周 娟， 熊 偉， 尹云玉， 修光輝， 孫 潔， 凌 斌

昆明醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，昆明650032

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，不僅能促進損傷組織的再生修復，還具有一定的抗炎及免疫抑制作用。然而，移植后的MSC存活數(shù)量有限，存活期短，定向分化為受損細胞起到直接修復作用的能力非常有限。而間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(mesenchymal stem cell derivrd exosomes，MSC-Exo)通過攜帶各種生物活性因子(mRNA、microRNA、細胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)因子等)，調(diào)節(jié)免疫細胞表型、功能和歸巢，抑制炎癥，對促進損傷組織修復起主要作用[1]。目前，MSC-Exo作為無細胞療法逐步替代MSC，被廣泛用于治療各種自身免疫性及炎癥性疾病，如：系統(tǒng)性硬化癥[2]、自身免疫性肝炎[3]、炎癥性腸病[4]、類風濕關節(jié)炎[5]、骨關節(jié)炎[6]、膿毒癥[7]等。但是MSC-Exo抗炎免疫調(diào)節(jié)機制還不完全清楚，本文就近5年有關MSC-Exo抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的基礎及臨床研究做一綜述。

1 外泌體的概念與生物學特性

外泌體(exosomes)是一種細胞內(nèi)吞來源的直徑在30～100 nm之間的細胞外囊泡。于1983年首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)[8]，起初僅被看作是細胞清除代謝廢物的手段未被重視，直到20世紀90年代末，研究發(fā)現(xiàn)外泌體可能是細胞間通訊的重要介質(zhì)，才重新激起人們對外泌體研究的興趣。外泌體細胞來源廣泛，如：腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、免疫細胞、肥大細胞、血小板以及干細胞等。外泌體攜帶與細胞來源相關的多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞參與細胞活動的重要調(diào)控[9]。幾乎所有外泌體都含有參與膜轉(zhuǎn)運和融合的蛋白質(zhì)(如Rab GTPases、flotillin、膜聯(lián)蛋白)、參與多泡體生物合成的蛋白(如Alix、TSG101)、熱休克蛋白(如HSP60、HSP70、HSP90)、四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81和CD82)等[10]。

2 MSC-Exo的生物學功能

MSC不同于其他細胞的特殊之處即具有強大的自我復制功能和多向分化潛能，具有低免疫源性和免疫調(diào)節(jié)特性，被越來越多地應用于自身免疫病動物及臨床實驗中[11]。MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的具體機制還不是特別清楚，目前的觀點：MSC通過旁分泌細胞因子，在細胞膜上表達連接蛋白Fas配體，與細胞直接接觸導致活化的T細胞凋亡，誘導受體細胞免疫耐受以及改善自身免疫細胞表型而發(fā)揮作用[12-13]。

由于應用MSC存在很多不可忽視的問題，如生物安全問題、長期保存與運輸問題、非治療目的分化等[14]?；谝陨县酱鉀Q的問題，尋找替代干細胞的治療途徑顯得尤為重要。最近幾年研究人員把注意力轉(zhuǎn)向一種特殊的旁分泌機制——外泌體[15]。相關研究顯示，MSC-Exo具有源細胞的生物學特性、選擇性組裝、靶向性投遞、高效修復受損組織、安全性高、化學性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存等優(yōu)點，作為運載MSC多種分泌產(chǎn)物的載體參與了MSC與損傷細胞之間的細胞通訊，起到關鍵信使的作用[16]。外泌體攜帶的酶以及化學物質(zhì)可長期不被降解，無潛在毒性；PBS重懸后可于-80℃保存6個月，且生物化學活性不受影響，用于治療疾病具有一定的安全性[17]。

