張立超，楊宇菲，李漢卿，剌曉琴，李卓玉,,,

（1.山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

胡麻（Linum usitatissimun L.）是一種在溫帶氣候區(qū)廣泛分布的一年生植物，此種作物抗寒、耐旱、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[1]。胡麻籽是我國(guó)的重要油料作物之一，在食品和飼料中應(yīng)用廣泛。胡麻粕是胡麻籽榨油后的剩余產(chǎn)物，主要作為一種物美價(jià)廉的蛋白飼料使用。胡麻粕主要由以下3 個(gè)部分組成：1）蛋白質(zhì)，富含精氨酸和谷氨酰胺；2）胡麻膠，主要成分為醛糖二糖酸，由非還原糖和乙醛酸組成，具有良好的持水能力和高黏度；3）酚類化合物，如p-香豆酸、阿魏酸、木脂素等[3]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)胡麻粕生物活性功能的研究相對(duì)較少。

植物多酚是植物體內(nèi)一種主要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于水果、蔬菜、谷物、豆類、堅(jiān)果、茶、咖啡和葡萄酒等食物中[4-5]。植物多酚由一個(gè)或多個(gè)羥基結(jié)合一個(gè)或多個(gè)酚環(huán)形成，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)，多酚主要分為類黃酮、酚酸和木脂素類[6-7]。流行病學(xué)研究表明，富含多酚的飲食可以預(yù)防多種人類疾?。欢喾訉?duì)人體健康具有許多有益作用，主要包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、促進(jìn)血管舒張和免疫調(diào)節(jié)活性[8]。一些癌癥相關(guān)的研究結(jié)果也表明，多種多酚成分具有抗癌的特性[9]。

結(jié)腸癌是世界上最頻發(fā)的惡性腫瘤之一[10]。2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，結(jié)直腸癌位居全國(guó)癌癥發(fā)病及死亡率的第5位[11]。目前，結(jié)腸癌的治療方式主要是以手術(shù)治療為主，以化療、放療以及藥物靶向治療等為輔的綜合治療手段[12]。然而，由于腫瘤轉(zhuǎn)移以及耐藥性等問題，結(jié)腸癌治療的預(yù)后效果較差[13]。這就使得尋找新的結(jié)腸癌治療藥物成為研究的重點(diǎn)。本研究旨在探究胡麻粕是否具有抗癌活性及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡麻粕購(gòu)于山西省神池縣。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116、DLD1和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC均為山西大學(xué)生物技術(shù)研究所903實(shí)驗(yàn)室保存。

RPMI-1640和F12培養(yǎng)基 美國(guó)Thermo Scientific公司；無噬菌體胎牛血清 武漢博士德生物公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 南京碧波生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)公司；二甲基亞砜（dimethy sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、福林-酚試劑、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索萊寶科技公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC） 美國(guó)MedChem Express公司；4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、結(jié)晶紫染色液、免疫染色固定液、細(xì)胞線粒體分離試劑盒碧云天生物技術(shù)公司；Bax、Bak、Bcl-XL、Bcl-2、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和Actin抗體 艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司；X光膠片 美國(guó)Kodak公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ELGA超純水儀 威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；DMI1倒置顯微鏡 德國(guó)徠卡公司；SHZ-DIII真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LSRFortessa X-20流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；ELX800酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；coolsafe100-4真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 胡麻粕多酚的提取

采用超聲提取法從胡麻粕中提取多酚[14]。將胡麻粕粉碎，過40 目篩，在60 ℃蒸餾水中水浴脫膠多次，40 ℃干燥，石油醚脫脂，獲得脫膠脫脂胡麻粉備用。取一定量的脫膠脫脂胡麻粉，按照1∶80的料液比將其加入體積分?jǐn)?shù)54%乙醇提取劑中，在超聲功率240 W、提取溫度57 ℃的條件下提取40 min。5 000 r/min離心5 min，棄去沉淀收集上清液。將上清液在50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮25 min，將濃縮液放置于-80 ℃過夜，然后進(jìn)行冷凍干燥，獲得胡麻粕多酚粉末。

1.3.2 胡麻粕多酚質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用福林-酚比色法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL。取0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品和0.4 mL去離子水于離心管中。加0.1 mL福林-酚試劑，混勻靜置6 min。再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7% Na2CO3和0.8 mL去離子水，混勻靜置90 min。采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定各個(gè)溶液在760 nm波長(zhǎng)處的吸光度。獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝2.832 8x+0.100 8（R2＝0.993 6），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多酚的質(zhì)量濃度。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞在F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DLD1細(xì)胞和FHC細(xì)胞在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%青鏈霉素。所有細(xì)胞均放置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 細(xì)胞存活率的測(cè)定

