劉云，楊玉忠

作者單位：新鄉(xiāng)市食品藥品檢驗所，河南 新鄉(xiāng)453000

消化性潰瘍是臨床上常見的病癥，它的發(fā)作常伴有諸多的不適癥狀如噯氣、惡心、胃灼熱等，嚴重影響患者的生活［1］。幽門螺桿菌感染常常是消化性潰瘍的一個重要的誘導(dǎo)因素［2-3］。目前，不法分子將化學(xué)藥物非法加入中成藥及保健食品中的現(xiàn)象時有發(fā)生［4-5］，這些化學(xué)藥物的不當應(yīng)用會造成嚴重的不良后果，給人們的生活造成嚴重的威脅［6］。而胃藥非法添加的檢測方法尚未健全［7-10］，本研究針對抗消化性潰瘍類中成藥及保健食品中非法添加的17種化學(xué)藥物（包括胃泌素受體阻斷藥丙谷胺，增強胃黏膜屏障功能的藥物米索前列醇，H2受體阻斷藥西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁，質(zhì)子泵抑制藥奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑、雷貝拉唑，M膽堿受體阻斷藥阿托品、東莨菪堿、山莨菪堿、溴丙胺太林，抗幽門螺桿菌藥物阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑）研究建立了采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）進行定性定量同步檢測的方法。以完善對此類藥物非法添加的檢測，有效應(yīng)對此類化學(xué)藥物非法添加的監(jiān)管要求。

1 儀器與試劑

LC-20A型超高效液相色譜儀（日本島津公司）串聯(lián)API3200型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；Shim-pack XR-ODSⅡ型色譜柱（日本島津公司，2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；W-濾膜0.22 μm（天津市蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司），VGT-2120QTD型超聲清洗儀（廣東固特超聲股份有限公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）。

對照品丙谷胺、米索前列醇、西咪替丁、鹽酸雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁、奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑鈉、雷貝拉唑鈉、硫酸阿托品、消旋山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、溴丙胺太林、甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林批號分別為100176-201104、410004-201502、100158-201406、100163-201607、100305-201304、100853-201502、100367-201706、100709-201304、100575-201505、100658-201705、100040-201312、100249-201303、100049-201310、100471-201402、100191-201507、130558-201303、130409-201512，含量分別為99.7%、99.8%、98.9%、99.9%、99.5%、99.6%、100.0%、99.8%、95.8%、99.7%、97.2%、99.8%、99.6%、98.6%、100.0%、97.2%、86.9%，以上17種對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。實測樣品來自于市場抽檢。乙腈、甲酸和乙酸銨均為色譜純，購自美國Fisher試劑公司。水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 島津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）色譜柱，柱溫20℃，流速0.25 mL/min，進樣量5 μL。ESI正離子掃描模式（ESI+）流動相系統(tǒng)：以乙腈為流動相A，0.1%甲酸水溶液（含7 mmol/L的乙酸銨）為流動相B，梯度洗脫（0～8 min，90%～70%B；8～10 min，70%～60%B；10～13 min，60%～90%B；13～15 min，90%B），采集時間15 min；ESI負離子掃描模式（ESI-）流動相：乙腈-15 mmol/L乙酸銨（50：50），采集時間5 min。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化源（ESI），正、負離子掃描模式；離子噴射電壓（IS）：5 000 V；離子源溫度（TEM）：500℃；源內(nèi)氣體GS1（Nebulizer gas，N2）：25 psi；輔助加熱氣GS2（Heated gas，N2）：45 psi；氣簾氣體（Cur Gas）：35 psi。監(jiān)測方式MRM。17種物質(zhì)的準分子離子峰、主要離子碎片峰及其質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集參數(shù)見表1。

