王大鵬，夏慶欣

作者單位：鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，河南 鄭州450000

肺癌居全球范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率和死亡率的首位，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80%～85%。我國近年來肺癌的發(fā)病率和死亡率明顯升高［1］。肺組織淋巴和血供非常豐富，癌細(xì)胞極其容易經(jīng)鄰近的淋巴管或血管轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，肺血管和椎靜脈間常有吻合支，因而更容易轉(zhuǎn)移至腦部［2］。據(jù)報(bào)道，NSCLC病人腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約20%～40%，其中同時(shí)性腦轉(zhuǎn)移占10%～30%，即病人在初次確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，異時(shí)性腦轉(zhuǎn)移占70%～90%，即在治療后和隨訪過程中發(fā)生腦轉(zhuǎn)移［3］。miRNA（miR）是真核生物體內(nèi)的一類非編碼小RNA分子，具有良好的穩(wěn)定性，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程，miR已逐漸被用于表征腫瘤，miR的調(diào)節(jié)失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但miR-375在腦轉(zhuǎn)移中的作用是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域［4］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)受試者血清miR-375表達(dá)水平，并探討其在NSCLC腦轉(zhuǎn)移的診斷和預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2015年2月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的185例初診NSCLC病人為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②經(jīng)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)確診為NSCLC；③初次確診；④預(yù)計(jì)生存時(shí)間超過3個(gè)月；⑤入院前未接受過抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官功能障礙；②合并其他惡性腫瘤史；③先前有或繼發(fā)性惡性腫瘤；④曾接受過免疫治療或放化療。其中發(fā)生腦轉(zhuǎn)移病人78例納入轉(zhuǎn)移組，年齡范圍為30～78歲，年齡（58.63±12.15）歲；男性53例，女性25例；病理類型：腺癌50例，鱗癌28例；臨床分期：Ⅳ期78例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：29例N0，14例N1～2，35例N3。未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移病人107例納入未轉(zhuǎn)移組，年齡范圍為30～80歲，年齡（59.24±12.33）歲；男性71例，女性36例；病理類型：腺癌69例，鱗癌38例；臨床分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ46期例，Ⅳ期34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：16例N0，35例N1～2，56例N3。另選擇80同期健康體檢者為對(duì)照組，年齡范圍為31～80歲，年齡（59.29±12.37）歲。三組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得病人及家屬知情同意，且符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集受試者空腹靜脈血5 mL，4℃下3 000 r/min離心15 min，吸取上清液至2 mL EP管中，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miR-375的檢測(cè) ⑴血清總RNA提?。何?00 μL血清，按照mir VanaTMPARIS試劑盒（Ambion，美國）說明書操作完成總RNA提取。⑵RT反應(yīng)合成cDNA：吸取100 ng RNA，按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher公司）操作依次加入5X Reaction Buffer（4 μL）、RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL，1 μL）、10 mM dNTP Mix（2 μL）、RevertAid M-MμlV RT（200 U/μL，1 μL）、miRNA（10 μL）、Primer（2 μL）、Total volume（20 μL），逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃ 5 min。⑶實(shí)時(shí)定量PCR：SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購于美國Genecopoeia公司，引物及探針購自美國abi公司，以U6 snRNA為內(nèi)參，反應(yīng)體系：0.1%DEPC水6.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，Power SYBR Green PCR Master 10 μL，基因組DNA模板2μl，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性（1個(gè)循環(huán)）95℃ 30 s；擴(kuò)增（40個(gè)循環(huán)），變性95℃ 5 s，退火60℃ 35 s；溶解曲線（1個(gè)循環(huán)），95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，延伸95℃ 15 s；按照2-△△Ct法計(jì)算miR-375表達(dá)水平。

1.3 隨訪及資料收集 隨訪截止時(shí)間為2018年8月，收集病人的臨床資料及隨訪資料，包括年齡、性別、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等，隨訪期間出現(xiàn)死亡即認(rèn)為預(yù)后不良。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以s表示，三組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步的組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以例（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，采用受試者工作特征曲線（ROC）評(píng)估m(xù)iR-375診斷NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值，采用逐步回歸篩選變量進(jìn)行多因素COX回歸分析，以優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%置信區(qū)間（95%CI）表示各因素對(duì)NSCLC病人預(yù)后的影響。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-375表達(dá)水平 轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組血清miR-375表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），轉(zhuǎn)移組血清miR-375表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。見表1。

2.2 血清miR-375表達(dá)水平與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系 NSCLC病人血清miR-375表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05），與病人年齡、病理類型無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表1 非小細(xì)胞肺癌185例和80例同期健康體檢者（對(duì)照組）血清miR-375表達(dá)水平比較

