劉 玲，李奇璋，周選圍，王玉亮

（上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240）

黑芝（Ganoderma atrum）屬于擔子菌亞門（Basidiomycota）層菌綱（Agaricomycetes）非褶菌目（Agaricomycetes）靈芝科（Ganodermataceae）真菌[1]。明朝的李時珍在《本草綱目》中記載并列舉了“青芝、赤芝、白芝、黃芝、黑芝、紫芝”6 種靈芝的藥用性能[2]。黑芝作為靈芝的一種，具有抗腫瘤[3-5]、抗氧化[6]、調節(jié)免疫[7-8]和抑菌[9]的功效。目前，對黑靈芝中的多糖[9-11]、靈芝酸[12-13]等活性成分的研究較深入，但對其生物活性蛋白功能的研究很少[3,14]。靈芝中的活性蛋白包括真菌免疫調節(jié)蛋白（fungal immunomodulatory protein，FIP）、凝集素、糖蛋白和酶等[15]。FIPs蛋白家族具有凝集血紅細胞[16]、刺激人外周血淋巴細胞[17]和小鼠脾細胞增殖[18]、促進細胞因子表達、增加細胞介素轉導[19]和抗腫瘤[20-22]等活性。

M1型巨噬細胞在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要的作用[23]。巨噬細胞的激活通常由多種機制介導，包括暴露于干擾素和白細胞介素（interleukin，IL）-2等細胞因子，或者接觸細菌、細菌產物和顆粒等[24]。巨噬細胞經典活化M1型表現為細胞增大、細胞質擴散、一氧化氮（nitric oxide，NO）產生量增加，細胞因子分泌增加，以及一些黏附分子和Fc受體的表達增加[25]等。巨噬細胞通過內吞、分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1、IL-6以及產生活性氧和NO來殺滅腫瘤細胞[26]。本研究擬通過觀察重組黑芝免疫調節(jié)蛋白（recombinant Ganoderma atrum immunomodulatory protein，rFIP-gat）在體外對小鼠巨噬細胞RAW264.7經典活化M1型的影響，探索rFIP-gat抗腫瘤作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7細胞 中科院上海生命科學研究院細胞庫。rFIP-gat為上海交通大學青蒿素研究實驗室利用酵母表達并純化所得。

HBSS（Hank's balanced salt solution）、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Hyclone公司；胎牛血清、質量分數0.05%胰蛋白酶（1∶250）、青霉素-鏈霉素雙抗 美國Gibco公司；中性紅溶液 生工生物工程股份有限公司；亞甲藍溶液（含質量分數1.25%戊二醛及0.6 g/mL亞甲藍的HBSS）、亞甲藍洗脫液（含體積分數50%乙醇、49%PBS、1%乙酸） 德國默克公司；戊二醛 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1G超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；5804R離心機 德國Eppendorf公司；HERA cell vios 160i二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司；CFX 384多通道熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；DMi1倒置顯微鏡 德國Leica微系統(tǒng)有限公司；Infinite M200 pro多功能酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及細胞毒性的測定

RAW264.7細胞以2.5×105個/mL、100 μL/孔接種在96 孔培養(yǎng)板中，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基為添加了體積分數10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基。分別用含終質量濃度0～100 μg/mL rFIP-gat或5 μg/mL伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）、1 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的培養(yǎng)基孵育24 h。除去培養(yǎng)基，PBS洗兩次，按50 μL/孔加入亞甲藍溶液，37 ℃孵育60 min。除去亞甲藍溶液，PBS洗5 次。除去PBS，按100 μL/孔加入亞甲藍洗脫液，平板旋轉器上室溫低速旋轉20 min后，于570 nm波長處檢測吸光度。以空白對照組（不添加rFIP-gat）細胞活力為100%，計算各組相對細胞活力。

1.3.2 細胞吞噬能力的測定

將RAW264.7細胞以2.5×105個/mL、100 μL/孔接種在96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用含1、2、4、8、16 μg/mL rFIP-gat或5 μg/mL ConA的培養(yǎng)基孵育24 h。除去培養(yǎng)基，PBS洗兩次，按100 μL/孔加入中性紅溶液（1 mg/mL），培養(yǎng)箱孵育30 min。除去中性紅溶液，PBS洗兩次，按100 μL/孔加入細胞裂解液，水平搖床振蕩30 min后，于540 nm波長處檢測吸光度，細胞吞噬能力與A540nm成正比。