將HCT-116、DLD1以及FHC細(xì)胞向每孔200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液中添加4×103個(gè)，分別接種到96 孔培養(yǎng)板中，并在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后將96 孔板取出，棄掉各孔中的舊培養(yǎng)基，向其中添加新的培養(yǎng)基并用不同質(zhì)量濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL）的胡麻粕多酚溶液（溶于培養(yǎng)基中）處理細(xì)胞48 h后，棄掉舊培養(yǎng)基并向各孔添加200 μL新培養(yǎng)基，然后將0.02 mL 5 mg/mL MTT加入到96 孔板中，與細(xì)胞一同孵育4 h。吸去板中培養(yǎng)基再加入0.1 mL DMSO，振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度，以不添加胡麻粕多酚為對(duì)照，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 克隆形成能力的測(cè)定

將HCT-116、FHC和DLD1細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化并接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔8×103個(gè)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后向其中加入不同質(zhì)量濃度（0.00、0.10、0.25、0.40 mg/mL）的胡麻粕多酚。72 h后棄掉板中培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次，免疫熒光染色固定液固定20 min，棄掉固定液并用結(jié)晶紫染色15 min，用PBS洗滌并照相。

1.3.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將DLD1和HCT-116細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后，分別向其中加入3 mL新培養(yǎng)基以及不同質(zhì)量濃度（0.00、0.10、0.25、0.40 mg/mL）的胡麻粕多酚溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用胰蛋白酶溶液將細(xì)胞消化2 min，然后收集細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液收集細(xì)胞，用PBS清洗2 次。取5×105個(gè)重懸的細(xì)胞置于EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞。使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，按質(zhì)量比1∶20配制AnnexinV-FITC與結(jié)合液的混合液。每個(gè)樣品中加入200 μL混合液，吹散細(xì)胞，室溫避光放置30 min。再以質(zhì)量比1∶60配制碘化丙啶（propidium iodide，PI）與結(jié)合液的混合液，每個(gè)樣品中加300 μL。4 ℃避光放置5 min后用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 蛋白表達(dá)量的測(cè)定

為了進(jìn)一步探究胡麻粕多酚對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，采用Western blotting法檢測(cè)胞內(nèi)Bak、Bcl-XL、Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量，并運(yùn)用Image J軟件對(duì)蛋白免疫印跡結(jié)果的灰度進(jìn)行分析。將DLD1和HCT-116細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后，加入不同質(zhì)量濃度（0.00、0.10、0.25、0.40 mg/mL）的胡麻粕多酚溶液，培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞。向細(xì)胞沉淀中加入一定量的細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后，用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。用甲醇洗膜，室溫?fù)u動(dòng)，吹干，再次將膜置于甲醇中，振蕩5 min。然后將膜置于牛奶封閉液中封閉，一抗孵育過夜，清洗一抗，二抗孵育2 h，曝光檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

采用Western blotting法檢測(cè)胞內(nèi)Cyt c的表達(dá)量。用不同濃度胡麻粕多酚DLD1和HCT-116細(xì)胞48 h，去除培養(yǎng)基并用PBS洗一遍，用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。加入一定體積的線粒體分離試劑輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴15 min。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，勻漿30 次左右。取2 μL細(xì)胞勻漿，加入臺(tái)盼藍(lán)染色液，混勻后顯微鏡下觀察臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性（藍(lán)色）細(xì)胞的比例。當(dāng)陽(yáng)性比例超過50%時(shí)即可停止勻漿。把細(xì)胞勻漿在600×g、4 ℃離心10 min。收集上清液，再11 000×g、4 ℃離心10 min，獲得的上清液即為胞漿。用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后，用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。用甲醇洗膜，室溫?fù)u動(dòng)，吹干，再次將膜置于甲醇中，振蕩5 min。然后將膜置于牛奶封閉液中封閉，一抗孵育過夜，清洗一抗，二抗孵育2 h，曝光檢測(cè)Cyt c表達(dá)量。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

將DLD1、HCT-116和FHC細(xì)胞用不同質(zhì)量濃度（0.00、0.10、0.25、0.40 mg/mL）的胡麻粕多酚處理。為了驗(yàn)證胡麻粕多酚是否通過誘導(dǎo)ROS的生成而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，采用NAC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理（向培養(yǎng)液中加入NAC使其終濃度達(dá)到6 mmol/L，再加入0.40 mg/mL胡麻粕多酚處理細(xì)胞）。將所有組別細(xì)胞培養(yǎng)48 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基漂洗3 次，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，用來表征ROS的生成量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)樣品至少進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件處理，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡麻粕多酚對(duì)DLD1、HCT-116和FHC細(xì)胞增殖的影響

