李婉茹， 張玲玲，2??， 張美溦， 李若佼， 李仰平， 郭振義， 包振民，2

(1.中國海洋大學(xué)海洋海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

促性腺激素釋放激素(GnRH)是哺乳動物下丘腦分泌合成的多肽類激素，是“下丘腦-垂體-性腺”軸的關(guān)鍵信號分子，其主要功能是通過控制垂體下葉釋放卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的釋放，調(diào)節(jié)動物性別分化、性腺發(fā)育和生殖過程。Okubo等[1]的研究表明，在大多數(shù)脊椎動物中，GnRH有兩種形式，即GnRH I(mammalian-GnRH)和GnRH II(chicken GnRH)，部分硬骨魚除了GnRH I和GnRH II，還有GnRH III(salmon GnRH)。其中，GnRH I的作用是刺激促性腺激素釋放，從而調(diào)節(jié)動物生殖繁育，而其他兩種GnRH則在外側(cè)下丘腦發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。

近年來，研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)GnRH并非脊椎動物所特有，在軟體動物中也廣泛存在[2]。目前研究者們已克隆獲得真蛸(Octopusvulgaris)[3]、劍尖槍烏賊(Uroteuthisedulis)[4]、曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)[5]、海兔(Aplysiacalifornica)[6]、帽貝(Lottiagigantea)[7]、耳鮑(Haliotisasinine)[8]、長牡蠣(Crassostreagigas)[9]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[10]等物種的GnRH基因?？茖W(xué)家還通過質(zhì)譜獲得了長牡蠣[11]和蝦夷扇貝[12]的GnRH活性肽序列。關(guān)于軟體動物GnRH的功能已在多個物種中報(bào)道：在腹足綱動物海兔中，GnRH可通過調(diào)節(jié)肌肉收縮控制末梢組織的運(yùn)動，但其不具有調(diào)節(jié)生殖的功能[13-14]；在同是腹足綱動物的耳鮑中，GnRH則分布在成熟卵巢中，可能參與卵母細(xì)胞的發(fā)育[15]；在頭足綱動物真蛸中，GnRH除了參與調(diào)節(jié)動物的攝食、記憶和運(yùn)動外[16]，還能促進(jìn)孕酮、睪酮和雌二醇等激素合成，調(diào)節(jié)卵巢和精巢發(fā)育[17]；在貽貝(Mytilusedulis)、長牡蠣、蝦夷扇貝等雙殼類動物中，GnRH能促進(jìn)性原細(xì)胞增殖，加速性腺發(fā)育[18-19]，而且注射GnRH活性肽還可以使雌性蝦夷扇貝發(fā)生性轉(zhuǎn)，影響性別分化[20]。以上研究表明，GnRH參與調(diào)控軟體動物多種生理過程，包括生殖調(diào)節(jié)。

目前，軟體動物GnRH生殖調(diào)控機(jī)制的研究已取得初步進(jìn)展。Nuurai等[15]研究發(fā)現(xiàn)，耳鮑中GnRH在耳鮑的腦神經(jīng)節(jié)、足神經(jīng)節(jié)和卵巢中均有分布，推測其可能通過自分泌或旁分泌調(diào)控卵巢的發(fā)育；但在蝦夷扇貝中，GnRH主要分布在臟神經(jīng)節(jié)，在性腺中并沒有陽性信號，推測主要通過血液轉(zhuǎn)運(yùn)到精巢，調(diào)控精巢發(fā)育進(jìn)程，促進(jìn)精原細(xì)胞增殖[12，19]。因而，在不同種類的軟體動物中，GnRH的生殖調(diào)節(jié)功能有明顯差異，而此前對GnRH生殖調(diào)節(jié)機(jī)制的研究也主要集中在雌雄異體生物。

海灣扇貝(Argopectenirradians)為暖水性貝類，原產(chǎn)于美國東海岸，于1980年代初引入中國，現(xiàn)已成為中國扇貝養(yǎng)殖的主要品種之一[21]。海灣扇貝有春、秋兩個繁殖季節(jié)，以春季質(zhì)量較好。作為一種雌雄同體的扇貝，海灣扇貝的性別穩(wěn)定，其性腺由位于腹嵴外周緣的精巢和位于內(nèi)側(cè)的卵巢組成。但迄今為止，尚缺乏對海灣扇貝性腺發(fā)育過程中GnRH功能的系統(tǒng)研究。本研究將以海灣扇貝為研究對象，利用RACE技術(shù)克隆其GnRH基因cDNA全長，分析序列結(jié)構(gòu)特征，并跟蹤海灣扇貝生殖周期中GnRH基因在臟神經(jīng)節(jié)及腦足神經(jīng)節(jié)中的動態(tài)表達(dá)變化過程，以期深入理解GnRH在雌雄同體動物生殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 海灣扇貝樣品的獲取