1.3.3 NO濃度的測定

將RAW264.7細胞以2.5×105個/mL、100 μL/孔接種在96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用含20、40、60、80、100 μg/mL rFIP-gat或1 μg/mL LPS的培養(yǎng)基孵育24 h。按50 μL/孔取各孔中培養(yǎng)基于一個新的96 孔培養(yǎng)板中。預先將試劑盒中1 mol/L NaNO2標準品用細胞培養(yǎng)基稀釋成0、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L。按50 μL/孔將標準品加入96 孔培養(yǎng)板中。按50 μL/孔依次加入室溫Griess Reagent I和Griess Reagent II，混勻，540 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 RNA提取、反轉錄及實時熒光定量PCR測定

將RAW264.7細胞以2.5×105個/mL、1 mL/孔接種在12 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別用含1、2、4、8、16 μg/mL rFIP-gat或5 μg/mL ConA的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，用于檢測TNF-α?mRNA的表達量；分別用含0.5、5、50 μg/mL rFIP-gat或1 μg/mL LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，用于檢測rFIP-gat和LPS單獨干預時iNOS mRNA的表達量；分別用含10 μg/mL rFIP-gat、1 μg/mL LPS、10 μg/mL rFIP-gat+1 μg/mL LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，用于檢測rFIP-gat和LPS單獨及共同干預時iNOS mRNA的表達量。除去培養(yǎng)基，PBS洗兩次，裂解液裂解細胞用于總RNA提取。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用Nanodrop納米分光光度計測定RNA質量濃度和純度。RNA反轉錄后進行實時熒光定量PCR分析，以β-actin作為內參基因。引物設計見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qPCR

1.4 數據統(tǒng)計與分析

應用GraphPad Prism 7軟件進行數據處理與作圖，數據用平均值±標準差表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 rFIP-gat對RAW264.7細胞毒性的分析

圖1 rFIP-gat對RAW264.7細胞活力的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of rFIP-gat on viability of RAW264.7 cells

如圖1所示，rFIP-gat質量濃度在0～100 μg/mL范圍內對RAW264.7細胞沒有毒性，且能顯著促進其增殖；與空白對照組相比，rFIP-gat質量濃度為0.1 μg/mL時差異極顯著（P＜0.01）；質量濃度為1～100 μg/mL時差異高度顯著（P＜0.001）。

2.2 rFIP-gat對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

圖2 rFIP-gat對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of rFIP-gat on phagocytic ability of RAW264.7 cells

如圖2所示，不同質量濃度rFIP-gat處理后RAW264.7細胞吞噬能力均有所提高。與空白對照組相比，rFIP-gat質量濃度超過2 μg/mL時能夠極顯著提高RAW264.7細胞的吞噬能力（P＜0.01，P＜0.001）。

2.3 rFIP-gat對RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量及NO產生量的影響

圖3 rFIP-gat對RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量的影響Fig. 3 Effect of rFIP-gat on iNOS mRNA expression in RAW264.7 cells

如圖3所示，rFIP-gat質量濃度為0.5、5、50 μg/mL時，RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量與空白對照相比分別提高了0.76、5.05、136.45 倍，具有劑量依賴性。當rFIP-gat質量濃度超過5 μg/mL時，其能夠高度顯著提高RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量（P＜0.001）。rFIP-gat各質量濃度處理組RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量都遠低于1 μg/mL LPS處理組（其是空白對照組的1 360.64 倍）。

與空白對照組相比，10 μg/mL rFIP-gat單獨處理、10 μg/mL rFIP-gat與1 μg/mL LPS共同處理和1 μg/mL LPS單獨處理組RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量均高度顯著增加（P＜0.001）。10 μg/mL rFIP-gat單獨處理時，RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量是空白對照組的10.10 倍；10 μg/mL rFIP-gat與1 μg/mL LPS共同處理組和1 μg/mL LPS單獨處理組RAW264.7細胞iNOS mRNA表達量均是空白對照組的2 000 倍左右，且兩組之間無顯著性差異。

圖4 NO濃度標準曲線Fig. 4 Standard curve for nitrate concentration

圖5 rFIP-gat對RAW264.7細胞NO產生能力的影響Fig. 5 Effect of rFIP-gat on the production of NO in RAW264.7 cells

如圖4所示，經回歸處理，NO濃度和吸光度的回歸方程為y＝156.1x-8.488，R2＝0.999 5，在0～100 μg/mL范圍內線性關系良好。如圖5所示，在0～100 μg/mL范圍內，隨著rFIP-gat質量濃度的增加，NO的產生量逐漸提高。當rFIP-gat質量濃度超過80 μg/mL時，NO產生量顯著增加（P＜0.05，P＜0.001）?？梢?，在一定質量濃度范圍內，rFIP-gat對RAW264.7細胞NO產生量表現出劑量依賴性。