MSC-Exo電鏡下呈橢圓或碟狀的囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/mL[18]。MSC-Exo內(nèi)含多種蛋白質(zhì)成分、MSC膜脂質(zhì)成分，能與親脂性染料PKH26結(jié)合，并表達MSC表面粘附特異性分子CD44、CD29、CD105及外泌體相關蛋白質(zhì)，如CD9、CD63、CD81、Alix等[18-19]。應用Western blot法和流式細胞術檢測外泌體表面蛋白標志物和特異性蛋白標志物可鑒定外泌體。目前，MSC-Exo主要通過超速離心法、超濾法、密度梯度離心法、免疫磁珠法、色譜法及試劑盒法等方法分離并提純[20-21]。超速離心法是目前外泌體分離的“金標準”，由于其提取的外泌體形態(tài)均勻，蛋白濃度高，并且純度相對較高，不存在未知的潛在雜質(zhì)污染，可以大量的提取，滿足實驗的基本需求，利于后續(xù)的實驗研究，并且基于不同來源MSC-Exo的生物學特點，發(fā)明了各種不同改良方式，在實際工作中已被廣泛運用。

雖然MSC來源不同(如來源于骨髓、脂肪、胎盤、臍帶等)，可將MSC-Exo進一步分為更多的亞類，但是它們所分泌的外泌體具有共同的特性。MSC-Exo通過攜帶不同的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA(包括lncRNA、microRNA、siRNA、mRNA等)，將囊泡內(nèi)的生物學活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移至靶細胞，參與體內(nèi)多種生物學活動，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗細胞凋亡以及促進細胞再生等[22]。

3 抗炎免疫調(diào)節(jié)功能

3.1 減輕炎癥反應

炎癥反應是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，在炎癥過程中損傷因子的釋放造成組織和細胞的破壞，MSC-Exo通過攜帶各種抗炎相關細胞因子，發(fā)揮抗炎效應。研究表明，MSC-Exo可抑制TLR4-MyD88-NF-κB途徑，降低炎癥微環(huán)境中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12水平，升高抗炎因子IL-10、TGF-β水平[23]，改善心肌梗死、急性肺損傷、膿毒癥等疾病的預后。炎癥及缺血微環(huán)境加劇急性心肌梗死進程，血管生成在組織修復中起至關重要的作用，Teng等[24]研究發(fā)現(xiàn)，局部注射骨髓MSC-Exo，能明顯降低梗死心肌的炎癥細胞浸潤及促進新生血管形成，恢復血流，改善心功能。人脂肪MSC-Exo通過攜帶高表達的miR-125a，促進內(nèi)皮細胞血管生成[25]。脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的炎癥反應通過NF-κB途徑誘導A1型神經(jīng)毒性星形膠質(zhì)細胞活化是加劇脊髓損害的關鍵，將骨髓MSC-Exo與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，可明顯降低A1型毒性星形膠質(zhì)細胞比例，靜脈注射骨髓MSC-Exo，病灶中A1型星形膠質(zhì)細胞比例及P65陽性細胞核比例明顯降低，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達明顯減少，而髓鞘堿性蛋白(MBP)，突觸素(Syn)和神經(jīng)元核(NeuN)表達則明顯升高[26]。MSC-Exo的抗炎作用在Cosenza等[6]研究的小鼠骨關節(jié)炎模型實驗中進一步被證實，實驗結(jié)果顯示，TGF-β3預處理的骨髓MSC-Exo有明顯的軟骨保護作用，可明顯升高TGF-β3預處理的軟骨細胞合成代謝標記基因ACAN、COL1、COL2B表達，降低分解代謝、炎癥標記基因MMP-13、ADAMTS5、iNOS表達。miR-146a是眾所周知的具有抗炎作用的microRNA，在MSC-Exo中高表達，調(diào)節(jié)靶組織IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1和CCL-5等炎癥因子水平[27]。IL-1β預處理人臍帶MSC，可明顯上調(diào)外泌體中的miR-146a表達，降低外周血促炎因子IL-6、TNF-α表達，上調(diào)抗炎因子IL-10表達，改善肝臟、肺臟、腎臟的炎性損傷，降低膿毒癥小鼠的死亡率[27]。骨髓MSC-Exo還高表達miR-223，傳遞到受損心肌，下調(diào)Sema3A和STAT3表達，降低心肌組織炎癥因子水平，減輕膿毒癥心肌損傷[7]。人臍帶MSC-Exo通過抑制STAT3信號通路，使肺內(nèi)miR-17表達上調(diào)，miR-204表達下調(diào)，降低促炎因子單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)和缺氧誘導的有絲分裂因子水平，抑制血管重塑和低氧性肺動脈高壓[28]。另外，將人臍帶MSC-Exo注入炎癥性腸病(IBD)小鼠體內(nèi)，小鼠結(jié)腸組織和脾臟中IL-10、TGF-β基因表達增加，IFN-γ、TNF-α、IL-1β，IL-6、iNOS和IL-7基因表達降低，炎癥性腸病嚴重程度明顯降低[4，29]。

