錢 凱，何 瀟，宋丹丹，譚 婷，馮育林,，楊世林，溫 泉 *

1江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心；2創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge.的干燥根及根莖，主要功效為活血化瘀，在中醫(yī)臨床上有數(shù)千年的歷史，主要成分為脂溶性[1]和水溶性酚酸類成分，丹參總酚酸為其主要活性成分群[2]，包括丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B等，其中以丹酚酸B含量最高，為丹參總酚酸的主要藥效成分[3]。目前已有多種以丹參總酚酸為主的制劑如丹參多酚酸鹽注射液、丹參滴丸等。而丹參多酚酸的工藝制備決定其藥效和成本，現(xiàn)今主要采用多步醇沉方法和30%乙醇直接提取法制備丹參總酚酸，但丹參總酚酸的損失量多達(dá)到30%～50%，且乙醇消耗大，存在溶劑殘留風(fēng)險(xiǎn)。另外，大孔樹脂吸附法[4]用于除去非藥效大分子物質(zhì)如蛋白、鞣制、色素等。以上幾種方法或可達(dá)到不同程度的精制效果,但都存在丹參多酚酸的損失、大分子雜質(zhì)殘留等精制程度不高等共性問題。因此，急需一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的方法富集精制丹參總酚酸類，不僅可以節(jié)能降耗，同時(shí)滿足精制丹酚酸B單體的原料供應(yīng)。

陶瓷膜因具有耐高溫、酸、堿、且強(qiáng)度高等優(yōu)異的材料性能,在中藥提取純化行業(yè)具有普遍的適用性[5,6]，在許多提取分離富集方面展現(xiàn)其優(yōu)越的性能[7]，而且易于清洗，節(jié)能降耗。如徐南平等將陶瓷膜技術(shù)引入中藥口服液的生產(chǎn)，有效地除去了藥液中的大分子、鞣質(zhì)及其他非藥用物質(zhì)，提高了藥液有效成分的相對(duì)含量，使得產(chǎn)品的收率和品質(zhì)得到了顯著的提高[8]，并且易克傳等研究發(fā)現(xiàn)陶瓷膜精制總黃酮效果優(yōu)于傳統(tǒng)富集方法[9]，Guo等[10]研究發(fā)現(xiàn)陶瓷膜技術(shù)可有效減輕中藥水提液對(duì)樹脂的毒化作用，提高中藥精制效果。

基于陶瓷膜的優(yōu)越性能，本研究考察了水提醇沉法、30%乙醇直接提取法和陶瓷膜法精制丹參水提液中丹參總酚酸的產(chǎn)率以及丹酚酸B的含量，進(jìn)一步確定了陶瓷膜精制丹參總酚酸的最佳膜孔徑、溫度、壓力等條件，以及從總酚酸中純化主要藥效成分丹酚酸B的方法，在丹參總酚酸制備及丹酚酸B單體工藝上具有一定的經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用價(jià)值。此外，有研究發(fā)現(xiàn)丹參及其復(fù)方制劑具有顯著的降糖活性[11]，但是在細(xì)胞水平上未見對(duì)丹酚酸B單體的研究，為此，本研究還進(jìn)一步采用HepG2細(xì)胞對(duì)其降糖活性進(jìn)行了研究，以期從提取、純化制備及藥理活性，節(jié)能降耗方向研究開發(fā)丹酚酸B作為降糖候選物質(zhì)。

1 材料與方法

DHG- 9036A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；島津分析型HPLC(Nexera XR系列)；陶瓷膜分離裝置(江蘇久吾高科，南京工業(yè)大學(xué)膜科學(xué)技術(shù)研究所研制，配備500、200、50 nm孔徑的膜)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA，東京理化)；Thermo多功能酶標(biāo)儀(美國)，YZN- 50型液體真空濃縮煎藥機(jī)(北京東華醫(yī)療設(shè)備公司)；島津UV- 2201紫外可見分光光度計(jì)；賽托里斯分析天平AL- 104；大孔吸附樹脂HP20(日本三菱公司)；20 kg丹參飲片購買于安徽亳州，批號(hào)為18091209；丹酚酸B對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):111562- 200605)。

1.1 提取工藝

水提醇沉法(WM)制備丹參總酚酸：稱取丹參2.0 kg，用20倍加熱回流水提2次，合并提取液，濃縮至適宜體積，加入1倍無水乙醇，離心得沉淀(含總酚酸)，真空干燥至恒重，稱重，得率(%)= 總固體物/2 000 g，即為丹參總酚酸得率。

30%乙醇提取法(EM)制備丹參總酚酸：稱取丹參2.0 kg，用20倍的30%乙醇回流提取2次，合并濾液，減壓蒸干至恒重，稱重，得率(%)= 總固體物/2 000 g。

