI下可以觀察到標(biāo)記的BM-MSCs會(huì)在注射后8～24小時(shí)內(nèi)向軟骨缺損區(qū)移動(dòng)，說明MSCs 對(duì)組織損傷存在主動(dòng)修復(fù)傾向。綜上所述，MSCs在遏制KOA的病情進(jìn)展方面存在巨大的治療潛力。

3 關(guān)節(jié)內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究

目前國(guó)外針對(duì)MSCs的臨床研究有很多，已有相關(guān)的藥物問世[17]。目前普遍采取的方法是將MSCs 制成細(xì)胞懸液，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射，這種方式簡(jiǎn)單易行，對(duì)患者損傷較小，在臨床試驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。

作為治療細(xì)胞的MSCs 來源比較廣泛，其中BMMSCs 和ADMSCs 是目前臨床試驗(yàn)常用的治療細(xì)胞。研究表明ADMSCs在免疫抑制、防止OA進(jìn)一步惡化方面的特點(diǎn)更為突出[18]，而在軟骨化方面相較于BMMSCs 并不占優(yōu)勢(shì)[19]。但臨床上提取BM-MSCs 相對(duì)困難，且BM-MSCs 相對(duì)缺乏，僅占吸出物的0.001%～0.002%[20，21]，而ADMSCs 可以占到吸出物有核細(xì)胞的1%～7%[22]。更重要的是，ADMSCs 的分裂分化活性相比于BM-MSCs 更不易受患者年齡和病情等因素影響[23]。因此，目前選擇ADMSCs進(jìn)行臨床研究較多。

長(zhǎng)期隨訪結(jié)果表明，ADMSCs對(duì)Kellgren-Lawrence分級(jí)為Ⅰ～Ⅲ級(jí)的KOA患者治療效果良好。Jo等[24]從患者腹部抽取脂肪分離干細(xì)胞并體外培養(yǎng)，將獲取的ADMSCs 分三個(gè)濃度梯度：1×107個(gè)（低劑量）、5×107個(gè)（中劑量）、1×108個(gè)（高劑量），分別注入三組患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)，在干預(yù)后1月、2月、3月和6月進(jìn)行膝關(guān)節(jié)功能評(píng)估，3月和6月時(shí)進(jìn)行膝關(guān)節(jié)核磁共振掃描，6月時(shí)進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組患者的膝關(guān)節(jié)功能及癥狀明顯改善，MRI 和關(guān)節(jié)鏡檢查顯示明顯的軟骨再生，且軟骨再生情況與MSCs 的劑量有關(guān)，高濃度組的軟骨再生情況明顯高于低劑量組。一項(xiàng)評(píng)估MSCs 緩解骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀如疼痛、僵硬程度、活動(dòng)能力的臨床研究中（phaseⅠ/Ⅱ）[25]，納入32 名患者，其中包括Kellgren-Lawrence分級(jí)為Ⅳ級(jí)的患者，分別注射10×106個(gè)（低劑量）、10×107個(gè)（高劑量），并與注射透明質(zhì)酸的患者作對(duì)照，進(jìn)行隨機(jī)雙盲研究，利用疼痛視覺模擬評(píng)分法（visual analogue scale/score，VAS）和膝關(guān)節(jié)炎評(píng)分系統(tǒng)（The Western Ontatario and McMaster Uni?versities，WOMAC）量表評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。通過四年的隨訪，發(fā)現(xiàn)高劑量組治療的膝關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀的改善程度明顯高于低劑量組和對(duì)照組。其他的臨床研究，通過膝關(guān)節(jié)損傷和骨關(guān)節(jié)炎評(píng)分（the knee injury and osteoarthritis score，KOOS）、WAMAC 等量表評(píng)分，結(jié)合膝關(guān)節(jié)MRI 和關(guān)節(jié)鏡檢查，證明關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ADMSCs對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者的功能改善、癥狀緩解甚至軟骨再生都有良好的治療效果[26-29]。

