人ARID1A基因，即AT豐富結(jié)合域1A，屬于酵母交換型轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵(SWI/SNF)復(fù)合物的非催化亞基，其功能障礙可引起染色質(zhì)重塑異常，導(dǎo)致基因表達(dá)調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而引發(fā)多種疾病。人源性E-鈣黏蛋白(E-cadherin)由CDH1基因編碼，主要分布于上皮細(xì)胞表面，可促進(jìn)細(xì)胞間的連接，與細(xì)胞的黏附功能密切相關(guān)，而該功能對(duì)于多種組織中不同細(xì)胞的細(xì)胞間隙及細(xì)胞相互作用的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1]。EphA2基因，即促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞A2受體，是首個(gè)被篩選出來(lái)的 Eph 受體酪氨酸亞家族成員，其在細(xì)胞膜上有磷酸化和非磷酸化兩種狀態(tài)，在正常上皮細(xì)胞中，EphA2受體與其配體結(jié)合，構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致自身磷酸化而被降解；而腫瘤細(xì)胞的EphA2受體主要以非磷酸化狀態(tài)存在，并且表達(dá)增高。本文探究了三者在胃黏膜癌變過(guò)程中的作用、三者之間的相互關(guān)系及臨床意義，為胃癌的早期診斷及治療提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年6月至2018年12月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科內(nèi)窺鏡中心行胃鏡檢查，且同時(shí)行活組織檢查的150例患者的組織石蠟標(biāo)本，分為慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎伴腸化組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和胃癌組，每組各30例。所有標(biāo)本均由兩位內(nèi)鏡專家及兩位病理學(xué)專家根據(jù)內(nèi)鏡形態(tài)學(xué)和病理組織學(xué)特征確認(rèn)。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)簽署入組知情同意書；(2)胃癌患者檢查前未接受化學(xué)治療或放射治療；(3)近4周內(nèi)未服用質(zhì)子泵抑制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物、非甾體類抗炎藥(NSAID)；(4)近4周內(nèi)無(wú)飲酒史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在胃鏡檢查禁忌證；(2)身體其他部位存在腫瘤；(3)存在嚴(yán)重的肝腎功能不全、肝硬化、糖尿病及凝血功能異常。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組情況

慢性非萎縮性胃炎組30例，其中男性17例，女性13例，平均年齡(38.47±11.90)歲；慢性萎縮性胃炎伴腸化組30例，其中男性15例，女性15例，平均年齡(38.80±11.84)歲；低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組30例，其中男性20例，女性10例，平均年齡(41.83±9.83)歲；高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組30例，其中男性20例，女性10例，平均年齡(41.50±8.38)歲；胃癌組30例，其中男性22例，女性8例，平均年齡(43.10±9.72)歲。各組患者的性別及年齡相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 主要材料和試劑

ARID1A兔抗人多克隆抗體、E-cadherin兔抗人多克隆抗體、EphA2兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。即用型免疫組織化學(xué)超敏SP檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將標(biāo)本組織進(jìn)行固定、脫水、浸蠟、包埋和切片處理后，按5 μm厚度切取3張切片，分別進(jìn)行ARID1A、E-cadherin、EphA2的免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)步驟：將選擇好的組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、脫水→高壓鍋中進(jìn)行抗原熱修復(fù)→加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→加入非免疫性動(dòng)物血清封閉液→分別滴加1∶100的一抗稀釋液蓋住組織，4 ℃過(guò)夜→加入生物素標(biāo)記的二抗→加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶→滴加DAB工作液進(jìn)行顯色→蘇木素復(fù)染，梯度酒精中脫水、透明、封片，玻片晾干后鏡下觀察，隨后進(jìn)行圖片采集及結(jié)果匯總。