陶瓷膜(CM)技術(shù)制備丹參總酚酸：稱取丹參2.0 kg，用20倍的水回流提取2次，約80 L，選用500 nm孔徑陶瓷膜進(jìn)行超濾，控制壓差為0.2 Mpa，流速控制約為2 L/min，將超濾液蒸干至恒重，稱重得率(%)= 總固體物/2 000 g。

1.2 含量測(cè)定

總酚酸含量測(cè)定：對(duì)三種提取方法所得的總固體物進(jìn)行總酚酸含量的測(cè)定，總酚酸含量測(cè)定采用比色法[4]

液相條件：島津分析型HPLC(Nexera XR系列)、Cromasil (180 mm×5 μm,i.d.2.5 μm) 液相色譜柱梯度洗脫(10%～90%甲醇- 水，40 min)，柱溫30 ℃。

1.3 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)及胰島素抵抗模型建立

細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立參照文獻(xiàn)[11]，按組別培養(yǎng)細(xì)胞后，收集細(xì)胞到15 mL離心管內(nèi)，離心后棄上清，加入蒸餾水體積400 μL，超聲波破碎細(xì)胞(冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)，置恒溫金屬浴中煮沸10 min(蓋緊，防止水分散失)，冷卻后，8 000 g，25 ℃離心10 min，取上清液備用。實(shí)驗(yàn)中通過葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖含量來計(jì)算HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取情況。葡萄糖含量按照蛋白濃度計(jì)算。

葡萄糖含量(μmol/mg)=C ×(A測(cè)定管-A空白管)

÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V樣÷(Cpr×V樣)=(A測(cè)定管-

A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

C：葡萄糖溶液濃度，1.0 μmol/mL；V樣：加入的樣品體積，50 μL = 0.05 mL；Cpr：樣品蛋白濃度mg/mL，按照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4 丹酚酸B對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞5×103cell/well的細(xì)胞密度，每孔100 μL，接種到96孔板，培養(yǎng)24 h；加入100 μL配制好的丹酚酸B溶液，分別設(shè)置6個(gè)濃度(終濃度為250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 μg/mL)，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組以及空白組，培養(yǎng)24 h；每個(gè)孔加入50 μL的5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；將96孔板的培養(yǎng)液移除，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測(cè)吸光度。

細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

其中Absample為檢測(cè)樣品的吸光度；Abnormal為正常對(duì)照組的吸光度；Abblank為空白組的吸光度。

1.5 丹酚酸B對(duì)HepG2胰島素抵抗模型細(xì)胞葡萄糖含量的影響

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置四組，正常對(duì)照組中只有細(xì)胞；模型組中只有HepG2胰島素抵抗細(xì)胞；陽性藥組中不僅有HepG2胰島素抵抗細(xì)胞，還有0.1 mg/mL的鹽酸二甲雙胍；給藥組為丹酚酸B，濃度設(shè)置為高、中、低3個(gè)濃度，分別為30、15、7.5 μg/mL。其檢測(cè)方法為造模完成后，給藥，12小時(shí)后，通過葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒來計(jì)算細(xì)胞的葡萄糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對(duì)總固體物及總酚酸含量的影響

圖1 三種提取方式總固體物、總酚酸量及總酚酸含量Fig.1 Three methods for extraction of total solid,total salvianolic acids and its percentage注：不同字母和*代表P < 0.05，相同字母代表無顯著差異(下同)。Note:Different alphabet represent P < 0.05,same alphabet represent no significance (same as below).

由圖1顯示，30%乙醇提取(EM)丹參所得的固體物總量最高為179.85g，顯著高于陶瓷膜法(CM)所得的固體物含量，然而，經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定發(fā)現(xiàn)，30%乙醇提取總酚酸含量最低，為72.84%，所得的總酚酸總量為131.01 g，陶瓷膜雖然所得的固體物含量為158.63 g，但其總酚酸含量為85.52%，顯著高于其余兩組，三組在總酚酸量方面沒有顯著差異。說明陶瓷膜超濾方法能減少總固體物量，去除蛋白、鞣制等大分子物質(zhì)，使得提取物的總酚酸含量顯著提升。因此，從總酚酸的提取及節(jié)能降耗方面，用陶瓷膜超濾技術(shù)具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.2 不同孔徑陶瓷膜對(duì)總酚酸的影響