有臨床研究比較了多次膝關(guān)節(jié)注射和單次膝關(guān)節(jié)注射ADMSCs 的療效。研究中[30]納入了30 名患者，將其分為三組，一組患者進(jìn)行單次的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSCs：100×106，一組患者注射后6 個(gè)月后進(jìn)行再次注射，每次注射劑量為100×106，對(duì)照組采取傳統(tǒng)療法，利用WOMAC 和KOOS評(píng)分量表進(jìn)行評(píng)估。隨訪1年，結(jié)果顯示：相對(duì)于對(duì)照組，關(guān)節(jié)注射ADMSCs的患者膝關(guān)節(jié)功能改善明顯，兩次注射ADMSCs 的患者得到更穩(wěn)定的臨床效果。該研究不僅證實(shí)了注射ADMSCs的治療效果，也證明了膝關(guān)節(jié)多次注射ADMSCs 臨床效果更好。但目前針對(duì)多次給藥和單次給藥的對(duì)比性研究較少，尚需更多的臨床研究結(jié)果加以證實(shí)。

臨床實(shí)驗(yàn)所使用的MSCs 懸液大多是以生理鹽水作為載體進(jìn)行關(guān)節(jié)注射，也有研究將富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）和透明質(zhì)酸（hyaluronic ac?id，HA）作為載體，聯(lián)合MSCs進(jìn)行給藥[31]。研究者利用患者自身髕下脂肪墊分離提取ADMSCs，在體外擴(kuò)增后，聯(lián)合自身來源的PRP進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔注射，對(duì)照組給予相同劑量的PRP，利用Lysholm 量表評(píng)分、Tegner 活動(dòng)指數(shù)量表和疼痛VAS 評(píng)分量表進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組患者的治療效果優(yōu)于對(duì)照組。在MSCs聯(lián)合HA及PRP 進(jìn)行的對(duì)比性研究中，實(shí)驗(yàn)組患者不僅臨床癥狀得到明顯改善，而且在術(shù)前和術(shù)后多次的MRI 檢查中，通過測(cè)量脛骨平臺(tái)軟骨厚度并進(jìn)行術(shù)前和術(shù)后對(duì)比，均顯示出明顯的軟骨再生[32]。相關(guān)研究[33]探討了MSCs 與PRP 和HA 共同使用后的聯(lián)合促進(jìn)效應(yīng)，他們觀察到MSCs 結(jié)合PRP 及HA 關(guān)節(jié)內(nèi)注射后，可以顯著增加MSCs 的增殖和軟骨分化能力，這與PRP 及HA 成分中含有豐富的生長(zhǎng)因子有關(guān)。但也有研究[34]表明，MSCs聯(lián)合PRP膝關(guān)節(jié)腔注射治療后，患者在膝關(guān)節(jié)功能和疼痛的緩解方面，與單獨(dú)注射MSCs 無明顯差別，但該研究缺乏相應(yīng)的影像學(xué)或組織學(xué)證據(jù)。

此外，目前臨床上多采用自體MSCs 進(jìn)行相關(guān)研究，一方面，MSCs來源廣泛，容易獲取，且自體MSCs分離、擴(kuò)增后注入人體，可以避免免疫排斥反應(yīng)，另一方面，使用自體MSCs可以有效地規(guī)避醫(yī)學(xué)倫理問題。雖然自體MSCs 具備很多優(yōu)勢(shì)，但是其劣勢(shì)也十分明顯：一是患者需要二次手術(shù)，會(huì)增加患者的抵觸情緒；二是MSCs的分化能力會(huì)隨患者的年齡增長(zhǎng)而減弱，因此自體來源的MSCs 針對(duì)老年患者的治療效果可能不佳。應(yīng)用同種異體MSCs 治療KOA 也取得良好的臨床效果[35]。研究者使用異體來源的BM-MSCs 進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，對(duì)照組注射HA，并在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了組內(nèi)對(duì)照，隨訪時(shí)使用WOMAC、VAS評(píng)分量表評(píng)估患者臨床癥狀的改善程度，術(shù)前和術(shù)后進(jìn)行膝關(guān)節(jié)核磁共振掃描，評(píng)估患者的關(guān)節(jié)軟骨變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組患者的臨床癥狀和軟骨質(zhì)量的改善情況都明顯優(yōu)于對(duì)照組。有研究者[36]使用同種異體MSCs對(duì)患者進(jìn)行治療，長(zhǎng)達(dá)7年的隨訪結(jié)果顯示，患者膝關(guān)節(jié)軟骨缺損部位出現(xiàn)了軟骨再生，且與周邊固有的軟骨整合良好。但該研究不是關(guān)節(jié)內(nèi)直接注射同種異體MSCs，而是利用MSCs與透明質(zhì)酸混合形成凝膠狀物質(zhì)，對(duì)軟骨缺損進(jìn)行修補(bǔ)，3年后的MRI結(jié)果顯示軟骨缺損處有新的軟骨形成，釓增強(qiáng)造影顯示關(guān)節(jié)表面有大量造影劑富集。