如圖1A所示，低質(zhì)量濃度的胡麻粕多酚即對(duì)DLD1和HCT-116細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了抑制作用，隨著胡麻粕多酚質(zhì)量濃度的升高，抑制作用明顯增強(qiáng)，且呈濃度依賴性。胡麻粕多酚對(duì)于HCT-116和DLD1細(xì)胞的IC50分別為0.17 mg/mL和0.36 mg/mL。然而低質(zhì)量濃度的胡麻粕多酚對(duì)FHC細(xì)胞的增殖沒有明顯抑制作用，胡麻粕多酚對(duì)FHC細(xì)胞增殖的IC50為1.41 mg/mL。圖1B結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的胡麻粕多酚對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT-116的克隆形成都具有不同程度的抑制作用，且呈濃度依賴性，然而低質(zhì)量濃度時(shí)胡麻粕多酚對(duì)FHC細(xì)胞的克隆形成能力沒有明顯的抑制作用。

圖1 胡麻粕多酚對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig. 1 Effect of flax meal polyphenols on tumor cells proliferation

2.2 胡麻粕多酚對(duì)DLD1和HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是指為維持有機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡[15]。在細(xì)胞凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜特異性結(jié)合，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞膜變化。PI是一種核酸染料，能透過凋亡晚期和死細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此Annexin V和PI結(jié)合使用可以區(qū)分凋亡早、晚期的細(xì)胞及死細(xì)胞。如圖2所示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的胡麻粕多酚處理后，DLD1和HCT-116細(xì)胞都發(fā)生了不同程度的凋亡，且隨著胡麻粕多酚質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)。用0.25 mg/mL和0.40 mg/mL的胡麻粕多酚處理HCT-116細(xì)胞48 h后，其凋亡率（Q2+Q4）分別達(dá)到82.4%和84.4%，相比于0.00 mg/mL組具有明顯的凋亡現(xiàn)象。當(dāng)用0.25 mg/mL和0.40 mg/mL胡麻粕多酚處理DLD1細(xì)胞48 h后，其凋亡率分別達(dá)到54.1%和80.9%。以上數(shù)據(jù)顯示，胡麻粕多酚能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，且具有濃度依賴性。

圖2 胡麻粕多酚對(duì)HCT-116（A）和DLD1（B）細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of flax mea lpolyphenols on the apoptosis of HCT-116 (A) and DLD1 (B) cells

2.3 胡麻粕多酚對(duì)DLD1和HCT-116細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 胡麻粕多酚對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of flax meal polyphenols on the expression of apoptosisrelated proteins in colon cancer cells

圖3 結(jié)果顯示，胡麻粕多酚能夠促進(jìn)促凋亡因子Bax和Bak在DLD1和HCT-116細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；與0.00 mg/mL組相比，0.40 mg/mL胡麻粕多酚處理DLD1和HCT-116細(xì)胞后，胞內(nèi)的Bax表達(dá)量顯著升高，Bak的表達(dá)量升高但不顯著。與此同時(shí)，隨著胡麻粕多酚質(zhì)量濃度的升高，胞內(nèi)抑凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)受到明顯抑制。在胡麻粕多酚質(zhì)量濃度為0.40 mg/mL時(shí)，胞內(nèi)Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)。在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑中，Cyt c的釋放是關(guān)鍵。圖3結(jié)果顯示，胡麻粕多酚的刺激能夠引起線粒體內(nèi)Cyt c的釋放，從而使得胞漿內(nèi)Cyt c的表達(dá)量升高，且呈現(xiàn)濃度依賴性。綜上，胡麻粕多酚能夠通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

2.4 胡麻粕多酚對(duì)DLD1和HCT-116細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