1.5 染色結(jié)果

ARID1A、E-cadherin和EphA2的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物為棕色或棕褐色顆粒，其中ARID1A定位于細(xì)胞核中，E-cadherin定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，EphA2定位于細(xì)胞質(zhì)中。Bresalier半定量公式用于判斷各組的染色情況，隨機(jī)選取高倍鏡下的10個(gè)視野區(qū)，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度對(duì)每個(gè)高倍視野區(qū)進(jìn)行分級(jí)，共分為4級(jí)：陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、強(qiáng)陽(yáng)性(++)和強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；細(xì)胞未著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。通過(guò)計(jì)數(shù)已著色的視野數(shù)，按照下列公式計(jì)算切片的平均染色強(qiáng)度：IS(intensity store)=∑{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)}，F(xiàn)= %×10視野。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理。采用Krusral-wallisH非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎伴腸化組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、胃癌組間進(jìn)行Bonferroni法多重比較(組間采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn))，以校驗(yàn)P*<0.005(P<0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Kendall′stau-b等級(jí)相關(guān)分析法分析ARID1A、E-cadherin和EphA2之間表達(dá)的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARID1A在各組中表達(dá)水平的比較

采用Krusral-wallisH方法檢驗(yàn)ARID1A在各組中的表達(dá)秩均值，結(jié)果分別為105.65、95.87、79.33、53.03和43.62，表達(dá)呈逐漸遞減趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=49.188,P<0.01)。對(duì)各組間進(jìn)行Bonferroni法多重比較，結(jié)果顯示ARID1A在慢性非萎縮性胃炎組與慢性萎縮性胃炎伴腸化組中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎伴腸化組與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、胃癌組中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 E-cadherin在各組中表達(dá)水平的比較

采用Krusral-wallisH方法檢驗(yàn) E-cadherin在各組中的表達(dá)秩均值，結(jié)果分別為104.38、96.43、76.68、55.93和44.07，表達(dá)呈逐漸遞減趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.670，P<0.01)。對(duì)各組間進(jìn)行Bonferroni法多重比較，結(jié)果顯示E-cadherin在慢性非萎縮性胃炎組與慢性萎縮性胃炎伴腸化組中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎伴腸化組與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、胃癌組中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 EphA2在各組中表達(dá)水平的比較

采用Krusral-wallisH方法檢驗(yàn)EphA2在各組中的表達(dá)秩均值，結(jié)果分別為34.35、62.32、78.05、99.37和103.42，表達(dá)呈逐漸遞增趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=57.488,P<0.01)。對(duì)各組間進(jìn)行Bonferroni法多重比較，結(jié)果顯示EphA2在慢性萎縮性胃炎伴腸化組與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與胃癌組中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在慢性萎縮性胃炎伴腸化組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、胃癌組中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與慢性非萎縮性胃炎組中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1ARID1A在不同胃黏膜組織中的表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)染色 ×400A慢性非萎縮性胃炎組B慢性萎縮性胃炎伴腸化組C低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組D高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組E胃癌組

圖2E-cadherin在不同胃黏膜組織中的表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)染色 ×400A慢性非萎縮性胃炎組B慢性萎縮性胃炎伴腸化組C低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組D高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組E胃癌組

圖3EphA2在不同胃黏膜組織中的表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)染色 ×400A慢性非萎縮性胃炎組B慢性萎縮性胃炎伴腸化組C低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組D高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組E胃癌組

2.4 ARID1A、E-cadherin和EphA2在各組中相關(guān)性的比較

采用Kendall′stau-b方法檢驗(yàn)ARID1A、E-cadherin和EphA2在各組間表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在慢性非萎縮性胃炎組中，ARID1A與E-cadherin表達(dá)呈顯著正相關(guān)，E-cadherin與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，ARID1A與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。在慢性萎縮性胃炎伴腸化組中，ARID1A與E-cadherin表達(dá)呈顯著正相關(guān)，E-cadherin與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，ARID1A與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中，ARID1A與E-cadherin表達(dá)呈顯著正相關(guān)，E-cadherin與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，ARID1A與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組中，ARID1A與E-cadherin表達(dá)呈顯著正相關(guān)，E-cadherin與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，ARID1A與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。在胃癌組中，ARID1A與E-cadherin表達(dá)呈顯著正相關(guān)，E-cadherin與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，ARID1A與EphA2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。具體見表1、2、3。

