劉 艷，戴 鵬，朱運峰

（1.北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院，北京 100044；2.河南省華之源生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是細胞分泌的脂質(zhì)雙分子層膜包繞形成的囊狀結(jié)構(gòu)，一般直徑介于30～5000 nm之間，幾乎所有種類的細胞都可向其所生存的微環(huán)境中分泌產(chǎn)生EV［1-2］，而外泌體（exosome）則是來源于內(nèi)吞途徑的納米級EV。目前認為外泌體是由各種細胞分泌的、直徑大小在40～100 nm之間多形性囊泡樣小體結(jié)構(gòu)，是細胞間信號傳遞的“膜信使”；而且外泌體包裹的分子物質(zhì)可避免被體液中的酶降解，這一特點使外泌體成為新型的天然藥物運載系統(tǒng)。本文將對外泌體的生物功能、外泌體載藥系統(tǒng)及其臨床應(yīng)用的可能性進行概述。

1 外泌體

早在20世紀(jì)40年代，CHARGAFF等［3］發(fā)現(xiàn)，在健康人血漿中EV可以作為血小板的微顆粒促進凝血；70年代中期，DE BROE等［4］發(fā)現(xiàn)，直腸癌微絨毛細胞能向微環(huán)境中釋放質(zhì)膜囊泡；直到80年代初期，PAN等［5］發(fā)現(xiàn)，在網(wǎng)織紅細胞向紅細胞成熟的過程中，從細胞培養(yǎng)液中能分離出一種大小約為50 nm、含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的囊泡樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)，將其命名為“外泌體”。90年代末期，ZITVOGEL等［6］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肽脈沖技術(shù)處理的腫瘤樹突狀細胞來源的外泌體以T細胞依賴性方式消除或抑制腫瘤的生長。近年來，隨著細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究技術(shù)不斷發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)外泌體廣泛存在于血液、尿液和乳汁等多種體液中。

1.1 外泌體的來源

外泌體是來源于內(nèi)吞途徑的納米級EV。內(nèi)吞作用是細胞通過質(zhì)膜內(nèi)陷使細胞質(zhì)、大分子、膜和受體內(nèi)化的過程，在膜斷裂后成為細胞內(nèi)囊泡。初級內(nèi)吞囊泡與早期內(nèi)體（early endosome）融合，啟動“貨物”分選。早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體（late endosome），并最終與溶酶體融合。在成熟期間，一些內(nèi)體會產(chǎn)生許多以管腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILV）為特征的中間細胞器，被稱為多泡體（multivesicular bodies，MVB）。MVB與質(zhì)膜融合釋放ILV至細胞外空間，從而產(chǎn)生外泌體［7］。外泌體是細胞釋放到外界的EV中的一類。EV還包括較大的囊泡，如微囊泡、凋亡小體以及源自質(zhì)膜的較小的囊泡，如核外顆粒體。

1.2 外泌體的生理功能

由不同種類細胞分泌的外泌體，其內(nèi)容物的含量也十分豐富。其中包括組成外泌體結(jié)構(gòu)蛋白和特異性蛋白。此外，外泌體內(nèi)腔中還檢測到多種核酸成分，其中包括mRNA、miRNA、長鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA等。隨著外泌體研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)外泌體具有多種功能，如外泌體在細胞間物質(zhì)傳遞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的通訊載體的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種類型的細胞如各種造血系統(tǒng)的細胞、多種干細胞和前體細胞及許多細胞株在體內(nèi)環(huán)境或體外培養(yǎng)條件下均能產(chǎn)生并分泌外泌體。由于外泌體的母細胞來源不同，所以不同類型和起源的外泌體的成分和功能也不同。在不同生理和病理條件下外泌體都能發(fā)揮作用，一方面調(diào)節(jié)諸如干細胞維護、組織修復(fù)、免疫監(jiān)視和凝血等生理過程，另一方面還參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的轉(zhuǎn)移及病原體感染等諸多病理過程［8］。