為了進(jìn)一步研究陶瓷膜孔徑對(duì)總酚酸提取的效率及其含量，本研究用三種不同孔徑(500、200、50 nm)規(guī)格的陶瓷膜對(duì)總固體物及總酚酸含量進(jìn)行研究，結(jié)果顯示隨著陶瓷膜超濾孔徑的減小，固體物含量有所下降，但是孔徑?jīng)]有顯著影響，說明500 nm左右的陶瓷膜能夠?qū)⒋蟛糠值牡鞍?、鞣質(zhì)及其它大分子雜質(zhì)除去。對(duì)總固體物中的總酚酸有最大限度的保留，但是隨著孔徑的減小，總酚酸含量是逐步上升的，說明在50～500 nm區(qū)間，還含有一些非酚酸類的大分子物質(zhì)，如多糖等。因此，采用50 nm孔徑的陶瓷膜對(duì)丹參水提液進(jìn)行超濾，能夠保證總酚酸含量的增加，但對(duì)提取效率沒有顯著影響。

2.3 不同孔徑陶瓷膜對(duì)總酚酸中丹酚酸B含量的影響

丹酚酸B作為丹參總酚酸中的主要成分，具有多種生理活性，國內(nèi)外對(duì)其研究較為廣泛，因此，本研究通過液相色譜，建立丹酚酸B的標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 8 065 421.701 1x- 2 186 885.813 5(R2=0.999 7)，研究不同陶瓷膜孔徑下，所得總酚酸中丹酚酸B的含量。根據(jù)液相結(jié)果，表明經(jīng)50 nm的陶瓷膜超濾所得總酚酸中丹酚酸B含量最高，根據(jù)峰面積相對(duì)比值達(dá)到90.55%，為進(jìn)一步純化丹酚酸B提供了含量更高的總提物。

圖2 不同陶瓷膜孔徑對(duì)總固體物、總酚酸量及總酚酸含量的影響Fig.2 Effect of different apertures of ceramic membrane on extraction of total solid,total salvianolic acids and its percentage

圖3 不同孔徑陶瓷膜濾過液的HPLC Fig.3 HPLC for filtered solution under different apertures of ceramic membrane

圖4 不同陶瓷膜孔徑所得總酚酸中丹酚酸B的含量Fig.4 The concentration of salvianolic acids B through different apertures of ceramic membrane

2.4 純化丹酚酸B的條件

上述研究為純化出98%以上的丹酚酸B提供了較好的丹參總酚酸原料，因此，本研究從節(jié)能降耗角度，利用大孔樹脂HP- 20，以不同濃度的(水、10%、20%、40%、80%)甲醇進(jìn)行洗脫，純化丹酚酸B，根據(jù)洗脫結(jié)果，發(fā)現(xiàn)40%的甲醇洗脫部位，丹酚酸B含量最高，液相結(jié)果顯示其純度可達(dá)98.3%(圖5)，為后續(xù)研究丹酚酸B的生物活性提供了標(biāo)準(zhǔn)原料，本方法從藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)角度是可行的。

圖5 經(jīng)大孔樹脂HP- 20純化后丹酚酸B的HPLC Fig.5 HPLC of salvianolic acids B after purification using macroporous resin HP- 20

綜上，丹參總酚酸及丹酚酸B的工藝為，首先將丹參藥材切片，20倍水回流提取2次，用50 nm孔徑陶瓷膜進(jìn)行超濾，濾液減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，得總酚酸后復(fù)溶，再上大孔樹脂HP- 20，40%乙醇洗脫，最終得丹酚酸B.

2.5 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型鑒定及細(xì)胞毒性研究

圖6為正常HepG2細(xì)胞和胰島素抵抗模型的HepG2細(xì)胞的葡萄糖含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖中可知，正常組HepG2細(xì)胞的葡萄糖含量為0.06 μmol/mg，而HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型組中葡萄糖含量為0.2 μmol/mg。兩者相差兩倍多，與正常組相比，模型組細(xì)胞葡萄糖含量出現(xiàn)顯著差異(P< 0.01)。

圖6 Hep- G2細(xì)胞胰島素抵抗模型鑒定 Fig.6 The identification model of Hep- G2 insulin resistance 注：**代表P < 0.01(下同)。Note:**represent P < 0.01 (same as below).