表1 各組中ARID1A與E-cadherin表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析

表2 各組中EphA2與E-cadherin表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析

表3 各組中EphA2與ARID1A表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析

3 討論

SWI/SNF復(fù)合物是重要的染色質(zhì)重塑復(fù)合物之一，主要由核心亞單位、催化亞單位和調(diào)節(jié)單位組成，借助三磷酸腺苷(ATP)水解釋放的能量更改核小體與基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等區(qū)域的DNA結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。作為SWI/SNF復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞單位之一，ARID1A可以特異性地調(diào)節(jié)該過(guò)程的基因表達(dá)[2]。近年來(lái)由于外顯子測(cè)序的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)ARID1A在多種腫瘤中存在高頻失活突變，這是許多惡性腫瘤發(fā)生的重要原因[3]。另外，ARID1A突變與EB病毒(EBV)感染、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性顯著相關(guān)[4]。Zhang等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A表達(dá)下調(diào)會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)消耗，同時(shí)還會(huì)直接作用于PIK3CA和PDK1靶基因，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果表明，ARID1A在各組中的表達(dá)呈逐漸遞減趨勢(shì)，推測(cè)ARID1A在胃癌癌前病變進(jìn)展至胃癌的過(guò)程中存在表達(dá)缺失，其可能作為一種抑癌基因在胃癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)ARID1A在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)水平明顯降低，雖通過(guò)多重比較發(fā)現(xiàn)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與胃癌組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校驗(yàn)前P*>0.005，校驗(yàn)后P>0.05)，但單獨(dú)比較ARID1A在兩組中的表達(dá)水平差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校驗(yàn)前P*<0.05)，提示該基因的表達(dá)失活參與了胃癌的形成過(guò)程。因此，ARID1A可能在胃癌的靶向性預(yù)防及治療中發(fā)揮重要作用。ARID1A的抑癌機(jī)制非常復(fù)雜，如果能進(jìn)一步具體闡明其抑癌機(jī)制，將對(duì)腫瘤的形成、發(fā)展及診治的研究提供一個(gè)新的思路。

E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)同源細(xì)胞與細(xì)胞間的連接和黏附，是上皮細(xì)胞中維護(hù)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性和極性的重要黏附分子，具有抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的功能。在正常組織中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)可降低同種細(xì)胞間的黏附功能，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致功能障礙，不能正常發(fā)育；在腫瘤細(xì)胞中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)可降低腫瘤細(xì)胞間的黏附作用，細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)生改變，有利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落向遠(yuǎn)處侵襲、轉(zhuǎn)移[6]。本研究結(jié)果表明，E-cadherin在各組中表達(dá)呈逐漸遞減趨勢(shì)，提示E-cadherin表達(dá)降低可升高胃癌的發(fā)生率。此外，本研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)水平明顯降低，經(jīng)多重比較發(fā)現(xiàn)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與胃癌組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校驗(yàn)前P*>0.005，校驗(yàn)后P>0.05)，推測(cè)可能有以下幾種原因：一方面，胃黏膜高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變實(shí)際上大部分已同時(shí)存在癌變[7]，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度明顯升高[8]；另一方面，由于病理科醫(yī)生對(duì)早期胃癌不夠重視，在診斷尺度把握上也存在差異，對(duì)于無(wú)法看到的浸潤(rùn)性癌變的活組織檢查樣本診斷保守，可能將惡性腫瘤誤判為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。因此，E-cadherin可能是胃黏膜癌變的早期分子事件，從低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變這一階段開始進(jìn)行積極有效地監(jiān)測(cè)或干預(yù)，可能成為防治胃癌的有效途徑之一。

