楊博元，馬勇，郭楊，朱亞亮，黃浩，朱愛洪，方瑩

作者單位：1南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)骨傷科，江蘇 南京210023；2常州市金壇區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州213200

骨折是骨科臨床最常見的疾病之一，很多促進(jìn)骨折愈合的制劑也應(yīng)運(yùn)而生，如骨形態(tài)蛋白［1］、成骨生長(zhǎng)肽［2］等，但在縮短骨折愈合時(shí)間方面，一直未能取得突破性進(jìn)展。大量臨床和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)合并腦外傷的骨折愈合速度明顯加快［3-4］，這就為加速骨折愈合提供了一種新思路，腦外傷后是否有大量促骨折愈合因子通過腦屏障進(jìn)入血液［5］，或者顱腦損傷后釋放激素有助于產(chǎn)生大量局部骨骼因素［6］，因而加速了骨折愈合。

類比于抗蛇毒血清，骨折合并腦外傷后是否會(huì)產(chǎn)生大量“促骨折愈合血清”？是否有可能生產(chǎn)類似于抗蛇毒血清的促骨折愈合血清？本研究起止時(shí)間為2017年3月至2018年3月，采用骨折結(jié)合創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的血清，注入股骨骨折大鼠肌肉，模擬大鼠顱腦損傷后身體的微觀環(huán)境，運(yùn)用放射學(xué)及組織形態(tài)學(xué)方法，觀察骨折愈合過程，為“促骨折愈合血清”應(yīng)用臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠是由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供的，重量（314±27）g，分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度14℃～16℃，實(shí)驗(yàn)過程中自由攝食，自由飲用純凈水。96只大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化的分為三組，每組32只，實(shí)驗(yàn)組采用肌內(nèi)注射治療血清，對(duì)照組采用肌內(nèi)注射陰性對(duì)照血清，空白組采用肌內(nèi)注射生理鹽水。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)相關(guān)要求。

1.2 主要儀器及試劑 X射線成像系統(tǒng)DR（General Electric Company美國(guó)），雙能X線全身骨密度測(cè)量?jī)x（MEDILINK法國(guó)），HE染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics美國(guó)）

1.3 大鼠股骨骨折及骨折合并腦外傷模型的制作

1.3.1 制作大鼠股骨干骨折模型 大鼠股骨骨折模型改良的Einhorn［7］：大鼠腹腔注射麻醉采用2.5%戊巴比妥鈉（60 mg/kg），仰臥姿勢(shì)，備皮、消毒、鋪巾，膝關(guān)節(jié)伸直，在髕骨內(nèi)側(cè)縱切2 cm，依次切開皮膚、脂肪組織，暴露關(guān)節(jié)囊并切開，往外側(cè)推擠髕骨，使之脫位，然后膝關(guān)節(jié)屈曲90°，直視下采用直徑1 mm克氏針，經(jīng)股骨髁間凹處進(jìn)針至股骨大粗隆頂點(diǎn)穿出，大腿肌肉沿著骨膜向上剝離，暴露在股骨的中部。用超薄砂輪切割約1/3的股骨后，股骨沿薄弱部位徒手折斷。用生理鹽水和過氧化氫反復(fù)清洗切口。最后，膝關(guān)節(jié)伸直，髕骨脫位復(fù)位，切口逐層縫合。

1.3.2 骨折合并腦外傷模型的制作 參照Marmarou法［8］及自行改良的股骨中段骨折模型，制備骨折合并腦外傷模鼠20只。麻醉妥后，取俯臥位，頭部固定，切口取頭正中，左側(cè)頂骨暴露在冠狀縫后面1.5 mm和矢狀縫旁邊2.5 mm處。直徑為5 mm的空心鉆頭用于鉆直徑約為5 mm的圓形骨窗。注意，雙側(cè)皮質(zhì)骨沒有完全穿透。一小部分骨質(zhì)仍然相連。輕輕翹起用鑷子，取下骨瓣，露出大腦皮層，需輕柔動(dòng)作操作，對(duì)硬腦膜及腦組織不要造成損傷。把直徑4 mm，厚度約2 mm的圓形墊片放置在骨窗處，高30 cm處。用20 g重物沿外周導(dǎo)管垂直下落，直接沖擊墊圈，并進(jìn)行打擊（沖擊能量為600 g/cm2）導(dǎo)致左側(cè)大腦皮層的挫傷和撕裂。出現(xiàn)局部出血和水腫。傷口用雙氧水和生理鹽水反復(fù)沖洗，切口要逐層縫合。麻醉清醒后，放回籠中。術(shù)后第2天清晨，按照改良的股骨骨折模型行右股骨骨折髓內(nèi)克氏針固定。

