張磊，蔡曉瑤，張莉，向曉輝，徐學(xué)君

作者單位：1武警特色醫(yī)學(xué)中心，a藥劑科，b肝膽胰脾中心，天津300162；2武警第一機(jī)動總隊，河北 石家莊050800；3武警后勤學(xué)院，天津300162；4武警安徽總隊醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230000

蟾皮提取物是中華大蟾蜍的干燥表皮經(jīng)過煎煮得到的產(chǎn)物，其內(nèi)含有華蟾酥毒基（Cinobufagin，CBG）、酯蟾毒配基（Resibufogenin，RBG）等多種脂溶性成分，具有抗癌、強(qiáng)心利尿、麻醉、提高機(jī)體免疫力等功效［1-2］。其臨床應(yīng)用注射液劑型存在局部刺激性和治療窗窄等副作用［3-4］。因此前期將蟾皮提取物［5］制成固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）［6］，所得 SLN 表現(xiàn)出良好的緩釋作用［7］。但固體脂質(zhì)納米粒的混懸液在長期存儲過程中易發(fā)生聚集、沉淀、水解以及磷脂氧化等現(xiàn)象。文獻(xiàn)表明真空冷凍干燥、噴霧干燥、超臨界流體技術(shù)［8-10］等都可以提高SLN的穩(wěn)定性。因此，本試驗采用真空冷凍干燥法制備凍干蟾皮提取物SLN，通過正交試驗等方法優(yōu)化凍干保護(hù)劑及工藝，并以蟾皮提取物中有效成分CBG、RBG的包封率為指標(biāo)，評價凍干工藝對SLN穩(wěn)定性的影響。本研究起止時間為2011年4月至2017年12月。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器 LC-20AT液相色譜儀（LC-20AT二元泵，SPD-20A型紫外檢測器，CTO-10AS型柱溫箱，日本shimadzu公司）；AT250分析天平（1/100000，瑞士METTLER TOLEDO公司）；JY92-2D型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；EYELA冷凍干燥機(jī)（FDU-1200，東京理化公司）。

1.1.2 試驗試劑 華蟾酥毒基對照品（CBG，中國藥品生物制品檢定所，110803-200504）；酯蟾毒配基對照品（RBG，中國藥品生物制品檢定所，110718-200507）；蟾皮（批號090310）購自安徽亳州千草藥業(yè)飲片廠，蟾皮提取物浸膏（自制，含CBG和RBG分別為：1.824 mg/g和1.347 mg/g）；注射用卵磷脂（批號201403012，上海太偉藥業(yè)有限公司）；山崳酸甘油酯（上海卡樂康公司）；甲醇（色譜純，批號20150603，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，批號20140311，天津市康科德科技有限公司）；甘露醇（批號20150812北京奧博星生物科技責(zé)任技術(shù)有限公司），蔗糖（批號20150923，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠），乳糖（批號20150412，天津市化學(xué)試劑一廠），葡萄糖（批號20151001，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）。

1.2 蟾皮提取物SLN包封率測定方法的建立

1.2.1 色譜條件的確立 色譜柱為ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-三氟乙酸（60∶40∶0.1），柱溫為50 ℃，流速為0.5 mL/min，檢測波長296 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取CBG、RBG標(biāo)準(zhǔn)品86 mg和78 mg，甲醇定容至100 mL，制得濃度分別為860.00和780.00 μg/mL，而后精密吸取1 mL至10 mL量瓶，甲醇定容制得濃度分別為86.00和78.00 μg/mL的CBG、RBG對照品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取50、100、150、200、250、300 μL對照品溶液，置于10 mL量瓶，用甲醇定容，濃度為0.43、0.86、1.29、1.72、2.15、2.58 μg/mL，按照“1.2.2”項下色譜條件測定CBG與RBG峰面積，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并做線性回歸。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液200 μL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，得CBG和RBG的質(zhì)量濃度分別為1.72 μg/mL和1.56 μg/mL的溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，計算CBG和RBG峰面積的RSD值。

1.2.5 精密度試驗 吸取“1.2.5”項下CBG、RBG濃度為1.72 μg/mL和1.56 μg/mL的溶液一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計算CBG和RBG峰面積的RSD值；另將上述混合對照品溶液，室溫避光保存，隔天進(jìn)樣，連續(xù)6 d，計算CBG和RBG峰面積的RSD值。