3.2 調(diào)節(jié)巨噬細胞表型及功能

在許多炎性疾病中，MSC-Exo有明顯的抑制巨噬細胞活化的作用，誘導促炎表型M1向抗炎表型M2的轉(zhuǎn)換。在心肌梗死模型中，骨髓MSC-Exo可通過激活NF-κB及AKT1/AKT2途徑促進巨噬細胞M2極化，表現(xiàn)為CD11b、iNOS表達降低，CD206、ArgI表達升高，減輕梗死后炎癥及心肌細胞凋亡[30]。Deng等[31]又發(fā)現(xiàn)，人脂肪MSC-Exo可通過激活S1P/SK1/S1PR1途徑促進巨噬細胞M2極化，減少缺氧誘導的H9c2細胞凋亡及TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞纖維化，改善心肌梗死后的心臟纖維化和炎癥反應。動脈粥樣硬化是脈管系統(tǒng)的慢性炎性疾病，Li等[32]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射的骨髓MSC-Exo，可定向遷移到動脈粥樣硬化斑塊并選擇性地在巨噬細胞附近聚集，通過miR-let7/IGF2BP1/PTEN途徑大大減少巨噬細胞在斑塊中的浸潤，并且通過miR-let7/HMGA2/NF-kB途徑促進巨噬細胞向M2極化，減少動脈粥樣硬化斑塊面積。肺泡巨噬細胞和浸潤的單核細胞在肺部炎癥和纖維化的進展中起著關鍵作用，Mansouri等[33]發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-Exo可使單核細胞向免疫抑制及抗炎表型轉(zhuǎn)化，對肺泡細胞進行分析，骨髓MSC-Exo可升高肺纖維化小鼠肺泡總巨噬細胞(CD45+CD11b-CD11c+CD64+)比例和非經(jīng)典單核細胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR-2-Ly6clo)比例，降低促炎經(jīng)典單核細胞(CD45+CD11b+MHCⅡ-CD64lo/intCCR-2+Ly-6chi)比例。有趣的是，在骨髓細胞分析中也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果，注射骨髓MSC-Exo預處理的骨髓來源的單核細胞也可明顯改善肺纖維化的膠原沉積及炎癥反應，使LPS誘導的脾源性F4/80+巨噬細胞低表達CD86、MHCⅡ及CD40，TNF-α釋放減少，IL-10釋放增加。IL-1β預處理的臍帶MSC，可明顯上調(diào)外泌體中的miR-146a，與巨噬細胞共培養(yǎng)后導致巨噬細胞M2極化，有效增強MSC的免疫調(diào)節(jié)特性[34]。在高氧誘導的支氣管肺發(fā)育異常新生小鼠中，MSC-Exo同樣可以調(diào)節(jié)巨噬細胞M2極化，改善高氧誘導的炎癥及免疫異常[35]。此外，骨髓MSC-Exo還可使結(jié)腸炎模型小鼠巨噬細胞向M2極化，并使巨噬細胞進入結(jié)腸組織減少，維持屏障完整性，減輕結(jié)腸組織炎癥反應[36]。