截止目前，由于外泌體所具有的特殊納米級結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能特點，針對外泌體的臨床研究主要集中在以下2個方面：一方面是通過生物學(xué)技術(shù)分析外泌體在生理和病理狀態(tài)下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的詳細分子機制，明確其生理和病理過程，并期望能通過外泌體自身所攜帶的特異性蛋白和核酸等分子作為腫瘤早期診斷標(biāo)志物以及臨床治療的藥物靶點；另一方面，基于外泌體自身的結(jié)構(gòu)特點和生物學(xué)功能，其作為藥物載體和治療系統(tǒng)用于臨床惡性腫瘤疾病的治療成為近年外泌體研究的熱點。外泌體可作為天然的藥物運載系統(tǒng)，將治療分子、藥物等運送至靶細胞，進而發(fā)揮治療作用。

2 外泌體載藥系統(tǒng)

2.1 外泌體載藥系統(tǒng)的應(yīng)用

外泌體來源于機體細胞，可作為天然的生物載體，能進行長距離的細胞間物質(zhì)輸運和信號傳遞［9-10］。這種細胞間的通訊在機體的生理和病理過程中至關(guān)重要［11］，已被用于多種疾病和腫瘤的治療與組織損傷修復(fù)等疾病的研究［12-13］。主要方法分為2種：一是某些特殊細胞分泌的外泌體包含有治療作用的有效分子，可將外泌體作為生物藥物應(yīng)用于免疫抑制和活化、血管生成以及組織損傷修復(fù)等；另一則是利用工程化改造后的外泌體作為藥物載體將治療藥物運送至治療部位［14］。

近年來，外泌體載藥系統(tǒng)一直是眾多研究者關(guān)注的焦點。2010年，SUN等［15］在早期的動物實驗中對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的膿毒性休克小鼠模型進行腹腔注射含姜黃素的外泌體。結(jié)果表明，外泌體可用作抗炎藥物的體內(nèi)載體。自此，揭開了外泌體介導(dǎo)藥物傳遞系統(tǒng)研究的新篇章。他們改用鼻腔內(nèi)注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載有姜黃素或信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3抑制劑的外泌體可用于治療LPS誘導(dǎo)的腦炎癥、實驗性自身免疫性腦炎和GL26腦腫瘤模型［16］。隨后又有研究者發(fā)現(xiàn)，向野生型小鼠靜脈注射攜帶小干擾核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）序列的外泌體，能顯著抑制阿爾茨海默病治療靶點β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1的表達［17-18］。實際上，電穿孔、超聲、低滲透析、反復(fù)凍融、擠壓和細胞介導(dǎo)等許多不同的方法迄今已用于各種治療藥物包括小分子、納米顆粒、蛋白質(zhì)和寡核苷酸等的外泌體裝載［19-21］。除此之外，越來越多的研究表明，外泌體載藥系統(tǒng)在癌癥［22-24］、腦梗死［25］和神經(jīng)退行性疾?。?6-27］等各種疾病模型的研究中也都顯示出比較理想的治療效果。

此外，外泌體的生成是一個自然過程，與其他人工合成的載藥系統(tǒng)相比，其裝載方案有多種，如分泌前細胞工程裝載和純化后外泌體裝載。但需要注意的是，外泌體裝載合成的反應(yīng)條件可能會對外泌體及其母細胞產(chǎn)生不利的影響［19］，而且體外實驗和體內(nèi)動物模型實驗都需要大量的母細胞分泌產(chǎn)生足夠的外泌體。因此，如何提高外泌體載藥系統(tǒng)的產(chǎn)量應(yīng)用于臨床疾病的治療將是一個挑戰(zhàn)［28］。同時，利用外泌體進行體內(nèi)藥物遞送時還必須考慮以下因素：①外泌體和細胞之間相互作用的模式是否與所遞送的治療劑作用機制一致，是否會對所遞送的治療劑功效有所影響；②外泌體廣泛參與了機體的生物過程，大量的外源性外泌體的存在可能會破壞內(nèi)源性外泌體介導(dǎo)的細胞間通訊；③一些尚不明了甚至未知的機制可能會導(dǎo)致不良副作用，如外泌體表面蛋白質(zhì)的脫靶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還有其他如癌基因［29］和病毒miRNA［30］，或朊病毒顆粒［31］以及外泌體純化過程中未能去除的可溶性顆粒因子［32］等物質(zhì)在外泌體中一起遞送，均有可能產(chǎn)生不良副作用。提示純化方案中采用嚴(yán)格的質(zhì)控與安全性分析使這些復(fù)雜的影響因素最小化，對體內(nèi)和體外研究至關(guān)重要［33］。