2.4 rFIP-gat對RAW264.7細胞TNF-α?mRNA表達量的影響

圖6 rFIP-gat對RAW264.7細胞TNF-α mRNA表達量的影響Fig. 6 Effect of rFIP-gat on TNF-α mRNA expression in RAW264.7 cells

如圖6所示，rFIP-gat質量濃度為1～16 μg/mL時，隨著其質量濃度的提高，RAW264.7細胞TNF-α mRNA表達量不斷增加，且與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.001）。5 μg/mL ConA組RAW264.7細胞TNF-α mRNA表達量是空白對照組的2.12 倍（P＜0.001）?？梢?，在一定質量濃度范圍內，rFIP-gat能顯著增加RAW264.7細胞TNF-α mRNA表達量，且具有劑量依賴性。

3 討 論

由于天然FIP含量低[16]，直接從真菌中提取FIP費時費力，限制了研究的進行。因此，本課題組前期利用基因工程的手段在酵母中表達FIP再進行提取純化，得到重組FIP并研究其功能。Cong Weiran[20]、Shu Yingli[22]等對FIP功能的研究也是利用此種方法。

在目前的研究中，FIP對腫瘤細胞有直接抑制和間接抑制兩種效應。Liao等[27]發(fā)現FIP-gts（一種從松杉靈芝中分離的FIP）可通過促進自然殺傷細胞和巨噬細胞活化顯著抑制人肺腺癌A549細胞的生長，從而調節(jié)其免疫功能，并預測其屬于間接效應。Cong Weiran等[20]發(fā)現rFIPs（rFIP-SN和rFIP-glu）可以通過延緩G1/S轉換直接抑制細胞周期進程，并促進人膠質母細胞瘤U-251 MG細胞凋亡；Shu Yingli等[22]發(fā)現在大腸桿菌中表達的rFIP-ppl（一種從鮭色波斯特孔菌中分離的FIP）對MGC823胃癌細胞具有顯著的生長抑制和凋亡誘導作用，并預測其屬于直接效應。

在前期的研究中發(fā)現，rFIP-gat可有效抑制MDAMB-231細胞從G1期向S期的轉變，其可能是通過促細胞凋亡導致腫瘤細胞死亡[3]。但rFIP-gat的免疫調節(jié)作用與其抗腫瘤作用的關系，特別是其對巨噬細胞的影響還鮮見報道。rFIP-gat是靈芝免疫調節(jié)蛋白家族的新成員。本研究中通過亞甲藍的毒性檢測表明，rFIP-gat在0～100 μg/mL的范圍內對RAW264.7細胞無毒性，因此本研究在此質量濃度范圍內開展rFIP-gat對RAW264.7細胞活化影響的研究。

巨噬細胞是機體內重要的非特異性免疫細胞，其活化后可以吞噬腫瘤細胞[28]，因此有助于消滅發(fā)病早期的腫瘤細胞[29]。吞噬功能是巨噬細胞的重要功能之一，也是其殺傷腫瘤細胞的重要手段。本研究通過中性紅吞噬實驗分析rFIP-gat對RAW264.7細胞吞噬能力的影響，結果表明，rFIP-gat對RAW264.7細胞吞噬能力有促進作用。當rFIP-gat質量濃度超過2 μg/mL時，能夠極顯著提高RAW264.7細胞的吞噬能力。NO是巨噬細胞活化后分泌的一種氣體分子，其作用有誘導腫瘤細胞凋亡、引起腫瘤細胞DNA損傷、抑制腫瘤細胞增殖等[26]。本實驗采用Griess法對細胞的NO產生量進行測定。結果顯示rFIP-gat單獨處理RAW264.7細胞時可促進RAW264.7細胞產生NO，且有劑量依賴性。這與iNOS mRNA的實時熒光定量PCR結果相一致。

TNF-α具有多種生物學功能，除了可以參與免疫調節(jié)，還可以誘導腫瘤細胞調亡[30]。實時熒光定量PCR結果表明，rFIP-gat可促進TNF-α和iNOS mRNA的轉錄且具有劑量依賴性。巨噬細胞活化時產生細胞因子TNF-α，同時，TNF-α通過綁定iNOS基因上游啟動子反應元件，引發(fā)iNOS基因的轉錄，從而誘導細胞產生大量NO[31]。

綜上，推測rFIP-gat可以誘導RAW264.7細胞向M1型分化，表現為大量釋放活性因子NO，上調TNF-α和iNOS mRNA的表達，增強RAW264.7細胞的吞噬作用，有利于巨噬細胞發(fā)揮抗腫瘤的作用。本實驗結果為進一步研究FIP通過巨噬細胞途徑發(fā)揮抗腫瘤作用提供依據。