3.3 調(diào)節(jié)T細胞、B細胞功能

MSC-Exo可通過攜帶各種免疫調(diào)節(jié)因子(細胞因子、趨化因子和生長因子等)，影響B(tài)細胞、T細胞的活動，刺激血管生成，防止細胞凋亡，阻止氧化反應，調(diào)節(jié)炎癥進程[37]。Matula等[38]在研究人脂肪間充質(zhì)干細胞(AD-MSC)與T淋巴細胞的膜轉(zhuǎn)運機制時發(fā)現(xiàn)，通過T細胞的納米通道介導，AD-MSC摻入大量T細胞膜成分，繼而分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)作用的外泌體。Chen等[39]在研究骨髓MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)特性時發(fā)現(xiàn)，將骨髓MSC-Exo與外周血單個核細胞(PBMCs)共培養(yǎng)，可誘導輔助Th1細胞向Th2轉(zhuǎn)化，外周血Th17細胞比例降低，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)及CD3+T細胞比例增加。MSC-Exo通過FasL誘導T細胞凋亡，或活化PD-1通路抑制T細胞活化，導致免疫耐受，介導CD4+T細胞轉(zhuǎn)化為Treg細胞[40-41]。MSC-Exo使Th1細胞IFN-γ分泌降低，IL-4分泌增加，Th17細胞IL-17和IL-22分泌降低，IL-10的分泌提高，提示MSC-Exo調(diào)節(jié)免疫應答的復雜性和可塑性。Cosenza等[5]在研究MSC-Exo對類風濕關節(jié)炎及骨關炎模型的軟骨保護作用時，發(fā)現(xiàn)MSC-Exo有明顯的免疫抑制作用，將MSC-Exo分別和脾細胞分離的T淋巴細胞、B淋巴細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC-Exo以劑量依賴性方式抑制T淋巴細胞增殖，并降低CD8+IFN-γ+、CD4+IFN-γ+T淋巴亞群百分比，增加CD4+IL-10+Th1調(diào)節(jié)細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比；降低與B淋巴細胞共培養(yǎng)上清液中總IgG水平，抑制B細胞分化為漿細胞，培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高，這種免疫抑制作用與MSC-Exo高表達TGF-β1、PGE2及IL-1RA有關。MSC-Exo具有抗原特異性的抗炎反應，在MSC-Exo處理的小鼠類風濕關節(jié)炎模型中，觀察到免疫細胞Th1型向Th2型的轉(zhuǎn)變，淋巴結(jié)中CD19+IL-10+Breg細胞亞群明顯增加，IL-6、IL-1β水平降低。MSC-Exo抑制B細胞的增殖和向分泌免疫球蛋白的漿細胞的分化，外泌體中的CCL2直接抑制漿細胞分泌免疫球蛋白抗體[42]。為了評估MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)作用，在體外將骨髓MSC-Exo與外周血單個核細胞共培養(yǎng)，T細胞增殖率下降了1.65%，抑制作用與外泌體的量呈正相關，研究結(jié)果還顯示人臍帶MSC-Exo有更強的抑制作用[43]。Rahman等[44]研究發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-Exo可攜帶高通量的miR-375，抑制PBMC的增殖，減輕1型糖尿病胰島細胞移植免疫排斥反應，增強Treg細胞的功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