1.2.6 蟾皮提取物SLN的制備 參照前期試驗文獻(xiàn)［11］方法：精密稱取300 mg卵磷脂、100 mg山崳酸甘油酯、300 mg浸膏溶于10 mL乙醇中，加熱至80℃溶解形成油相；同時將42 mL 5%P188以及8 mL 0.5%Tween 80水溶液加熱至同溫度，將油相緩慢滴入其中，100 r/min高速攪拌乳化150 min。隨即用400 W探頭超聲分散4 min（間歇10 s、持續(xù)20 s），冰浴攪拌15 min，用超純水定容至60 mL，得到淡黃色SLN混懸液。

1.2.7 蟾皮提取物SLN包封率的測定 取“1.2.1”項下制備的蟾皮提取物SLN混懸液5 mL，放入透析袋中，而后置于100 mL的PH 7.8的PBS溶液中，室溫下1 000 r/min攪拌透析液，于4 h吸取1 mL透析液進(jìn)行HPLC分析，測得透析液中CBG濃度為c1，RBG濃度為c2，CBG包封率（EE%）＝（投藥量CBG-c1×100）/投藥量CBG×100%，RBG包封率（EE%）＝（投藥量RBG-c2×100）/投藥量RBG×100%。

1.3 凍干工藝的考察

1.3.1 預(yù)凍時間、溫度的考察 取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，加入600 mg甘露醇，混勻后于-40℃條件下，以外觀、復(fù)溶時間、顆粒形態(tài)為指標(biāo)，考察預(yù)凍時間分別為4、6、8、12、24 h對凍干SLN的影響；另取已制備好蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，加入600 mg甘露醇，混勻后考察在-20℃、-40℃、-60℃［12］下預(yù)凍8 h對凍干SLN的影響。

1.3.2 升華干燥時間的考察 本試驗設(shè)定升華干燥溫度-45℃，取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，加入600 mg甘露醇，-40℃下預(yù)凍8 h后，考察升華干燥12、16、20、24 h對凍干SLN的影響。

1.3.3 解析干燥時間的考察 本試驗設(shè)定解析干燥溫度20℃，取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，600 mg甘露醇，-40℃下預(yù)凍8 h、-45℃下升華干燥20 h后，考察解析干燥3、4、5、6 h對凍干SLN的影響。

1.4 凍干保護(hù)劑的考察

1.4.1 凍干保護(hù)劑種類的考察 取已制備好的蟾皮提取物SLN混懸液60 mL，分別加入600 mg（與磷脂質(zhì)量比為2∶1）的甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖，考察其對SLN的保護(hù)作用。

1.4.2 正交試驗設(shè)計優(yōu)選保護(hù)劑處方 為了達(dá)到最佳保護(hù)效果，將表現(xiàn)較好的甘露醇、乳糖、蔗糖三種混合用作保護(hù)劑。做正交設(shè)計，采用L9（34）正交表，以乳糖、甘露醇、蔗糖與磷脂（300 mg）質(zhì)量比作為考察因素，每個因素設(shè)1.5∶1，2∶1，4∶1三水平，實驗安排見表1。將外觀、復(fù)溶性、顆粒形態(tài)作為考察指標(biāo)，每個指標(biāo)采用百分制，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：外觀＝體積（≤40）+質(zhì)地（≤30）+色澤（≤30），體積飽滿30～40分、略皺縮20～30分、皺縮10～20分、塌陷0～10分，質(zhì)地疏松20～30分、略致密10～20分、致密0～10分，色澤均勻20～30分、分層不明顯10～20分、分層明顯0～10分，外觀得分為三項分?jǐn)?shù)相加；復(fù)溶性得分＝100-顆粒溶解時間（s），大于100 s記為零分；顆粒形態(tài)得分：顆粒不聚集70～100分、略聚集40～70分、聚集10～40分、聚集嚴(yán)重有結(jié)晶0～10分。

表1 乳糖、甘露醇、蔗糖質(zhì)量比的因素水平安排

1.5 凍干蟾皮提取物SLN質(zhì)量評價 室溫下，取優(yōu)化后的凍干蟾皮提取物SLN，60 mL生理鹽水復(fù)溶后，采用“1.2.7”項方法測定CBG與RBG的包封率；取適量制備的蟾皮提取物凍干SLN于激光散射儀中，測定SLN的大小及粒徑分布，用透射電鏡觀察形態(tài)。

