崔艷麗，何利珍，李小亮

作者單位：焦作市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 焦作454000

急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）在臨床上的發(fā)生率非常高的，而腎臟缺血/再灌注損傷（renal ischemia/reperfusion injury，I/R）是其主要原因［1］。研究表明，ARF的預(yù)后不僅取決于損傷的嚴(yán)重程度，而且取決于損傷后腎臟修復(fù)和再生情況，因此減輕急性期損傷和促進(jìn)腎組織再生的因素均能改善ARF的預(yù)后。中介素是降鈣素基因相關(guān)肽超家族的新成員［2］，可非選擇性結(jié)合于該家族的共同受體即降鈣素受體樣受體/受體活性修飾蛋白系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［3］，在調(diào)節(jié)心血管、消化、泌尿、呼吸以及神經(jīng)內(nèi)分泌功能等方面有著重要的作用［4］。

目前關(guān)于中介素的研究多集中與動(dòng)物器官、細(xì)胞水平，關(guān)于基因信號(hào)通路的報(bào)道尚較少，也沒有相應(yīng)的臨床試驗(yàn)，故從磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，m TOR）信號(hào)通路（PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路）探討中介素對(duì)器官的保護(hù)作用及其機(jī)制，對(duì)后續(xù)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究尤為重要。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC；中介素購(gòu)自Phoenix；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；自噬標(biāo)志蛋白beclin-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）和β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；聚偏二氟乙烯膜購(gòu)自Millipore公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自Thermo公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；中介素快速檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)于上海桑戈生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)18101913。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣本采集及檢測(cè) 采集焦作市第二人民醫(yī)院2015年12月至2018年6月間確診的急性腎衰竭病人45例，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。所有研究對(duì)象入院24 h內(nèi)晨起空腹采集肘靜脈血5 mL，室溫條件下靜置30 min，3 000×g離心15 min后抽取血清，置于收集管中，-80℃冰箱中保存。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清中介素水平。

1.3 NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)和處理 NRK-52E細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%二氧化碳，37℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組，正常細(xì)胞，不做任何處理；②I/R模型組，細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，不加任何干預(yù)物；③中介素干預(yù)組，加入不同濃度的中介素（2，4，6 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)；④PI3K抑制劑LY290042組；⑤中介素+LY290042干擾組。

1.4 NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立 NRK-52E細(xì)胞放置于無(wú)血清培養(yǎng)基中，在含有1%氧氣，5%二氧化碳和94%氮?dú)鈼l件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，然后將細(xì)胞置于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h。③④⑤組的細(xì)胞在進(jìn)行缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)前加入相應(yīng)試劑預(yù)處理4 h。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 將NRK-52E細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度的中介素（2、4、6 μmol/L）作用48 h后，采用MTT法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞的存活情況。每孔加入20 μL 0.5%的MTT溶液，37℃條件下孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，然后每孔加150 μL二甲基亞砜，緩慢振蕩10 min后，于波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定OD值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 NRK-52E細(xì)胞與中介素（4 μmol/L）作用后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于400 μL緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻后避光孵育15 min。加入10 μL PI染液，混勻后冰浴避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 用預(yù)冷PBS漂洗2次后加入200 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，將刮下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于冰上裂解30 min后，用超聲波細(xì)胞破碎儀間歇裂解30 s，12 000 r/min離心10 min后收集上清液。將制備好的蛋白樣品（40 μg）采用12%SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）垂直電泳進(jìn)行分離，電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，將膜用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h，4℃條件下孵育一抗過夜。次日用TBST 110 r/min振蕩培養(yǎng)，洗滌5次，二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌，用發(fā)光液顯影檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.8 RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 Trizol法提取NRK-52E細(xì)胞總RNA，使用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增引物均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。用β-actin做內(nèi)參，得到相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀測(cè)數(shù)據(jù)主要是計(jì)量數(shù)據(jù)，以s表示，多組比較為單因素方差分析，兩組比較為成組t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性腎衰竭與健康體檢者血清中中介素水平比較 45例ARF組血清中介素水平為（6.4±2.2）ng/mL，顯著高于對(duì)照組水平（2.4±1.2）ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝10.707，P＝0.000），說明ARF病人血清中介素表達(dá)上調(diào)，提示中介素可能在急性腎衰竭病理生理過程中發(fā)揮作用。

2.2 中介素對(duì)NRK-52E細(xì)胞活性的影響 NRK-52E細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)后，細(xì)胞的存活率為（45.3±4.5）%，與對(duì)照組（100±1.4）%相比顯著下降（P＜0.05）。采用不同濃度的中介素（2、4μmol/L、6μmol/L）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞存活率分別為（55.9±2.6）%，（75.4±3.2）%和（86.7±2.9）%，與缺氧/復(fù)氧模型組相比顯著上升（P＜0.05）。表明中介素對(duì)NRK-52E細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧過程有保護(hù)作用。

2.3 中介素對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)處理后的NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明缺氧再?gòu)?fù)氧后，細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，凋亡率為（42.3±3.6）%，與對(duì)照組（10.2±1.7）%相比顯著上升（P＜0.05）。經(jīng)過中介素（4 μmol/L）預(yù)孵育4 h的細(xì)胞凋亡率為（27.6±3.1）%，與缺氧/復(fù)氧模型組相比顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

2.4 中介素對(duì)NRK-52E細(xì)胞自噬水平的影響B(tài)eclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ是細(xì)胞自噬過程中的標(biāo)志性分子，當(dāng)自噬體形成過程中，LC3會(huì)酶解掉一小段多肽形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ跟PE結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-Ⅱ），因此，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的來評(píng)估自噬水平。本研究采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平。圖2結(jié)果表明，缺氧/復(fù)氧后的細(xì)胞beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平均升高（P＜0.05）。與模型組相比，中介素（4 μmol/L）干擾組的細(xì)胞beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞自噬顯著增強(qiáng)。