表1 17種抗?jié)儾∷幍馁|(zhì)譜采集參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 ESI+模式對照品溶液的制備：精密稱取阿莫西林、西咪替丁、法莫替丁、甲硝唑、山莨菪堿、東莨菪堿、阿托品、雷貝拉唑、奧美拉唑、泮托拉唑、克拉霉素、蘭索拉唑、溴丙胺太林、丙谷胺對照品各約10 mg，分別置于20 mL棕色量瓶用50%乙腈水溶液配制成對照品儲備液，冷藏。根據(jù)離子化效率的不同，精密量取溴丙胺太林儲備液0.04 mL，硫酸阿托品、奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑鈉、克拉霉素儲備液各0.1 mL，氫溴酸東莨菪堿、消旋山莨菪堿、雷貝拉唑鈉儲備液各0.2 mL，西咪替丁、丙谷胺儲備液各0.3 mL，甲硝唑儲備液0.8 mL，法莫替丁、阿莫西林儲備液各3 mL置于同一25 mL棕色量瓶中，用50%乙腈配置成ESI+混合對照品中間儲備液。精密量取混合對照品中間儲備液2 mL置50 mL量瓶中，用10%乙腈水溶液定容，搖勻，濾過（文中所述“濾過”均為用0.22 μm微孔濾膜濾過）。

ESI-模式對照品溶液的制備：精密稱取雷尼替丁、尼扎替丁、米索前列醇對照品約10 mg，分別置于20 mL棕色量瓶用50%乙腈水溶液配置成對照品儲備液，冷藏。精密量取米索前列醇對照品儲備液5 mL，鹽酸雷尼替丁、尼扎替丁儲備液各1 mL置于同一25 mL棕色量瓶中，用50%乙腈配置成ESI-混合對照品中間儲備液。精密量取混合對照品中間儲備液2 mL置50 mL量瓶中，用10%乙腈水溶液定容，搖勻，濾過。

2.3.2 供試品溶液的制備 取待測樣品1次服用劑量分別置于研缽中，研磨均勻成粉末狀，置于50 mL量瓶中，加50%乙腈40 mL，冰浴中超聲處理10 min，用50%乙腈定容，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL至100 mL量瓶中，用10%乙腈定容，搖勻；再精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用10%乙腈定容，搖勻，濾過。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 取待測樣品的陰性樣品，按“2.3.2”項下方法制成空白基質(zhì)粉末，分別取1次服用劑量，置于50 mL量瓶中，同法制備陰性對照溶液。

2.4 定性分析 取對照品溶液進樣測定，將所得圖譜中各成分定性離子對之間的相對離子豐度和色譜峰保留時間進行統(tǒng)計分析［11-13］。各化學(xué)藥定量離子對的MRM色譜圖見圖1，由圖1可知，保留時間相近的上述各化學(xué)藥在MRM采集模式下均能達到完全分離。

取供試品溶液進樣測定，記錄所得質(zhì)譜MRM色譜圖（圖2），根據(jù)所得液相質(zhì)譜圖，以定性離子對之間的相對豐度和保留時間定性［12］，結(jié)果表明，供試品中含有西咪替丁和丙谷胺。

取“2.3.3”項下的陰性對照溶液進樣測定，得到陰性對照溶液的TIC和MRM色譜圖，均未見有干擾17種目標化學(xué)藥成分的色譜峰。

2.5 定量分析 對判定供試品溶液中含有的化學(xué)藥物，根據(jù)相應(yīng)對照品定量離子對和陽性化學(xué)藥物定量離子對的峰面積之比等于對照品濃度與陽性化學(xué)藥物的濃度之比的關(guān)系進行含量計算［14］。

2.5.1 線性考察與檢測限（LOD）和定量限（LOQ）試驗 取ESI+和ESI-兩種測定模式下的混合對照品中間儲備液各0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用10%乙腈稀釋至50 mL，進樣測定。以濃度為橫坐標，以定量離子對色譜峰面積為縱坐標做標準曲線，得17種化學(xué)藥的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，17種化學(xué)藥均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于或等于0.995 1。

取混合對照品溶液適量，適當稀釋，添加到陰性樣品中，制成質(zhì)量濃度約為0.5 mg/g的供試品，進樣，以信噪比為3時各化學(xué)藥的LOD和信噪比為10時的LOQ的計算結(jié)果見表2，表明方法的靈敏度完全能滿足非法添加化學(xué)藥物的檢測要求。