1.3.3 納入及剔除標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后2～3 h，大鼠清醒建立腦損傷模型。神經(jīng)功能缺損評(píng)分［9］根據(jù)ZeaLonga［9］：沒有任何神經(jīng)缺損征象為0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降為4分。小于1分或死亡的動(dòng)物剔除；大于等于1分視為顱腦損傷造模成功。

股骨干骨折模型于術(shù)后立即進(jìn)行X線透視，確定克氏針位于髓內(nèi)，骨折為橫斷或短斜型骨折。剔除長(zhǎng)傾斜、粉碎性骨折和死亡動(dòng)物?？梢噪S機(jī)補(bǔ)充去除標(biāo)本，最終必須保證分析中包含的動(dòng)物數(shù)量。

1.4 采集標(biāo)本和指標(biāo)觀察 手術(shù)后第2、第5、第8、第12、第15、第19、第22和第26天，分別取骨折合并腦損傷大鼠4、4、3、3、2、2、1和1只，取腹部主動(dòng)脈的血，靜置于室溫下2～3 h，離心6 min 4 ℃（1 500 r/min），制備血清并冷藏，供不同時(shí)期使用。20只健康大鼠腹主動(dòng)脈采血，靜置、離心制備陰性對(duì)照血清。實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后第2、5、8、12、15、19、22、26天相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肌內(nèi)注射治療血清。相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組肌內(nèi)注射陰性對(duì)照血清，空白組肌內(nèi)注射生理鹽水。

每組術(shù)后第1周、2周、3周、4周各處死8只大鼠，采集三組骨折的股骨標(biāo)本，進(jìn)行DR攝片，測(cè)量骨痂體積；雙能X線全身骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)定骨折端骨密度；HE染色觀察各組骨折端骨組織形態(tài)學(xué)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0來分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，使用的是s。使用完全隨機(jī)的設(shè)計(jì)差異分析進(jìn)行了多組比較，兩組比較使用SNK測(cè)試。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射學(xué)觀察

2.1.1 骨折端X線對(duì)比 術(shù)后1周各組均未見明顯骨痂形成，各組骨折線均清晰。術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)組骨折線稍微模糊，對(duì)照組、空白組骨折線尚清晰。術(shù)后3周，對(duì)照組、空白組骨折線略模糊，實(shí)驗(yàn)組骨折線進(jìn)一步模糊。術(shù)后4周，對(duì)照組、空白組骨折線模糊，實(shí)驗(yàn)組骨折線基本消失。見圖1～3。

2.1.2 骨折端骨痂體積比較 術(shù)后2周，三組間骨痂體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組骨痂體積明顯大于對(duì)照組、空白組。術(shù)后3周，三組間骨痂體積對(duì)比大致相仿，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后4周，對(duì)照組、空白組骨痂體積明顯大于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。見表1。

表1 單純股骨干骨折大鼠不同治療方法術(shù)后第2、3、4周骨痂體積的比較/（mm3，s）

表1 單純股骨干骨折大鼠不同治療方法術(shù)后第2、3、4周骨痂體積的比較/（mm3，s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與空白組比較，bP＜0.05

?

2.1.3 骨折端骨密度比較 術(shù)后1周，三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第2、3、4周，同期三組間骨密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在同一時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組中的骨骼密度比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 單純股骨干骨折大鼠不同治療方法術(shù)后第1、2、3、4周骨密度BMD值的比較（mg/cm3， s）

表2 單純股骨干骨折大鼠不同治療方法術(shù)后第1、2、3、4周骨密度BMD值的比較（mg/cm3， s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與空白組比較，bP＜0.05

?