3.4 調(diào)節(jié)樹突狀細胞表型及自然殺傷細胞的增殖

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)在免疫系統(tǒng)中起前哨作用，通過捕獲受傷上皮的抗原被激活，活化的DC遷移至引流淋巴結(jié)，將抗原信息傳遞至T淋巴細胞，使T細胞活化，啟動免疫應答，CD4+T和CD8+T細胞進一步分泌細胞因子或直接殺傷。Harrell等[45]在研究慢性氣道炎癥所致慢性阻塞性肺病(COPD)小鼠模型及臨床樣本時發(fā)現(xiàn)，運用生物工程產(chǎn)品“外泌體來源的多個同種異體蛋白”(exosome-derived multiple allogeneic protein paracrine signaling，Exo-d-MAPPS)處理小鼠可影響DC的遷移及抗原提呈特性，使具有免疫原性的成熟DC轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖吣褪苄虳C，DC表達CD80減少，分泌IL-12減少，分泌IL-10增加，進而影響CD4+Th1、CD4+Th17，CD8+CTL細胞的激活。另外，Exo-d-MAPPS還促進免疫抑制性IL-10產(chǎn)生，調(diào)節(jié)CD4+FoxP3+T細胞(Treg)增殖，從而減輕慢性氣道炎癥。和動物模型中觀察到的類似，Exo-d-MAPPS治療顯著改善了COPD患者的肺部狀況和生活質(zhì)量。自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)在固有免疫和適應性免疫中起紐帶作用，參與抗感染免疫、腫瘤排斥、自身免疫疾病的發(fā)病機制以及抑制耐受的維持。Ko等[46]在研究外泌體的抗腫瘤免疫機制時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，脂肪MSC-Exo處理肝癌模型大鼠后循環(huán)NKT細胞的百分比顯著升高，此外，免疫組織化學檢測也表明，腫瘤內(nèi)CD8α+NKT細胞數(shù)量明顯高于對照組，提示脂肪MSC-Exo可通過NKT細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明，帶有NKG2D配體的MSC-Exo能抑制NK細胞的毒活性，減少NK細胞及NKT細胞中炎性細胞因子(包括TNF-α、IL-1β、INF-γ、IL-17)產(chǎn)生[47]。胚胎肝MSC-Exo通過攜帶潛伏期相關肽(LAP)、TGF-β和血小板反應蛋白1(TSP1)，在NK細胞中誘導下游TGF-β/Smad2/3信號傳導，抑制NK細胞的增殖、活化和細胞毒性[48]。骨髓MSC-Exo也可通過調(diào)節(jié)NK細胞，促進缺血后神經(jīng)恢復和大腦重塑[49]。

4 展望

越來越多的證據(jù)表明，基于MSC的免疫抑制機制主要歸因于MSC分泌的外泌體。MSC-Exo富含源自MSC的生物活性分子(mRNA、microRNA、細胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)因子等)發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫細胞表型、功能及歸巢的作用[22]。本文我們著重介紹了有關MSC-Exo在減輕自身免疫和炎性疾病方面的治療作用及分子機制的最新認識。目前研究顯示，局部和全身施用MSC-Exo均可有效抑制炎癥組織中有害的免疫反應，并促進受損實質(zhì)細胞的存活和再生。MSC-Exo的抗炎作用依賴于炎癥免疫細胞中免疫調(diào)節(jié)性miRNA和免疫調(diào)節(jié)蛋白的傳遞，使M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化為免疫抑制性M2型巨噬細胞，DC向免疫耐受型轉(zhuǎn)換，淋巴細胞Th1型向Th2型的轉(zhuǎn)變以及產(chǎn)生更多的Treg細胞。外泌體有可能取代細胞療法，緩解從血液、組織或骨髓獲得干細胞移植治療的壓力，以MSC-Exo裝載藥物或基因治療內(nèi)容物可能最終會成為精確靶向治療的工具[50]。但是，關于MSC-Exo產(chǎn)生和修飾以及外泌體質(zhì)量和功能仍然需要我們更深入的了解，而且不同來源的MSC-Exo在傳遞可能增加或限制疾病的信號中的作用也需要更清楚的認識。為了進一步闡明MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)機制，需要利用蛋白質(zhì)組學和高通量測序細化外泌體遞送蛋白質(zhì)及RNA種類及功能，進一步探索外泌體和細胞外囊泡之間免疫調(diào)節(jié)能力的差異。此外，MSC-Exo在進入臨床應用之前還需要實施嚴格的標準化程序和有效的效價測定。