1.6 凍干工藝對蟾皮提取物SLN穩(wěn)定性的影響分別取蟾皮提取物SLN混懸液和凍干蟾皮提取物SLN，在4 ℃、避光條件下放置，于第0、1、5、10、20、30天后取樣，測定并比較兩者包封率。

2 結(jié)果

2.1 包封率測定方法的建立 在所建立的色譜條件下，SLN中的輔料對藥物的檢測無干擾，CBG、RBG與其他成分的峰分離度均大1.5，分離較好，檢測限（LOD）為0.032 μg/mL，定量限（LOQ）為0.098 μg/mL，如圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：CBG：Y＝32 019X-3 169.3（r＝0.9992），RBG：Y＝39 789X-2 753.9（r＝0.999 9），表明CBG和RBG在0.43～2.58μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示CBG和RBG峰面積的RSD值分別為0.52%和0.65%，表明待測樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定；日內(nèi)、日間精密度試驗結(jié)果顯示CBG和RBG峰面積的RSD分別為0.82%和0.90%、1.11%和0.81%。表明日內(nèi)、日間精密度良好。以上結(jié)果表明該色譜方法可準(zhǔn)確檢測CBG與RBG，利用此方法測得CBG的包封率為（91.01±0.75）%，RBG的包封率為（89.91±0.54）%。

2.2 凍干工藝的優(yōu)化 預(yù)凍溫度考察結(jié)果：預(yù)凍溫度為-20℃時，樣品未完全凍實，有噴瓶的現(xiàn)象發(fā)生，-40℃與-60℃均可得到外觀飽滿的凍干SLN，故選擇-40℃作為預(yù)凍溫度；預(yù)凍時間考察結(jié)果：4 h、6 h的樣品存在噴瓶、破損、外觀不平整的現(xiàn)象，8 h、12 h的樣品飽滿，疏松，色澤均勻，24 h樣品出現(xiàn)皺縮，故選擇8 h作為預(yù)凍時間；升華干燥時間考察結(jié)果：當(dāng)時間小于20 h，樣品未完全干燥，室溫下放置后內(nèi)部融化，使樣品產(chǎn)生空腔，當(dāng)干燥時間大于20 h，所得凍干SLN飽滿，疏松，色澤均勻、復(fù)溶性無明顯差異，因此選擇20 h作為升華干燥時間；解析干燥時間考察結(jié)果：解析干燥3 h的凍干SLN有水分殘留，室溫放置后內(nèi)部融化，解析干燥4、5、6 h所得凍干SLN外觀良好，因此選擇4 h作為解析干燥時間。

2.3 凍干保護(hù)劑的選擇 凍干保護(hù)劑種類考察的結(jié)果：使用單一的凍干保護(hù)劑會分別出現(xiàn)凍干產(chǎn)品表面塌陷、色澤不均、顆粒聚集、復(fù)溶時間過長等現(xiàn)象，因此本實驗將甘露醇、蔗糖、乳糖三者混合用做保護(hù)劑，以達(dá)到理想的凍干效果；正交試驗優(yōu)化凍干保護(hù)劑組成結(jié)果見表2，比較各因素的極差可知RB最大，故因素B對實驗結(jié)果影響最大，其次是C和A。由各個因素不同水平的綜合平均值k1、k2、k3可知，A1、B2、C1水平最優(yōu)，因此最優(yōu)處方為乳糖：甘露醇∶蔗糖∶磷脂（300 mg）＝1.5∶2∶1.5∶1。

表2 甘露醇、蔗糖、乳糖三者混合用做保護(hù)劑的正交試驗結(jié)果（n＝3）

圖1 華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的HPLC圖：A為混合對照品；B為蟾皮提取物固體脂質(zhì)納米粒；C為空白固體脂質(zhì)納米粒

2.4 蟾皮提取物凍干SLN的質(zhì)量評價 經(jīng)過試驗考察，確定乳糖：甘露醇：蔗糖：磷脂（300 mg）＝1.5∶2∶1.5∶1作為保護(hù)劑，-40℃下預(yù)凍8 h，-45℃下升華干燥20 h、25℃下解析干燥4h，得到蟾皮提取物凍干SLN。蟾皮提取物凍干SLN復(fù)溶樣品的CBG包封率為（88.96±1.50）%、RBG包封率為（89.65±0.78）%；激光散射儀中，測得SLN的大小及粒徑分布結(jié)果：樣品的平均粒徑（152±6.1）nm，90%粒徑小于（209.1±28.9）nm，多分散性指數(shù)為0.153±0.023，用透射電鏡觀察形態(tài)，見圖2。