表2 非小細(xì)胞肺癌185例血清miR-375表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系/s

表2 非小細(xì)胞肺癌185例血清miR-375表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系/s

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2.3 miR-375診斷NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值 ROC曲線分析顯示，血清miR-375表達(dá)水平診斷NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的曲線下面積（AUC）為0.975，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為89.74%、94.39%、92.43%、92.11%、92.66%。見圖1。

圖1 miR-375診斷非小細(xì)胞肺癌185例發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的ROC曲線

2.4 影響NSCLC病人預(yù)后的多因素Cox回歸分析 多因素Cox回歸分析顯示，臨床分期、腦轉(zhuǎn)移、血清miR-375表達(dá)水平是影響NSCLC病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），其他因素不是影響NSCLC病人預(yù)后的重要因素（P＞0.05）。見表3。

表3 影響非小細(xì)胞肺癌185例預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是NSCLC病人發(fā)生轉(zhuǎn)移的常見部位，腫瘤細(xì)胞從血管外溢到腦組織，故腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移部位常與局部血流量呈正相關(guān)，約80%的腦轉(zhuǎn)移發(fā)生在大腦半球［6］。誘導(dǎo)性頭痛是病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移后最主要的臨床癥狀，受機(jī)體能量消耗較大、癌細(xì)胞侵犯、免疫力下降等因素影響，病人出現(xiàn)體質(zhì)量下降、疲勞乏力等癥狀，此外，可能還會(huì)出現(xiàn)刺激性咳嗽、嘔吐、認(rèn)知改變、視力障礙、耳鳴、耳聾、語言缺失等臨床癥狀［7-8］。NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移后神經(jīng)功能受損，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，雖然治療技術(shù)在不斷的提高，但腦轉(zhuǎn)移病人的生存率仍不理想，因此，早期診斷NSCLC腦轉(zhuǎn)移顯得尤為重要［9-10］。外周血檢測(cè)生物標(biāo)志物具有方便、快捷、無創(chuàng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是臨床中癌癥診斷和隨訪最理想的工具之一［11］。

miRNAs是重要的調(diào)控分子，30%哺乳動(dòng)物的蛋白編碼基因可能受miRNAs的調(diào)控，miR-375位于人2號(hào)染色體q35，cryba2和Ccdc108之間，屬于miRNAs家族中的一員，在生物體內(nèi)具有基因表達(dá)調(diào)控作用［12-13］。miR-375最早是在胰島β細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的，隨著深究的深入，血清miR-375已被證實(shí)在胃癌、前列腺癌、肝癌、宮頸癌等病人體內(nèi)呈低表達(dá)，為腫瘤的早期無創(chuàng)性診斷開辟了一條新途徑［14］。付婷等［15］研究顯示，肝癌組織中miR-375表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，星形膠質(zhì)細(xì)胞升高基因1（AEG-1）是重要的癌基因，是miR-375信號(hào)途徑下游的直接靶點(diǎn)，miR-375可通過靶向AEG-1抑制肝癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲。王月秋等［16］闡明多種miRNA參與PI3k/Akt信號(hào)通路的調(diào)控，推測(cè)miR-375可能是PI3k/Akt信號(hào)通路重要的調(diào)控因子，胰島素樣生長因子1受體（IGFIR1）是其腫瘤抑制作用的新靶點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外關(guān)于血清miR-375表達(dá)水平與腦轉(zhuǎn)移發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系較少，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組血清miR-375表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，而轉(zhuǎn)移組血清miR-375表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；說明NSCLC病人血清miR-375表達(dá)顯著失調(diào)，miR-375可能是NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子［17］。我們還分析了miR-375與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系，NSCLC病人血清miR-375表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與病人年齡、病理類型無關(guān)，提示血清miR-375低表達(dá)可能與NSCLC的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。ROC曲線分析顯示，血清miR-375表達(dá)水平診斷NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的AUC為0.975，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確率均較高，進(jìn)一步說明血清miR-375表達(dá)水平診斷病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值較高。另外，多因素Cox回歸分析顯示，臨床分期、腦轉(zhuǎn)移、血清miR-375表達(dá)水平是影響NSCLC病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即血清miR-375低表達(dá)預(yù)示著NSCLC病人預(yù)后不良。

綜上所述，miR-375在NSCLC中起腫瘤抑制作用，血清miR-375表達(dá)水平下調(diào)與NSCLC病人發(fā)生腦轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是診斷NSCLC腦轉(zhuǎn)移及NSCLC病人預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物，但miR-375的腫瘤抑制機(jī)制尚不清楚，我們應(yīng)進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用潛力。