王翠芳，王特日格樂，杜紅喜，張秀媛，丹 妮，薩如麗，敖長金

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

沙蔥（Allium mongolicum Regel）屬百合目、百合科、蔥屬類植物根莖組，是一種具有抗寒、抗旱、生命力較頑強的植物[1]。主要分布于我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)的荒漠草原和沙地。近年來，沙蔥及其提取物因具有消除羊肉中的膻味、提高機體免疫力、改善羊肉品質(zhì)等諸多優(yōu)點，常被作為天然綠色飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)羊業(yè)[2]。黃酮廣泛存在于植物中，從1938年Kumar等首次在桔皮中發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物以來，已有4 000余種黃酮類化合物被相繼發(fā)現(xiàn)，并成為學者們研究的熱點[3]。植物來源的黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[4]。本課題組前期研究表明，沙蔥黃酮是沙蔥重要的活性成分之一，具有抗菌[5]、改善綿羊瘤胃內(nèi)環(huán)境[6]、抗氧化[7]等多種功效。目前，關(guān)于沙蔥黃酮調(diào)節(jié)機體免疫及抗氧化方面的相關(guān)研究較多，但對其抗炎活性研究甚少。所以，本實驗應(yīng)用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導小鼠腹腔巨噬細胞建立炎癥模型，探討沙蔥總黃酮水洗組分對正常及LPS誘導過度激活的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應(yīng)的保護作用，以期為進一步研究沙蔥黃酮抗炎相關(guān)分子機制及其在動物生產(chǎn)中的實際應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級雄性C57BL/6小鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（蒙）2015-0001）。小鼠6 只/籠，于（20±1）℃、相對濕度（55±5）%及12 h晝夜交替的動物房中飼養(yǎng)，均自由采食和飲水。

沙蔥粉 阿拉善盟浩海生物科技有限公司。

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液 美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液 美國HyClone公司；胎牛血清 上海ExCell Bio公司；LPS（Escherichia coli O55∶B5） 美國Sigma公司；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基美國BD公司；CCK-8試劑盒 日本同仁化學研究所；NO測定試劑盒 美國Promega公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國BioLegend公司；總RNA小量制備試劑盒 美國Axygen公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒、Prime ScriptTMRT Reagent Kit 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國艾卡（IKA）儀器設(shè)備有限公司；Synergy HT型多功能酶標儀 美國Bio-Tek公司；生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機 美國Thermo Fisher公司；LightCycler?480實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀瑞士羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蔥總黃酮水洗組分的制備

沙蔥粉于室溫保存，依據(jù)本課題組前期報道的沙蔥總黃酮超聲波提取法的最佳提取工藝（體積分數(shù)75%乙醇溶液、料液比1∶30、提取溫度40 ℃、提取時間15 min）制備沙蔥總黃酮，其主要成分有3',4'-環(huán)氧基-7-O-5甲氧基黃酮醇、7-O-5,4'-二甲氧基-3'-羥基黃酮、金合歡素、蘆丁、異槲皮苷及木犀草素-5'-O-糖葡萄糖-4-羥基苯丙酸，以蒸餾水為流動相，采用聚酰胺柱層析法對沙蔥總黃酮進行分離純化，于真空冷凍干燥得到沙蔥總黃酮水洗組分（water eluate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel，wAMF）[5]。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細胞的制備及培養(yǎng)

依據(jù)文獻[8-10]所報道的方法對小鼠腹腔巨噬細胞進行分離、提取及純化，將獲得的小鼠腹腔巨噬細胞置于含質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的完全培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)研究。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力

應(yīng)用CCK-8法檢測沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力的影響，篩選有效且安全的沙蔥總黃酮水洗組分質(zhì)量濃度。調(diào)整細胞濃度，按4×104cells/孔將細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 h進行貼壁，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，將細胞分為對照組（添加含終質(zhì)量分數(shù)0.1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的完全培養(yǎng)基）[11-12]、不同質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分處理組（添加含有終質(zhì)量濃度50、100、200、400、800 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分的完全培養(yǎng)基），以無細胞只添加完全培養(yǎng)基為空白，于5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去各孔培養(yǎng)基，加入含有質(zhì)量分數(shù)10% CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基，孵育2 h，應(yīng)用全自動酶標儀檢測450 nm波長處各孔的OD值，記為OD450nm。細胞增殖活力按下式計算。