圖7 HepG2細(xì)胞細(xì)胞毒性Fig.7 Cytotoxicity of HepG2

圖8 正常HepG2細(xì)胞與胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的形態(tài)Fig.8 The HepG2 morphology of normal cell and insulin resistance cell 注：A1.正常HepG2細(xì)胞(放大倍數(shù)：200×)；A2.正常HepG2細(xì)胞(放大倍數(shù)：400×)；B1.胰島素抵抗HepG2細(xì)胞(放大倍數(shù)：200×)；B2.胰島素抵抗HepG2細(xì)胞(放大倍數(shù)：400×)。Note:A1.normal HepG2 (zoom:200×);A2.normal HepG2 (zoom:400×);B1.HepG2 insulin resistance (zoom:200×);B2.HepG2 insulin resistance (zoom:400×).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型成功。

圖7為丹酚酸B對(duì)HepG2細(xì)胞24小時(shí)的細(xì)胞毒性。從圖中可知，隨著濃度的増加，丹酚酸B對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率下降，但濃度低于31.25 μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞沒有顯著的毒性(P> 0.05)，而濃度高于62.5 μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞有顯著的毒性(P< 0.01)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇濃度31.25 μg/mL以下都不會(huì)因細(xì)胞毒性而引起差異。實(shí)驗(yàn)中選取了高、中、低3個(gè)不同濃度，分別為30、15和7.5 μg/mL。

顯微鏡下觀察，正常HepG2和胰島素抵抗HepG2細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形、菱形、不規(guī)則形；兩組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均未見明顯差別。正常HepG2細(xì)胞與胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的形態(tài)見圖8。

2.6 丹酚酸B對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖含量的影響

從圖9中可以看出，和模型組相比，培養(yǎng)基中加入鹽酸二甲雙胍后，HepG2胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖含量顯著降低(P<0.01)，但是并沒有恢復(fù)到正常組水平。同時(shí)給藥組隨著丹酚酸B濃度的増加，HepG2胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖含量逐漸降低，但三個(gè)濃度和模型組相比都出現(xiàn)顯著性的差異(P< 0.01)，同時(shí)可以看出高濃度丹酚酸B的葡萄糖含量降低顯著，低濃度趨于平緩。

3 討論

丹參總酚酸是丹參的主要活性成分群，具有廣泛的藥理活性[13]，而總酚酸中丹酚酸B是主要成分，眾多研究證實(shí)丹酚酸B具有多種藥理活性，如對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用[14]，明顯改善心肌缺血等活性，市場(chǎng)上對(duì)丹參總酚酸和丹酚酸B的需求與日俱增。然而丹參總酚酸和丹酚酸B的純化工藝主要還是通過傳統(tǒng)的水提、濃縮、過大孔樹脂[15]，雖然產(chǎn)率及純度也能達(dá)到要求，但是工藝較為繁瑣且容易造成資源浪費(fèi)及產(chǎn)生過多的廢棄物[16,17]。

圖9 丹酚酸B對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖含量的影響Fig.9 The effect of salvianolic acids B on glucose content of HepG2 insulin resistance model 注：正常組為正常HepG2細(xì)胞，模型組為HepG2胰島素抵抗細(xì)胞；陽性組為鹽酸二甲雙胍；給藥組設(shè)置三個(gè)濃度梯度。Note:Normal group as HepG2;Model group as HepG2 insulin resistance；Positive group as metformin;Medicine group set three concentration.

本研究通過比較各提取方法發(fā)現(xiàn)，陶瓷膜雖然在總提物含量不如直接用30%醇提，但是其總酚酸含量顯著高于其它兩種提取方式，且進(jìn)一步研究陶瓷膜的最佳工藝，對(duì)主要參數(shù)陶瓷膜孔徑(500、200、50 nm)三種規(guī)格進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)總酚酸含量隨截留孔徑縮小而增高，但固體物含量并未顯著降低，說明500 nm可以有效除去大分子蛋白及鞣酸類成分，但是其他50～500 nm孔徑的非酚酸類成分會(huì)殘留，而50 nm則能有效去除雜質(zhì)，一步過濾，丹酚酸B的含量可達(dá)到87%，并且經(jīng)陶瓷膜過濾后，提取液由渾濁變?yōu)槌吻澹@對(duì)于后續(xù)開發(fā)丹參總酚酸的口服液提供了研究基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步從總酚酸中純化丹酚酸B，本研究用大孔樹脂HP- 20對(duì)其進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)40%乙醇洗脫，蒸干后丹酚酸B純度即可達(dá)到98.3%。對(duì)于丹酚酸B用于其它藥理實(shí)驗(yàn)研究和市場(chǎng)供應(yīng)提供了工藝參考。另外，Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可改善2型糖尿病大鼠IR作用，但未從細(xì)胞水平上研究其降糖活性和細(xì)胞毒活性的評(píng)價(jià)。因此，基于上述工藝制備的丹酚酸B，本研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B濃度低于31.25 μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞沒有顯著的毒性，且具有顯著的降糖活性，本研究從工藝優(yōu)化及其細(xì)胞水平的降糖活性對(duì)丹酚酸B進(jìn)行了研究，從節(jié)能降耗方向?yàn)楣I(yè)化生產(chǎn)和研究丹酚酸B作為降糖候選藥物提供了研究基礎(chǔ)。