2.2 外泌體載藥系統(tǒng)的優(yōu)勢

近年來，藥物載體層出不窮，基于脂質(zhì)體的載體和基于聚合物的載體是目前廣泛研究的2類藥物載體，然而一般的納米載體在體內(nèi)循環(huán)時易被肝和脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細胞吞噬，且血液中循環(huán)時間短，穩(wěn)定性差，靶向性低［34-35］。然而，外泌體作為來源于細胞的納米級囊泡狀結(jié)構(gòu)，具有天然的生物學(xué)起源和復(fù)雜性，在細胞間信息交流的過程中起著重要作用，并且它在人體內(nèi)分布廣泛，可穿過細胞膜，不易引起免疫反應(yīng)，作為藥物載體具有獨特優(yōu)勢，為基因、抗腫瘤等藥物的輸運開辟了一條新的道路。

首先，外泌體天然的生物學(xué)起源為細胞內(nèi)源性治療因子的產(chǎn)生和裝載提供了特有的機會。此時，治療藥物、寡核苷酸和納米粒子等可被送入細胞，隨后重新包裝成分泌的囊泡［18，26］。利用細胞產(chǎn)生、裝載和分泌釋放載藥外泌體使治療藥物裝載過程得到簡化，為特定位點（如內(nèi)腔和囊泡膜）的藥物裝載提供了基礎(chǔ)，并且還使不易裝載的物質(zhì)具有更高的吸收效率和傳遞效率。

其次，外泌體可穿透某些生物屏障如血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），到達治療靶點進行給藥。如WIKLANDER等［36］的研究指出，非靶向的外泌體可在腫瘤部位累積。外泌體還能利用實體瘤的增強滲透滯留效應(yīng)，優(yōu)先透入腫瘤組織的血管壁，促進大分子物質(zhì)在腫瘤組織中的選擇性分布［37］。大腦是藥物遞送的又一重要靶標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中利用外泌體裝載姜黃素和過氧化氫酶也證明其在神經(jīng)保護方面的作用［16，27］。此外，鼻內(nèi)遞送也可作為穿過BBB進行外泌體載藥系統(tǒng)遞送的理想給藥途徑［38］。TOMINAGA等［39］的研究中還發(fā)現(xiàn)，納米級EV結(jié)構(gòu)可能具有繞過BBB的內(nèi)在機制，為藥物遞送至大腦提供新思路。

第三，研究者認為，體內(nèi)某些外泌體具有很強的穩(wěn)定性，可避免被巨噬細胞吞噬和溶酶體所降解，為體內(nèi)外泌體載藥系統(tǒng)的長時間循環(huán)和長時間暴露于炎癥等刺激環(huán)境時提供保護［40］。也有報道稱，不同母細胞來源的外泌體，向不同類型的細胞輸運內(nèi)容物的效率不同［41］。所以，了解和利用細胞選擇性相互作用的機制，可使裝載藥物的外泌體更易于靶向治療部位。

2.3 外泌體的工程化改造

由于外泌體中含有大量的蛋白質(zhì)和核酸，因此外泌體能將這些物質(zhì)轉(zhuǎn)運至靶細胞，對機體生物學(xué)功能發(fā)揮調(diào)控作用?；谕饷隗w自身的結(jié)構(gòu)特點和生物學(xué)功能，其作為藥物載體和治療系統(tǒng)用于臨床惡性腫瘤疾病的治療成為近年外泌體研究的熱點。