實(shí)驗(yàn)用海灣扇貝為2015年春季繁育，于2015年8月—2016年3月，取自山東省青島市沙子口養(yǎng)殖區(qū)，每月取回1次，每次取樣約50只。將海灣扇貝置于實(shí)驗(yàn)室過濾海水中暫養(yǎng)1天后，挑選15～20只活性良好的扇貝，獲取同一個體的腦足神經(jīng)節(jié)(PGCG)及臟神經(jīng)節(jié)(PVG)，于液氮中速凍后，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 海灣扇貝GnRH基因的克隆

采用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法提取海灣扇貝神經(jīng)節(jié)總RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并用NanoDrop2000 (Thermo Scientific) 檢測RNA濃度。參考海灣扇貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種GnRH基因的全長序列，設(shè)計(jì)基因特異引物GSP及相應(yīng)巢式引物NGSP(見表1)。使用SMARTer?RACE 5’/3’試劑盒(Clontech)，合成cDNA的第一鏈，并進(jìn)行5’-RACE和3’-RACE 的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit 純化后連接到pMD18T 載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取陽性克隆，經(jīng)菌落PCR檢測后，交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 GnRH基因序列特征分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

根據(jù)得到的海灣扇貝GnRH基因cDNA全長，翻譯出蛋白質(zhì)全長序列。利用SignalP 4.1及Signal-3L軟件預(yù)測其信號肽，并預(yù)測酶切位點(diǎn)(KR或R)，酰胺化修飾位點(diǎn)(G)及活性肽。

參照文獻(xiàn)[3-5,7-9,22-32]，從NCBI下載脊椎動物和無脊椎動物GnRH蛋白序列。利用GeneDoc軟件，對不同物種的蛋白進(jìn)行多序列比對分析；利用MEGAX軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，建樹方法選擇NJ鄰接法(Neighbor-Joining)，遺傳距離的計(jì)算采用p-distance法，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.4 反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)量

取1.5 μg RNA，加入1 μL Oligo dT(100 μmol/L)后，將體系用水補(bǔ)至12.5 μL?；靹蚝?，65 ℃溫育5 min。加入4 μL 5×Buffer、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor (40 U/μL)、2 μL dNTP(10 mmol/L)、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)?；靹蚝螅?2 ℃90 min，72 ℃10 min。

根據(jù)海灣扇貝GnRH基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，內(nèi)參基因選擇EF1a，熒光定量PCR引物見表1。

表1 RACE引物及滎光定量PCR引物列表

實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：將cDNA稀釋15倍后取2 μL作為模板，加入10 μL SYBR Green I Real-time PCR Master Mix，上、下游引物(2 μmol/L)各4 μL。使用LightCycler480 實(shí)時熒光定量PCR 儀(Roche)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃1 min，40個循環(huán)；94 ℃ 15 s，1個循環(huán)。分析產(chǎn)物的熔解曲線，檢驗(yàn)引物特異性，并采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。使用SPSS 20.0軟件，通過單因素方差分析(one-way ANOVA,Duncan)分析各月份GnRH表達(dá)量差異顯著性；使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分析同一月份兩神經(jīng)節(jié)GnRH表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海灣扇貝GnRH基因的cDNA全長克隆

海灣扇貝GnRH基因的cDNA序列全長1 335 bp，其中5’ UTR614 bp，3’ UTR415 bp，ORF306 bp，編碼101個氨基酸。預(yù)測GnRH前體蛋白分子量為11 kDa，等電點(diǎn)為9.06。SignalP預(yù)測發(fā)現(xiàn)在GnRH前體的5’端存在24個氨基酸的信號肽，結(jié)合酶切位點(diǎn)和酰胺化修飾位點(diǎn)分析推測，活性肽緊隨信號肽之后，是具有酰胺化修飾的11個氨基酸的短肽(QNFHYSNGWQP-amide)(見圖1)。

(圖中黃色部分為信號肽，紫色為GnRH活性肽，綠色為酰胺化位點(diǎn)，紅色為活性肽的酶切位點(diǎn)。Signal peptide is highlighted in yellow, GnRH-like bioactive peptides in purple, amidation site in green, cleavage sites in red.)