1.3.4 實驗分組

基于1.3.3節(jié)篩選出的沙蔥總黃酮水洗組分安全質(zhì)量濃度，將細胞分為空白對照組（添加含終質(zhì)量分數(shù)0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基）、LPS應(yīng)激模型組（1 μg/mL LPS）及不同質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理組（各組先加入100、200、400 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分預處理細胞1 h，培養(yǎng)結(jié)束后，各組再分別添加終質(zhì)量濃度為1 μg/mL LPS共同培養(yǎng)細胞），各組加入LPS后的處理時間根據(jù)后續(xù)不同實驗所需時間進行調(diào)整。

1.3.5 Griess法檢測小鼠腹腔巨噬細胞NO的生成量

實驗分組同1.3.4節(jié)，細胞經(jīng)各質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分處理1 h后，繼續(xù)與LPS共同處理24 h，收集各處理組培養(yǎng)上清液。向待測培養(yǎng)上清液中加入等體積的Griess A（1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）磺胺、5%磷酸）及Griess B（N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽）試劑進行室溫避光孵育，測定各孔520 nm波長處吸光度，根據(jù)繪制的標準曲線計算各處理組NO濃度。

1.3.6 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的生成量

實驗分組同1.3.4節(jié)，各質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理細胞1 h后，繼續(xù)與LPS共同處理24 h，12 000×g、4 ℃離心15 min，收集細胞培養(yǎng)上清液，依據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測各處理組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的質(zhì)量濃度。

1.3.7 反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR法檢測iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MyD88、NF-κB mRNA的表達水平

實驗分組同1.3.4節(jié)，各質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理細胞1 h后，繼續(xù)與LPS共同處理4 h。根據(jù)總RNA小量制備試劑盒說明書對收集的細胞進行細胞內(nèi)總RNA的提取，對所獲得的RNA溶液進行純度及質(zhì)量濃度的檢測。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃、15 min；85 ℃、5 s。以β-actin為內(nèi)參基因，按擴增試劑盒說明書對待測基因的mRNA表達量進行檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 20 s。采用2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量，ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ctβ-actin）實驗組-（Ct目的基因-Ctβ-actin）空白對照組。引物信息見表1[13-15]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析并作圖，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey's Test，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力的影響

圖1 沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力的影響Fig. 1 Effect of wAMF on cell viability of mouse peritoneal macrophages

如圖1所示，各質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分處理小鼠腹腔巨噬細胞24 h后，小鼠腹腔巨噬細胞增殖活力與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），即沙蔥總黃酮水洗組分質(zhì)量濃度在50～800 μg/mL時對小鼠腹腔巨噬細胞無細胞毒性作用，選用100、200、400 μg/mL進行后續(xù)實驗。

2.2 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞NO濃度和iNOS mRNA表達量的影響

NO作為一種重要的炎性介質(zhì)，其濃度是評價炎癥反應(yīng)程度的重要指標，而iNOS作為NO的限速酶，與NO的合成密切相關(guān)。圖2顯示，與未受LPS誘導的空白對照組相比，1 μg/mL LPS可高度顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞中NO濃度及iNOS mRNA的表達量（P＜0.001）。而與LPS應(yīng)激模型組相比，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分（100～400 μg/mL）預處理的細胞均呈劑量依賴性地高度顯著降低NO的生成及iNOS mRNA的表達（P＜0.001），且在400 μg/mL時對NO的抑制率為74.2%。

圖2 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞NO生成及iNOS mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of wAMF on NO production and iNOS mRNA expression in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

2.3 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞相關(guān)炎性細胞因子質(zhì)量濃度及其mRNA表達量的影響

圖3 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞相關(guān)炎性細胞因子質(zhì)量濃度及其mRNA表達量的影響Fig. 3 Effect of wAMF on inflammatory cytokine production and gene expression in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖3 A、C、E、G顯示，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激模型組可高度顯著提高TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的質(zhì)量濃度（P＜0.001），表明炎癥模型建立成功。與LPS應(yīng)激模型組相比，添加不同質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分組均可不同程度地抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌（P＜0.01或P＜0.001），對3 種促炎性細胞因子的最大抑制率分別為61.8%、29.6%及62.5%；同時高度顯著提高抗炎性細胞因子IL-10的質(zhì)量濃度（P＜0.001），且呈劑量依賴效應(yīng)，最大提高率為170.4%。