2.5.2 精密度試驗 取混合對照品溶液1份，連續(xù)進樣6次，得17種化學(xué)藥物的定量離子對質(zhì)譜峰面積的RSD，其值均在0.9%～2.8%范圍內(nèi)，見表2。說明該方法的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取陰性樣品加入適量混合對照品儲備液，混勻，取此樣品6份，按供試品的制備方法制備并測定，計算各成分含量的RSD值均在0.8%～3.0%，見表2。表明重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取2.5.3項下的同一供試品溶液，分別于制備0、2、4、6、8 h后依法測定，根據(jù)上述17種化學(xué)藥的定量離子對峰面積計算RSD均在1.0%～4.6%，見表2，說明供試品溶液在測定條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收試驗 取一次服用量的陰性樣品6份，分別置50 mL量瓶中，各加相應(yīng)的混合對照品儲備液適量，混勻，按供試品的制備方法制備，測定。17種化學(xué)藥的平均回收率見表2。從表中可以看出，各化學(xué)藥的標準加樣回收率均在81.5%～102.7%。

2.5.6 樣品測定 本研究收集相關(guān)中成藥及保健食品共10個樣品，取各樣品按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，經(jīng)測定，在10個樣品中檢出2個樣品添加了抗消化性潰瘍類化學(xué)藥物，分別為西咪替丁和丙谷胺，MRM色譜圖見圖2。根據(jù)定量離子對的色譜峰面積，采用外標法計算樣品中添加的化學(xué)藥的量，樣品中檢出西咪替丁21.4 mg/g，丙谷胺18.1 mg/g。

圖1 17種抗?jié)儾∷帉φ掌范侩x子對應(yīng)的MRM色譜圖：A為ESI+掃描模式，B為ESI-掃描模式

圖2 樣品溶液中西咪替丁、丙谷胺的定性、定量離子對MRM色譜圖

3 討論

本研究分別考察了以水、不同濃度的甲酸、乙酸、乙酸銨為水相，以甲醇、乙腈為有機相，將水相和有機相組成的各種組合為流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESI+模式下，乙腈-0.1%甲酸（含7 mmol/L乙酸銨）流動相體系梯度洗脫，14種化合物的峰形和分離情況最好；ESI-模式下，以乙腈-15 mmol/L乙酸銨為流動相等度洗脫，3種化合物峰形和分離情況最好。在質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)米索前列醇在負離子模式下靈敏度高，噪聲小，而其它16種化合物正離子模式靈敏度高，但是雷尼替丁和尼扎替丁在質(zhì)譜ESI+模式和液相相應(yīng)的流動相下，峰形很差，基線高，峰底寬度超過3 min，不利于進行定量定性，而這兩種化合物在ESI-模式下，雖然靈敏度相對于ESI+稍低，但在相應(yīng)的流動相下，基線和峰形好，適用于定量和定性，故選擇ESI-模式檢測米索前列醇、雷尼替丁和尼扎替丁，用ESI+模式檢測其它14種化合物。

因質(zhì)子泵抑制藥不耐酸，因此口服質(zhì)子泵抑制劑藥大多為腸溶包衣制劑，以避免藥物因胃酸作用而造成生物利用度降低［15］；米索前列醇的純品化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，需存放于-20℃環(huán)境中，且在酸性和堿性條件下都能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而它卻可以在常溫下穩(wěn)定的保存于羥丙基甲基纖維素的分散體系中［16］，故米索前列醇被分散于此介質(zhì)中制成藥劑使用?；谏鲜鲈颍瑢①|(zhì)子泵抑制藥和米索前列醇的原料藥作為非法添加物可能性很小，但是在日常檢驗工作中發(fā)現(xiàn)，不法分子將化學(xué)制劑成品甚至過期藥添加入中成藥和保健品中的現(xiàn)象時有發(fā)生，因而不排除質(zhì)子泵抑制劑和米索前列醇以穩(wěn)定形式被非法添加的可能性。

表2 17種抗?jié)儾∷幍木€性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及檢出限、定量限