外泌體是細胞衍生的納米囊泡（30～100 nm），介導(dǎo)細胞間通訊，又是候選的治療劑。但外泌體信息傳遞（如mRNA）效率低及缺乏設(shè)計外泌體的方法阻礙了它們治療干預(yù)的發(fā)展。目前的大部分研究是通過基因工程技術(shù)將靶向肽定位到外泌體膜上，從而使外泌體獲得靶向性。ALVAREZ-ERVITI等［17］對樹突狀細胞進行狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）-溶酶體相關(guān)膜蛋白（RVG-Lamp2b）的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，從而使樹突狀細胞分泌的外泌體上連接有RVG多肽，最后將重組人β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1 siRNA和GAPDH siRNA質(zhì)粒利用電穿孔技術(shù)裝載到連接RVG肽的外泌體中，最終獲得具有靶向性的RVG-Exo外泌體復(fù)合物。此外，KOJIMA等［42］報道了一套外泌體轉(zhuǎn)移到細胞的設(shè)備，可在設(shè)計的哺乳動物細胞中高效產(chǎn)生設(shè)計好的外泌體，實現(xiàn)有效的細胞間通訊。TIAN等［43］通過一種簡單、快速的化學(xué)方法將具有靶向性的工程化環(huán)肽〔cyclo（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys）peptide，c（RGDyK）〕與外泌體表面綴合。一方面，在短暫的大腦中動脈閉塞小鼠模型中，經(jīng)c（RGDyK）修飾的外泌體〔c（RGDyK）-conjugated exosomes，cRGD-Exo〕在靜脈內(nèi)給藥后可靶向缺血性腦損傷區(qū)域。另一方面，將姜黃素加載到cRGD-Exo外泌體上，外泌體的施用對病變區(qū)域的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡具有強烈的抑制作用。該研究表明，外泌體作為靶向缺血性腦損傷的遞送載體的可能性，并提供了快速和大規(guī)模生產(chǎn)功能化外泌體的策略。

3 結(jié)語

藥物的靶向輸送系統(tǒng)是保障藥物到達靶向部位的有效手段，使靶部位的有效藥物濃度最高，從而達到最佳治療效果。因此，需要對所設(shè)計的外泌體載藥系統(tǒng)是如何體內(nèi)輸運、達到預(yù)定靶組織以及運送治療藥物等有充分的了解。一方面是外泌體局部靶向組織給藥，如鼻內(nèi)遞送至腦組織［16，27］或直接腫瘤皮下注射［44］；另一方面是外泌體全身給藥，這其中就存在流體動力學(xué)、生物學(xué)屏障和免疫清除之間復(fù)雜的相互作用。對于脂質(zhì)體而言，人們對其大小、電荷以及靈活性的細微變化是如何調(diào)控其在血液中的體內(nèi)循環(huán)、穿透屏障等均有相對全面的了解［45］。但對于外泌體來說，還要考慮更多的影響因素［40-41］。除此之外，需要注意的是，外泌體載藥系統(tǒng)的臨床轉(zhuǎn)化研究與非臨床研究具有一定的差異。例如，某些生物屏障的大小在動物模型和人類之間就存在顯著差異［45］。

上述外泌體優(yōu)勢的具體利用取決于臨床治療時的具體情況，其中包括藥物的化學(xué)性質(zhì)、遞送方式、靶組織和作用機制等，這些特征與負荷效率、細胞攝取、給藥途徑和潛在副作用等密切相關(guān)。因此，對于每個載藥系統(tǒng)，必須仔細權(quán)衡所采用的外泌體優(yōu)勢與局限性，而且臨床轉(zhuǎn)化仍需要提高有效的外泌體分離、藥物負載技術(shù)及詳細的外泌體生理學(xué)功能知識。相信隨著外泌體藥物輸送機制以及健全藥物輸運機制等難題的克服，外泌體介導(dǎo)的藥物輸送將在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。