圖1 海灣扇貝GnRH全長cDNA序列及編碼氨基酸序列
Fig.1 The full-length cDNA and predicted protein sequence of GnRH fromArgopectenirradians

2.2 同源分析和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

將海灣扇貝GnRH活性肽與人、小鼠等物種的活性肽進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明脊椎動物與軟體動物的GnRH活性肽長度不同，前者為十肽，后者為十一肽和十二肽；但活性肽區(qū)域的保守性較高，N端均為Gln(Q)，C端均為酰胺化位點(diǎn)Gly(G)。脊椎動物GnRH活性肽更為相似，相似度介于85%～100%；軟體動物GnRH活性肽序列更為相似，相似度在60%～100%。海灣扇貝GnRH活性肽與蝦夷扇貝一致性最高，為100%；與頭足類和硬骨魚GnRH活性肽的序列一致性分別下降至73%和67%(見表2)。

利用GnRH蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果見圖2。所有GnRH蛋白分成兩大進(jìn)化支：一支由脊椎動物GnRH蛋白組成，其中哺乳動物(人，小鼠)、鳥類(雞，番鴨)和兩棲類(爪蟾，牛蛙)聚在一起，硬骨魚類(斑馬魚，青鳉，虹鱒，櫻鱒)GnRH單獨(dú)聚在一起；另一支由軟體動物GnRH蛋白組成，其中海灣扇貝與同為雙殼類的蝦夷扇貝、長牡蠣GnRH聚在一起，頭足類(真蛸，兩種烏賊)和腹足類(帽貝，皺紋盤鮑，綠唇鮑)分別聚為單獨(dú)的小支。

表2 海灣扇貝GnRH活性肽與其他物種GnRH活性肽一致性Table 2 Identities of GnRH-like bioactive peptides of Argopectenirradians with that of other species

2.3 海灣扇貝GnRH在神經(jīng)節(jié)中的動態(tài)表達(dá)變化

為研究GnRH基因在海灣扇貝生殖調(diào)控中的作用，本文利用實(shí)時熒光定量PCR跟蹤了2015年8月—2016年3月期間，GnRH基因在海灣扇貝腦足神經(jīng)節(jié)(PGCG)及臟神經(jīng)節(jié)(PVG)的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。GnRH基因在PGCG和PVG中均有表達(dá)且均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，峰值出現(xiàn)在11月份。在2015年10月—2016年1月期間，PGCG中GnRH的表達(dá)量顯著高于PVG(P<0.05)。

(人HomosapiensNM_000825.3, 小鼠MusmusculusNM_008145.2, 雞GallusgallusAEZ51861.1, 番雞CairinamoschataAGW18221.1, 爪蟾XenopuslaevisAAA49728.1, 牛蛙RanacatesbeianaAAL05972.1, 斑馬魚DaniorerioCAC18539.1, 青鳉OryziaslatipesBAB16302.1, 虹鱒OncorhynchusmykissAAD43462.1,櫻鱒OncorhynchusmasouAAB63599.1,真蛸OctopusvulgarisBAB86782.1, 薊尖槍烏賊UroteuthisedulisBAH09303.1, 曼式無針烏賊SepiellajaponicaALS92801.1,帽貝LottiagiganteanFC805607.1,皺紋盤鮑HaliotisdiscushannaiBBH51367.1,綠唇鮑HaliotislaevigataAKR13997.1, 長牡蠣CrassostreagigasHQ712119.1, 蝦夷扇貝PatinopectenyessoensisBAH47639.1.)

圖2 GnRH氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析及活性肽序列比對
Fig.2 Phylogenetic tree of GnRH protein and multiple alignments of GnRH-like bioactive peptides

圖3 2015年8月—2016年3月GnRH基因在海灣扇貝腦足神經(jīng)節(jié)(PGCG)和臟神經(jīng)節(jié)(PVG)中的表達(dá)情況
Fig.3 Relative expression levels ofGnRHin PGCG and PVG ofArgopectenirradiansfrom August 2015 to March 2016