2.2 骨折端組織形態(tài) 術(shù)后第2周，實(shí)驗(yàn)組形成軟骨骨痂和鈣化組織，骨小梁排列不規(guī)則。同時(shí)，對(duì)照組和空白組愈傷組織生長(zhǎng)稀疏，形成典型的小梁結(jié)構(gòu)。軟骨骨痂和肥大軟骨細(xì)胞在骨折端大量呈現(xiàn)。手術(shù)后3周，實(shí)驗(yàn)組中長(zhǎng)了很多堅(jiān)硬的骨痂，骨小梁增加，排列方法形成了明顯的平板骨結(jié)構(gòu)。對(duì)照組，空白組大部分是未成熟的編織骨骼，骨小梁增加，序列逐漸變得越來越規(guī)律。

術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組的外骨痂基本上修復(fù)為板骨，可以看到一些軟骨存在于外骨痂中。對(duì)照組，空白組骨折端編織骨與板層骨融合開始。見圖4～6。

3 討論

1960年Gibson［10］第一次確認(rèn)了一名骨折病人，其臨床合并顱腦損傷，骨折端有大量骨形成；Kim等［11］其他實(shí)驗(yàn)表明，大鼠股骨骨折的平均愈合時(shí)間為4周，顱腦損傷合并后骨折的平均愈合時(shí)間縮短為2周。這一現(xiàn)象引起了許多學(xué)者的注意。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為骨折愈合的加速是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種因素，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白［12］、神經(jīng)生長(zhǎng)因子［13］、胰島素樣生長(zhǎng)因子［14］、血小板衍生生長(zhǎng)因子［15］、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子［16］等，其中任何一種因子都不能單獨(dú)解釋這一現(xiàn)象，因此對(duì)包含眾多因子血清進(jìn)行研究就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)將血清作為一個(gè)不可分割的整體，觀察其對(duì)骨折愈合的影響，探討其臨床應(yīng)用的可行性。

本研究進(jìn)一步證明了在臨床上血清加快治療腦損傷骨折的愈合。X線顯示，實(shí)驗(yàn)組的骨小梁過骨折線的時(shí)間較早，骨折線消失的時(shí)間早于對(duì)照組和空組。實(shí)驗(yàn)組骨痂體積早期的數(shù)量迅速增加，隨后迅速減少，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組在第2～3周的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)已經(jīng)處于骨痂塑形期。根據(jù)沃爾夫定律，骨細(xì)胞吸收大量無效骨痂并縮小其大小，這并不直接反映骨折愈合速度，但間接表明治療性血清可以促進(jìn)早期骨痂形成、后期骨痂塑形和加快骨折愈合。手術(shù)后第1周三組骨痂體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從第2周開始，對(duì)照組和空白組的骨密度明顯低于同期實(shí)驗(yàn)組的骨密度，手術(shù)后第3、4周，實(shí)驗(yàn)組的外骨痂基本上變成板層骨痂，進(jìn)入骨痂塑形期，骨痂數(shù)量開始減少。然而，對(duì)照組和空白組僅發(fā)現(xiàn)少量板層骨，大部分仍然是硬骨痂，這表明合并腦損傷可以促進(jìn)骨痂盡早變成板層骨痂。

在本研究中，血清分幾個(gè)階段處理，不同骨折愈合因子在骨折愈合的不同階段可能發(fā)揮的作用不盡相同；在不同時(shí)間收集血清，盡可能模擬骨折合并腦外傷大鼠身體的微環(huán)境，就可以在不同時(shí)間而不是在同一時(shí)間使用治療血清。我們對(duì)傳統(tǒng)大鼠股骨骨折模型的操作方法作出了一些改良，采取單一的膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，取消了骨折端為中心的傳統(tǒng)切口，減少了手術(shù)操作對(duì)肌肉及骨膜的損傷，也就避免了肌肉及骨膜損傷對(duì)骨折愈合的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明了這樣一種假設(shè)，也就是說，大量的骨折愈合血清會(huì)產(chǎn)生于骨折與腦損傷同時(shí)發(fā)生的大鼠體內(nèi)。從臨床應(yīng)用的角度來看，這為“促骨折愈合血清”治療骨折延愈合、骨質(zhì)疏松癥等骨病的臨床應(yīng)用提供了理論支持，社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益潛力較大。

盡管有證據(jù)表明骨折和腦損傷的血液結(jié)合可以促進(jìn)骨骼的修復(fù)和重建，但尚不清楚這種結(jié)合是如何工作的。研究的下一步可以是利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)［17］檢測(cè)血清中的特定蛋白質(zhì)，研究這些蛋白質(zhì)的作用及機(jī)制。

（本文圖1～6見插圖1-2）