DCFH-DA標(biāo)記DLD1、HCT-116和FHC細(xì)胞后，通過測(cè)定胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS生成量。如圖4A所示，用不同質(zhì)量濃度的胡麻粕多酚（0.00、0.10、0.25、0.40 mg/mL）處理DLD1、HCT-116細(xì)胞48 h后，其能濃度依賴性地誘導(dǎo)DLD1和HCT-116細(xì)胞產(chǎn)生ROS。經(jīng)0.4 mg/mL胡麻粕多酚處理后，DLD1和HCT-116細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別增加4.0 倍和5.5 倍。此外，研究顯示胡麻粕多酚處理對(duì)FHC細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生無明顯影響。經(jīng)0.40 mg/mL胡麻粕多酚處理后，F(xiàn)HC細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加約0.5 倍。由圖4B可知，相比于對(duì)照組，經(jīng)6 mmol/L NAC處理后DLD1、HCT-116和FHC細(xì)胞內(nèi)的ROS生成量沒有顯著變化。用NAC和0.40 mg/mL胡麻粕多酚聯(lián)合處理細(xì)胞48 h明顯逆轉(zhuǎn)了胡麻粕多酚增加DLD1和HCT-116細(xì)胞內(nèi)ROS水平的作用。圖4C顯示，NAC和胡麻粕多酚的聯(lián)合使用減弱了胡麻粕多酚對(duì)DLD1和HCT-116細(xì)胞增殖的抑制作用。綜上，胡麻粕多酚抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的活性依賴于誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。

圖4 胡麻粕多酚對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平及存活率的影響Fig. 4 Effect of flax meal polyphenols on intracellular ROS levels and survival rate of human colon cancer

3 討 論

本研究以大量種植的經(jīng)濟(jì)作物胡麻榨油后的副產(chǎn)物胡麻粕為研究材料。在農(nóng)業(yè)方面，胡麻粕目前主要被用作動(dòng)物飼料，生物利用率極低[16]。然而，胡麻粕中酚酸類物質(zhì)含量較高，具有極大的開發(fā)潛力[17]。本研究采用超聲提取法從胡麻粕中獲得胡麻粕多酚，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤作用。這為胡麻粕的生物學(xué)應(yīng)用開拓了廣闊的前景，深度開發(fā)后能夠極大提高胡麻粕的附加值及經(jīng)濟(jì)效益。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的結(jié)束細(xì)胞生命的過程，所以也常被稱為細(xì)胞編程死亡[18]。Caspases依賴性細(xì)胞凋亡途徑主要分為由死亡受體起始的外源途徑和由線粒體起始的內(nèi)源途徑[19-20]。在線粒體凋亡途徑中，Cyt c的釋放是關(guān)鍵，源于線粒體外膜通透性的改變[21-22]。本研究檢測(cè)了胡麻粕多酚對(duì)影響線粒體外膜通透性的Hcl-2蛋白家族促凋亡因子Bax、Bak，以及抑凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)水平的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)胡麻粕多酚促進(jìn)了Bax和Bak蛋白表達(dá)，抑制了Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)，同時(shí)胡麻粕多酚促進(jìn)Cyt c從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞胞漿，證明胡麻粕多酚促進(jìn)的細(xì)胞凋亡屬于線粒體凋亡途徑。

植物多酚一直以來都被認(rèn)為是抗氧化成分，具有清除氧自由基的能力[23-26]。值得注意的是，本研究結(jié)果表明，胡麻粕多酚能夠促進(jìn)ROS水平的升高，從而促進(jìn)腸癌細(xì)胞的線粒體凋亡，發(fā)揮腫瘤細(xì)胞抑制活性。有研究表明，酚類化合物既可以作為抗氧化劑，也可以發(fā)揮促氧化效應(yīng)，這取決于其作用濃度和細(xì)胞環(huán)境[27]。在各種類型的腫瘤細(xì)胞中，多酚的促氧化效應(yīng)與其促凋亡效應(yīng)有關(guān)。在高pH值和具有氧化還原活性的過渡金屬存在的情況下，酚類化合物可以作為促氧化劑[28]。許多惡性腫瘤細(xì)胞中銅離子濃度較高，而銅離子和多酚之間進(jìn)行氧化還原的循環(huán)體系可以產(chǎn)生ROS，促進(jìn)DNA斷裂以及細(xì)胞凋亡[10]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素、芹菜素和白藜蘆醇等植物多酚能夠抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)不同癌細(xì)胞凋亡，利用金屬螯合劑清除亞銅離子或者細(xì)胞內(nèi)ROS都能夠在很大程度上阻止多酚類物質(zhì)引起的細(xì)胞死亡[29]。因此，植物多酚與銅離子的這種調(diào)節(jié)機(jī)制解釋了多酚類化合物對(duì)癌細(xì)胞的特異性殺傷機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)胡麻粕多酚能夠在結(jié)腸癌細(xì)胞中同時(shí)發(fā)揮促氧化作用和促凋亡作用。因此，推測(cè)胡麻粕多酚是通過與細(xì)胞內(nèi)的金屬離子結(jié)合從而導(dǎo)致ROS水平升高，進(jìn)一步誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，相應(yīng)的機(jī)制研究將是下一步工作的重點(diǎn)。