3 討論

GnRH在脊椎動物中僅具有保守的生殖功能，而在軟體動物中GnRH的功能則較為多樣化。通過對脊椎動物和軟體動物GnRH活性肽的分析，本研究發(fā)現(xiàn)兩個類群GnRH活性肽在1、4、6、8位具有保守的氨基酸，分別為Gln(Q)、His(H)、Ser(S)和Gly(G)，在活性肽N-末端存在焦谷氨酸化修飾(p-Q)，在C-末端存在酰胺化修飾(-amide)。而兩個類群GnRH活性肽在長度及某些位置的氨基酸存在差異：脊椎動物GnRH活性肽均為十肽，軟體動物則在2和3位有2個額外的氨基酸(NY或NF)，且脊椎動物和頭足類GnRH活性肽在C-末端比雙殼類和腹足類的多出一個Gly，導(dǎo)致軟體動物的活性肽為十一或十二肽。這些序列差異可能是導(dǎo)致兩個類群生物的GnRH功能不同的重要因素。此外，GnRH在脊椎動物和軟體動物中的功能差異還可能與垂體的起源有關(guān)[33]：脊椎動物保守的生殖功能可能依賴于下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸的調(diào)控[34]，而軟體動物尚未進(jìn)化出垂體，GnRH可能直接作用于靶器官[33]，導(dǎo)致其GnRH具有多種功能。

GnRH作為一種神經(jīng)肽，主要由神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生。在脊椎動物中，GnRH是由下丘腦分泌產(chǎn)生的[35-38]；在無脊椎動物雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)中，GnRH已被證實(shí)是在腦神經(jīng)節(jié)中合成的[39]。雙殼類雖然沒有腦，但有腦足神經(jīng)節(jié)和臟神經(jīng)節(jié)。本研究中，海灣扇貝GnRH基因在兩個神經(jīng)節(jié)中均有表達(dá)，這與蝦夷扇貝中的研究結(jié)果相似[12]；而在腹足綱動物皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)中，GnRH也主要在神經(jīng)節(jié)(腦神經(jīng)節(jié)、足神經(jīng)節(jié))中表達(dá)[32]。此外，海灣扇貝腦足神經(jīng)節(jié)中GnRH的表達(dá)量高于臟神經(jīng)節(jié)，但在蝦夷扇貝中GnRH活性肽則被認(rèn)為主要來自臟神經(jīng)節(jié)[12]。導(dǎo)致這種差異的原因可能有兩種：其一，GnRH基因?qū)Υ菩郛愺w動物和雌雄同體動物的生殖調(diào)控存在差異，蝦夷扇貝為雌雄異體，海灣扇貝則是雌雄同體；其二，本試驗(yàn)海灣扇貝GnRH表達(dá)情況是通過檢測其前體mRNA的表達(dá)量進(jìn)行的，而蝦夷扇貝GnRH的表達(dá)情況則是檢測活性肽，不排除腦足神經(jīng)節(jié)中GnRH前體mRNA雖然表達(dá)量較高，但由于后續(xù)翻譯及翻譯后加工的效率較差，反而導(dǎo)致其活性肽含量較低。

為了研究海灣扇貝神經(jīng)節(jié)GnRH在性腺發(fā)育的作用，本研究分析了2015年8月—2016年3月期間青島沙子口海區(qū)的養(yǎng)殖海灣扇貝GnRH基因的表達(dá)情況，逐月獲取其神經(jīng)節(jié)和性腺材料，通過對性腺進(jìn)行石蠟切片確定性腺發(fā)育時期。遺憾的是，可能由于當(dāng)年海區(qū)營養(yǎng)、水溫等環(huán)境問題，在檢測的所有樣品中性腺均未發(fā)育。但結(jié)合實(shí)驗(yàn)室對養(yǎng)殖蝦夷扇貝和海灣扇貝生殖周期研究的經(jīng)驗(yàn)，海灣扇貝性腺發(fā)育略晚于蝦夷扇貝。同年9、10月所取臨近海區(qū)蝦夷扇貝處于性腺發(fā)育的增殖期，因此推測海灣扇貝性腺發(fā)育應(yīng)在10月之后。由于海灣扇貝GnRH活性肽與蝦夷扇貝質(zhì)譜鑒定的GnRH活性肽序列完全相同，而蝦夷扇貝GnRH活性肽可調(diào)控精原細(xì)胞增殖[34,40]，推測海灣扇貝神經(jīng)節(jié)中GnRH在11月份出現(xiàn)的表達(dá)高峰，可能跟性腺發(fā)育啟動有關(guān)。