圖2 蟾皮提取物脂質(zhì)納米粒透射電鏡圖（×50 000）

2.5 凍干工藝對SLN穩(wěn)定性的影響 蟾皮提取物SLN放置第0、1、5、10、20、30 d后測得CBG的包封率分別為 91.1%、88.2%、84.8%、79.6%、73.5%、68.1%，RBG的包封率分別為90.2%、87.4%、82.5%、75.3%、70.1%、65.9%；凍干蟾皮提取物SLN放置第0、1、5、10、20、30 d后復(fù)溶測得CBG的包封率分別為89.5%、87.3%、88.1%、87.9%、89.9%、88.7%，RBG的包封率分別為 89.9%、88.4%、86.8%、87.4%、87.2%、88.6%。結(jié)果表明：長期貯存會導(dǎo)致SLN中有效成分CBG、RBG包封率降低，凍干工藝可顯著提高蟾皮提取物SLN的穩(wěn)定性。

3 討論

理想的凍干產(chǎn)品應(yīng)具有外形飽滿、色澤均勻、表面平整、復(fù)溶時間短等性質(zhì)，凍干保護(hù)劑、預(yù)凍溫度和時間、干燥時間都對凍干產(chǎn)品的性質(zhì)產(chǎn)生了重要的影響。在SLN混懸液中，氫鍵作用可使固體脂質(zhì)納米粒的脂質(zhì)雙分子層外部包裹著一層水化膜，可防止SLN發(fā)生聚集融合，提高穩(wěn)定性。但凍干過程會破壞SLN外部的水化層，使膜穩(wěn)定性降低，發(fā)生聚集、破裂［13］。加入凍干保護(hù)劑可在冷凍干燥過程代替水分子與SLN形成氫鍵，提高脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定性［14］。在篩選保護(hù)劑種類時發(fā)現(xiàn)應(yīng)用一種保護(hù)劑效果并不理想，因此采用混合保護(hù)劑。通過比較確定了甘露醇、乳糖、蔗糖三種保護(hù)劑，采用正交試驗，以外觀、復(fù)溶時間、顆粒形態(tài)為指標(biāo)，篩選出復(fù)合凍干保護(hù)劑，對SLN表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用，克服了單種保護(hù)劑出現(xiàn)的外觀塌陷，顆粒聚集等問題。

預(yù)凍過程需將樣品中的水全部凍實，實驗中發(fā)現(xiàn)預(yù)凍時間短、預(yù)凍溫度高均會使升華干燥時出現(xiàn)噴瓶的現(xiàn)象，而預(yù)凍時間過長會導(dǎo)致實驗儀器浪費(fèi)。因此通過考察最終確定-40℃下冷凍8 h的方式。干燥過程分為升華干燥和解析干燥。升華干燥的過程是通過減壓降溫的方式將樣品中凍結(jié)的自由水以固態(tài)形式升華除去［15］，解析干燥則需要適當(dāng)升高溫度來去除樣品中的結(jié)晶水。實驗發(fā)現(xiàn)若升華干燥時間短、水分去除不完全，會導(dǎo)致凍干產(chǎn)品出箱后內(nèi)部出現(xiàn)空洞、碎塊。因此本試驗通過單因素考察升華干燥、解析干燥對凍干產(chǎn)品的影響，確定了-45℃下升華干燥20 h、25℃下解析干燥4 h的干燥方式。

包封率是評價SLN穩(wěn)定性的重要指標(biāo)［16-17］，長期存放會導(dǎo)致磷脂氧化變性，脂質(zhì)雙分子層穩(wěn)定性下降，最終使藥物泄露。因此本試驗采用透析法測定貯存不同時間后SLN混懸液與凍干SLN的包封率。結(jié)果顯示未凍干SLN包封率明顯降低，SLN出現(xiàn)泄漏，而凍干后的SLN包封率未見明顯降低。該結(jié)果表明冷凍干燥是提高蟾皮提取物SLN的物理化學(xué)穩(wěn)定性的可行辦法，解決了蟾皮提取物SLN混懸液不穩(wěn)定的關(guān)鍵難題。