針對(duì)MSCs 治療KOA 的研究，研究對(duì)象大部分都是Kellgren-Lawrence 分級(jí)為Ⅲ級(jí)以下患者，顯示出較好的臨床效果。但針對(duì)Kellgren-Lawrence 分級(jí)Ⅲ級(jí)以上患者的治療，相關(guān)研究較少。近年研究報(bào)道了采用自體BM-MSCs 對(duì)12 名Kellgren-Lawrence 分級(jí)Ⅲ級(jí)以上患者進(jìn)行治療[37]，24個(gè)月的隨訪結(jié)果顯示：大部分患者在VAS及KOOS評(píng)分上都有較為明顯的好轉(zhuǎn)，但MRI上并未發(fā)現(xiàn)明顯的軟骨再生。分析認(rèn)為這是由于晚期的膝關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的MSCs 軟骨分化能力減弱造成的。該研究與其他研究顯示軟骨再生的結(jié)果不一致[24，36，38]。另一研究[32]同樣對(duì)Kellgren-Lawrence 分級(jí)Ⅲ級(jí)以上患者進(jìn)行研究，應(yīng)用臍帶血來源的MSCs 進(jìn)行治療，觀測(cè)到了很好的軟骨再生情況，認(rèn)為與臍帶血MSCs的軟骨分化能力較強(qiáng)有關(guān)。目前關(guān)于MSCs對(duì)終末期KOA患者治療的應(yīng)用尚需進(jìn)一步研究。

從目前所進(jìn)行的臨床研究中長(zhǎng)期隨訪結(jié)果來看，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSCs 尚未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[39]。一項(xiàng)隨機(jī)分組對(duì)照研究[27]納入53名Kellgren-Lawrence分級(jí)為Ⅱ～Ⅳ級(jí)的患者，分兩次注射5×107數(shù)量的MSCs，以注射透明質(zhì)酸為對(duì)照，隨訪12 個(gè)月，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組患者僅有輕微的不良反應(yīng)，如局限性腫脹、進(jìn)針點(diǎn)疼痛等，與對(duì)照組相比無顯著性差別。且這些不良反應(yīng)均在7天內(nèi)自行緩解。目前在各種動(dòng)物及人體中進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)中，均未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[26，29，40-42]，在一項(xiàng)研究MSCs 療效的的薈萃分析[43]中，參與統(tǒng)計(jì)的11 項(xiàng)研究均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，顯示利用MSCs 治療骨關(guān)節(jié)炎具備臨床所要求的安全性和可靠性。

4 總結(jié)

目前針對(duì)MSCs 的相關(guān)研究仍然存在一些問題。由于MSCs 的特殊性，無法擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模，目前的研究樣本一般不超過50人，缺少大規(guī)模的雙盲隨機(jī)對(duì)照研究，研究結(jié)果缺乏足夠的說服力。同時(shí)由于自體來源MSCs 的諸多限制，無法大規(guī)模開發(fā)和臨床應(yīng)用。但MSCs作為一種具備多向分化能力的組織干細(xì)胞，因其獨(dú)特的組織學(xué)特性已應(yīng)用于臨床的多個(gè)領(lǐng)域，如應(yīng)用于治療肝臟組織纖維變性[44]和促進(jìn)骨骼肌再生[45]等，均取得了良好的臨床效果。在膝關(guān)節(jié)炎治療方面，利用MSCs強(qiáng)大的軟骨化能力，可以使關(guān)節(jié)軟骨的損傷得以修復(fù)，停止甚至逆轉(zhuǎn)膝骨關(guān)節(jié)炎的病情發(fā)展。未來需要加強(qiáng)同種異體MSCs 治療KOA 的研究，篩選優(yōu)化分化能力強(qiáng)的MSCs，進(jìn)行商業(yè)化規(guī)模化開發(fā)，為廣大骨關(guān)節(jié)炎患者帶來福音。