EphA2屬于受體酪氨酸激酶(RTK)亞家族之一，可通過(guò)胞外配體結(jié)合區(qū)與其配體EphrinA1結(jié)合形成受體-配體復(fù)合物，使其構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致自身磷酸化被降解，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和分化，在胚胎發(fā)育、血管生成、腫瘤形成等方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，EphA2通常在正常上皮細(xì)胞中低表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[9-12]。翟道寬等[13]的研究表明，在肝細(xì)胞癌中EphA2可通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)來(lái)發(fā)揮腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移作用，其機(jī)制可能是活化了Wnt/β-catenin通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，因此EphA2可能是腫瘤EMT過(guò)程中的調(diào)控分子。本研究結(jié)果表明，EphA2在各組中表達(dá)呈逐漸遞增趨勢(shì)，提示EphA2的異常活化可能是胃癌的早期事件，對(duì)胃癌的形成和發(fā)展具有重要作用。因此，如果能盡早地在分子水平上抑制EphA2表達(dá)，有望阻止胃癌的形成或發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，ARID1A、E-cadherin和EphA2在各組中的表達(dá)具有相關(guān)性。其中，ARID1A與E-cadherin在各組中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者可能協(xié)同促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，這也證實(shí)了Yan等[14]的研究結(jié)果，他們通過(guò)在胃癌細(xì)胞中構(gòu)建E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告基因，結(jié)果顯示敲低ARID1A后，含CDH1啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告基因數(shù)值顯著下降，E-cadherin的表達(dá)水平也隨之降低，細(xì)胞遷移、侵襲能力變強(qiáng)，提示ARID1A與CDH1的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，由此得出ARID1A可能通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控E-cadherin的表達(dá)，是腫瘤EMT過(guò)程中的調(diào)控分子。在上皮細(xì)胞中，E-cadherin與EphA2共同定位于上皮細(xì)胞的外側(cè)緣，特別是細(xì)胞接觸的部位[15]，因此，兩者可以相互調(diào)節(jié)。一方面，E-cadherin表達(dá)缺失和功能改變會(huì)使細(xì)胞的黏附性降低，影響EphA2的磷酸化及其與膜結(jié)合配體的膜定位，從而升高EphA2的表達(dá)[16]；另一方面，EphA2表達(dá)升高也會(huì)破壞黏附連接，加速細(xì)胞接觸的分離，導(dǎo)致細(xì)胞接觸處E-cadherin表達(dá)下調(diào)更快[17]。本研究結(jié)果顯示E-cadherin與EphA2在各組中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)可能由于E-cadherin與EphA2黏附功能方面相互影響，形成負(fù)反饋環(huán)，因此，兩者在胃黏膜癌變過(guò)程中可能存在拮抗作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，ARID1A與EphA2在各組中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)在胃癌發(fā)生過(guò)程中，由于ARID1A的失活突變而觸發(fā)了E-cadherin的低表達(dá)，而EphA2高表達(dá)的主要原因與E-cadherin表達(dá)降低有關(guān)，因而ARID1A在此過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)地位，EphA2可能受到ARID1A的間接調(diào)控作用。眾所周知，EMT被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的特征性事件，而E-cadherin表達(dá)下降或缺失是 EMT 的重要標(biāo)志之一[18]。ARID1A和EphA2作為腫瘤EMT過(guò)程中的調(diào)控分子，異常表達(dá)后均可下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。因此，ARID1A、E-cadherin和EphA2在胃黏膜癌變過(guò)程中可相互影響，且其中ARID1A起決定性作用。

綜上所述，ARID1A蛋白、E-cadherin蛋白的低表達(dá)，以及EphA2蛋白的高表達(dá)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，共同促進(jìn)了胃癌的形成與發(fā)展，早期檢測(cè)三者在胃癌癌前病變中的表達(dá)水平，將有助于判斷病變的嚴(yán)重程度和進(jìn)展趨勢(shì)，能夠更早地干預(yù)和治療早期胃癌、逆轉(zhuǎn)癌前病變，有望成為日后胃癌免疫治療的新亮點(diǎn)。