圖1 中介素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）細(xì)胞凋亡的影響

圖2 中介素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）細(xì)胞自噬水平的影響：A示蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)電泳圖；B示NRK-52E細(xì)胞中beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白水平；C示NRK-52E細(xì)胞中beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA水平

2.5 中介素對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的中介素（2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L）處理細(xì)胞24 h后，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示：在一定濃度范圍內(nèi)，隨著中介素濃度的升高，PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平逐漸下降。與對(duì)照相比，PI3K蛋白磷酸化水平在2 μmol/L時(shí)顯著下降，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平變化同樣顯著下降（P＜0.05）；當(dāng)中介素濃度大于4 μmol/L時(shí)PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平極顯著下降（P＜0.01），表明中介素可以通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

圖3 中介素對(duì)磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白（m TOR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響：A示蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)電泳圖；B示不同濃度中介素誘導(dǎo)下，PI3K、Akt、mTOR表達(dá)水平

2.6 PI3K抑制劑對(duì)中介素誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)和自噬標(biāo)志性蛋白的影響 為了進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在自噬中過程中的作用，使用PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：LY294002+中介素處理組與中介素處理組相比，Akt蛋白的磷酸化水平、mTOR蛋白的磷酸化水平極顯著下降（P＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）），單獨(dú)使用中介素、PI3K抑制劑LY294002，mTOR蛋白的磷酸化水平顯著下降（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著升高（P＜0.05）），表明PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中介素在細(xì)胞自噬中起負(fù)調(diào)控作用。見圖4。

圖4 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制劑對(duì)蛋白激酶B（Akt）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白（m TOR）信號(hào)通路和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)的影響：A示蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)電泳圖；B示PI3K抑制劑LY294002干預(yù)下，中介素誘導(dǎo)的Akt、mTOR、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平

3 討論

中介素作為CGRP超家族的新成員，由于其強(qiáng)大的生物學(xué)效應(yīng)和廣泛的多系統(tǒng)作用特性，在心腦血管、消化、泌尿、呼吸以及代謝等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中介素可以通過對(duì)抗長(zhǎng)期氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制［5］，減輕心、腦、I/R損傷，并具有穩(wěn)定血管內(nèi)皮屏障、減輕血管滲漏等活性。有研究表明中介素在腎臟有大量表達(dá)，作為一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)肽中介素對(duì)腎臟的進(jìn)展性損傷有一定的保護(hù)作用［6］。有報(bào)道指出中介素對(duì)腎血管有舒張作用［7］，向大鼠腎動(dòng)脈注射中介素（100 pmol·kg-1·min-1）可增加腎血流量，但是血壓和心率沒有變化。邱淑怡、高云［8］嘗試大鼠靜脈注射中介素可引起血壓下降，腎血流量增加、腎交感神經(jīng)活性增加，停止注射后血壓恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，而腎血流量在停止注射60 min后仍有顯著增高［9］。

自噬是細(xì)胞維持自身內(nèi)平衡的一個(gè)分解代謝過程［10］，自噬表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)過程中形成的能夠降解長(zhǎng)壽命蛋白以及自體多余的或失去功能的細(xì)胞器的功能，從而維持細(xì)胞的正常功能［11］。自噬的信號(hào)通路主要為兩種：腺苷酸活化激酶信號(hào)通路和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號(hào)通路［12］，前者主要受胞內(nèi)能量水平影響，而后者主要感受營(yíng)養(yǎng)狀況和生長(zhǎng)因子等多種胞外影響因素，調(diào)控細(xì)胞周期、翻譯、轉(zhuǎn)錄和代謝，其中PI3K/Akt/mTOR通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［13］。有研究表明，在腎癌中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑上調(diào)S期激酶相關(guān)蛋白2蛋白表達(dá)，從而激活mTORC1，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖［14］。

缺血再灌注損傷與氧化應(yīng)激，線粒體功能紊亂等機(jī)制有關(guān)［15］，而自噬在腎臟缺血再灌注過程中起到重要作用，自噬不足能夠引起腎臟損傷［16］。有報(bào)道表明中介素能夠提高小鼠結(jié)腸炎中的自噬水平從而緩解結(jié)腸炎癥狀［17］。自噬代表了一種修復(fù)，維持生命的過程。mTOR是自噬重要的調(diào)控因子之一［18］，可感知細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀況和細(xì)胞應(yīng)激。PI3K和Akt是mTOR重要的上游調(diào)控因子，Ⅰ型PI3K可以激活A(yù)kt，活化的Akt進(jìn)一步磷酸化mTOR。PI3K抑制劑LY294002可降低Akt蛋白的磷酸化水平，下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平上升。近年來，該通路作用的研究受到重視［19］，應(yīng)用抑制劑對(duì)該通路進(jìn)行干預(yù)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)均能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。

本研究結(jié)果表明，急性腎衰竭病人血清中中介素表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組者，大鼠腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)過缺氧/復(fù)氧處理后，模擬急性腎衰竭腎臟缺血再灌注過程，細(xì)胞的存活率顯著下降。采用中介素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，自噬標(biāo)志蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高，細(xì)胞存活率顯著上升。隨著中介素濃度的升高，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白磷酸化水平下降，表明中介素可以激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。在加入PI3K抑制劑LY294002（10 μmol/L）同樣發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白表達(dá)量增多，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量顯著減少。

總之，中介素在一定濃度范圍內(nèi)，可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，該信號(hào)通路的對(duì)自噬發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用，調(diào)控自噬的信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR的激活在急性腎衰竭過程中起保護(hù)作用。