為進一步明確沙蔥總黃酮水洗組分對TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的調(diào)節(jié)作用，通過反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測了其mRNA表達量的變化。圖3B、D、F、H顯示，沙蔥總黃酮水洗組分在100～400 μg/mL范圍內(nèi)均可顯著或極顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達，提高IL-10 mRNA的表達，表明沙蔥總黃酮水洗組分對炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 mRNA表達量的調(diào)節(jié)作用與其對TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10 4 種炎性因子分泌水平的調(diào)節(jié)作用基本一致。

2.4 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中MyD88及NF-κB mRNA表達量的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，LPS應(yīng)激模型組小鼠細胞中MyD88及NF-κB?mRNA的表達量高度顯著升高（P＜0.001）；與LPS應(yīng)激模型組相比，小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度沙蔥總黃酮水洗組分預處理1 h后，可極顯著降低MyD88及NF-κB mRNA表達水平（P＜0.01或P＜0.001），且400 μg/mL時對NF-κB的抑制效果最佳。

圖4 沙蔥總黃酮水洗組分對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中MyD88（A）及NF-κB（B）mRNA表達量的影響Fig. 4 Effect of wAMF on MyD88 (A) and NF-κB (B) mRNA expression in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

3 討 論

炎癥是一種由物理因素（如溫度、放射性物質(zhì)及機械損傷）、化學因素（如強酸、強堿及內(nèi)源性毒性物質(zhì)的分解產(chǎn)物）或生物因素（如細菌、毒素）在一定條件下刺激觸發(fā)的適應(yīng)性反應(yīng)[16]。在正常情況下，適宜的炎癥反應(yīng)有利于宿主抵御病原體和傷口愈合，從而保護機體免受傷害和感染。巨噬細胞在炎癥反應(yīng)過程中通過調(diào)節(jié)保護反應(yīng)起著核心作用，當細菌等外來物質(zhì)侵入機體時，其會釋放炎癥介質(zhì)來預防有害刺激；但過度的炎癥反應(yīng)會導致組織損傷，并出現(xiàn)動脈粥樣硬化、肥胖、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及糖尿病等多種疾病[17]。所以，阻斷或延緩炎癥反應(yīng)可治療或預防由炎癥引起的機體損傷。

細胞的增殖活性是機體的重要生命特征，也是體現(xiàn)細胞活力的重要指標。CCK-8法是一種無放射性、高靈敏度、簡便、高效檢測細胞毒性和增殖活力的方法。熊建文等[18]研究指出CCK-8法具有步驟少、重復性好等優(yōu)點，能夠準確反映出細胞的增殖活性。本實驗通過CCK-8法檢測了沙蔥總黃酮水洗組分對小鼠腹腔巨噬細胞的潛在細胞毒性，結(jié)果顯示，沙蔥總黃酮水洗組分質(zhì)量濃度在50～800 μg/mL時對小鼠腹腔巨噬細胞均沒有細胞毒性作用，表明實驗用沙蔥總黃酮水洗組分的質(zhì)量濃度對小鼠腹腔巨噬細胞是安全無毒的。

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成成分，又名內(nèi)毒素，是引起機體炎癥損傷的重要致病因子，可激活巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6、NO等多種促炎介質(zhì)，并增加炎癥損傷的程度。TNF-α是一種多功能的細胞因子，在炎癥的發(fā)生與發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，可增強巨噬細胞的敏感性，激活中性粒細胞和淋巴細胞，促進其他炎性細胞因子的合成與釋放[19-20]；IL-6可由多種免疫細胞產(chǎn)生，參與、調(diào)節(jié)絕大多數(shù)由炎癥引起的急性期蛋白誘發(fā)機體產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)[21]；IL-1β作為促炎性細胞因子可在炎癥初期大量產(chǎn)生，并促進炎癥反應(yīng)進程，引起多種炎癥性疾病[22]。所以，由LPS誘導引發(fā)的對機體的炎癥損傷遠大于其對機體的直接毒性。在養(yǎng)殖業(yè)中，內(nèi)毒素感染導致的動物死亡給養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，中和、抑制LPS誘導產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)及細胞因子成為預防與治療炎癥損傷的主要思路和方法之一。

本研究結(jié)果表明，小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后，可顯著提高炎性介質(zhì)的質(zhì)量濃度。細胞經(jīng)沙蔥總黃酮水洗組分預處理后，可呈劑量依賴性地極顯著抑制由LPS誘導的TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，同時抑制相關(guān)炎性細胞因子mRNA表達量，表明沙蔥總黃酮水洗組分通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄水平來抑制炎癥的發(fā)生。NO為重要的炎癥介質(zhì)，在細胞中由iNOS催化L-精氨酸產(chǎn)生，在各種生理和病理條件下廣泛存在于機體內(nèi)，過量的NO會導致細胞死亡，破壞組織穩(wěn)態(tài)[23-24]。沙蔥總黃酮水洗組分可高度顯著抑制LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞中iNOS mRNA的表達和NO的產(chǎn)生，表明沙蔥總黃酮水洗組分通過抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞iNOS的活性抑制炎性介質(zhì)NO的生成。IL-10作為另一種重要的細胞因子，其主要的生物學功能是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度和炎癥的持續(xù)時間，并選擇性地阻斷促炎性細胞因子及趨化因子的表達[25]。因此，誘導IL-10可被認為是內(nèi)毒素損害機體期間內(nèi)源性宿主保護機制的一部分。本研究結(jié)果表明，與LPS應(yīng)激模型組相比，添加100～400 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分能夠高度顯著提高抑炎細胞因子IL-10的質(zhì)量濃度及其mRNA表達水平，并呈濃度依賴性。

細胞表面存在一類模式識別受體，如Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs），被LPS激活后與連接蛋白MyD88銜接，進一步活化下游重要的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，使其實現(xiàn)從細胞質(zhì)到細胞核的核移位，引發(fā)如TNF-α、IL-1β、IL-6、NO等炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生，進而造成機體炎性損傷[26]。所以，長期以來與NF-κB信號通路相關(guān)的關(guān)鍵分子被認為是許多抗炎藥物的主要靶點。本研究結(jié)果表明，小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)質(zhì)量濃度100～400 μg/mL沙蔥總黃酮水洗組分處理后，可極顯著降低由LPS誘導的MyD88和NF-κB mRNA的表達，且在400 μg/mL時效果更好。提示沙蔥總黃酮水洗組分的抗炎活性可能與NF-κB信號通路有關(guān)，但是具體的作用機制還有待進一步研究。

目前，天然健康產(chǎn)品或其次級代謝產(chǎn)物已被用于治療和預防許多炎癥性疾病，且可以強烈抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的分泌，這可能歸因于提取物對NF-κB活性的影響[27]。一些研究表明，自然抑制劑通過抑制炎癥介質(zhì)進而抑制NF-κB，從而可明顯改善內(nèi)毒素誘導的膿毒癥[28]。近年來，越來越多的研究報道了黃酮類化合物對機體的抗炎作用及其機制，如抑制與類花生酸合成相關(guān)酶的產(chǎn)生及其本身存在的抗氧化活性；但有研究表明，一些黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)促炎分子的產(chǎn)生導致炎癥反應(yīng)的減弱[29]。有報道指出，異槲皮苷可通過調(diào)控NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制TNF-α、IL-6及iNOS等促炎介質(zhì)的分泌，減輕由LPS誘導的心臟功能障礙，從而作為治療膿毒癥引起的心臟功能障礙的潛在藥物[30]。Liu Lin等發(fā)現(xiàn)金合歡素對關(guān)節(jié)炎具有緩解作用，可預防病變，降低促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[31]。Elnur等的研究結(jié)果表明，由Inula montana L.中提取出的含有木樨草素等黃酮類化合物的復合成分可降低由LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中NO等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮較強的抗炎活性[32]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，表明沙蔥總黃酮水洗組分具有良好的抗炎活性。

綜上所述，沙蔥總黃酮水洗組分通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)及細胞因子的分泌體現(xiàn)其體外抗炎活性，其作用機制可能與NF-κB信號通路有關(guān)。