王海洋 董軍

高級(jí)別膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，具有廣泛性浸潤(rùn)生長(zhǎng)、強(qiáng)大的新生血管形成能力和對(duì)現(xiàn)有治療方法高耐受等生物學(xué)特點(diǎn)，患者生存期短、預(yù)后不良［1?2］。目前，針對(duì)膠質(zhì)瘤的規(guī)范化治療方案（手術(shù)最大限度安全切除腫瘤輔以術(shù)后同步放化療或輔助化療），以及在體部惡性腫瘤治療中已取得顯著療效的的分子靶向治療、免疫治療、腫瘤治療電場(chǎng)（TTF）等方法僅能在有限程度上緩解病情，對(duì)總生存率并無(wú)明顯改善。對(duì)于高度異質(zhì)性膠質(zhì)瘤，針對(duì)何種治療靶點(diǎn)才能真正提高療效，是當(dāng)前臨床治療所關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。近年對(duì)膠質(zhì)瘤起源的研究顯示，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）在膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡性進(jìn)展、治療抵抗和復(fù)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3?4］，但此類(lèi)細(xì)胞是起源于室管膜下區(qū)惡性轉(zhuǎn)化的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）還是由腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化而來(lái)，尚無(wú)定論。在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不僅可使微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞發(fā)生有利于其組織重構(gòu)的重編程，而且具有高度抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性作用。近年來(lái)，腫瘤免疫治療方法和臨床療效已取得巨大進(jìn)步［5］，但有關(guān)靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞免疫治療的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不僅可以作為靶向治療的理想靶點(diǎn)，而且有望成為免疫治療的首選靶點(diǎn)，有可能從根本上改善膠質(zhì)瘤的治療前景。

一、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞概述

早在20世紀(jì)70年代，Hamburger等學(xué)者即已提出導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)的腫瘤干細(xì)胞理論，迄今已獲得大量研究證據(jù)的支持［6］。腫瘤干細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例較小，具有自我更新、多系分化潛能和耐受常規(guī)治療的生物學(xué)特性。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是膠質(zhì)瘤中具有腫瘤起始作用的細(xì)胞［3，7］，存在異質(zhì)性，即使起源于同一腫瘤，其生物學(xué)特性亦不完全相同［8?9］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有誘導(dǎo)腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤侵襲播散和對(duì)放化療高度耐受等特性，并可在常規(guī)治療壓力下迅速重建腫瘤，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤快速?gòu)?fù)發(fā)［10］。越來(lái)越多的研究聚焦于與上述生物學(xué)特征相關(guān)的重要分子調(diào)控通路，以期獲取高效、可靠的治療靶點(diǎn)。

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表面可表達(dá)不同的蛋白質(zhì)，與維持其自身穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)，這些細(xì)胞表面蛋白質(zhì)是篩選和靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的理想標(biāo)志物，其中以CD133最為經(jīng)典。體外實(shí)驗(yàn)顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，且可在腦組織內(nèi)啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞之生物學(xué)活性［3］。與此同時(shí)，CD15、CD36、CD44、SOX2、巢蛋白（Nes）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G2（ABCG2）等亞群也為較受關(guān)注的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，早期研究多通過(guò)制備針對(duì)上述標(biāo)志物的特異性單克隆抗體靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。然而，正常神經(jīng)干細(xì)胞也可表達(dá)上述標(biāo)志物，而且某些膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞群存在類(lèi)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣生物學(xué)行為，但并不表達(dá)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，例如，CD133-膠質(zhì)瘤細(xì)胞也可表現(xiàn)出較強(qiáng)的組織重構(gòu)等膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型［11?12］。有多條關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)，其中研究最多的通路是 Notch、Sonic Hedgehog、Wnt/β?連環(huán)蛋白（β?catenin）、磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）通路。然而，通過(guò)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞仍面臨較大困難，這是由于上述通路并非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞所特有，亦同時(shí)存在于正常神經(jīng)干細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞中。體外研究顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)POU3F2、SOX2、OLIG2、SALL2基因，可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞去分化為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞［13］，提示關(guān)鍵促瘤基因可決定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化與否，并進(jìn)一步調(diào)控膠質(zhì)瘤之進(jìn)展。胚胎發(fā)育中的功能轉(zhuǎn)錄因子，如雙螺旋絲蛋白20（PHF20）、SOX2、SOX9和鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶4（OCT4）等兼具促腫瘤效應(yīng)，其中PHF20被鑒定為膠質(zhì)瘤特異性抗原，但臨床研究顯示，接受抗PHF20抗體治療的膠質(zhì)瘤患者并未獲得優(yōu)于對(duì)照組的療效［14］。PHF20高表達(dá)于神經(jīng)源性腫瘤，通過(guò)顯著上調(diào)SOX2和OCT4表達(dá)水平以增強(qiáng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤自我更新和腫瘤啟動(dòng)能力，在腫瘤發(fā)生中具有重要作用［15］；SOX2和SOX9則高表達(dá)于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，發(fā)揮維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)的重要作用［16?17］；SOX2、SOX9 和 OCT4 表達(dá)缺失可抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞活性并延緩腫瘤啟動(dòng)［18?19］。上述研究均提示，PHF20?SOX2?SOX9?OCT4 軸對(duì)維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)表型具有重要作用，探究上述特定腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因之間的相互作用，有助于明確膠質(zhì)瘤起源，從而為靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

二、靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的免疫治療

目前一直在探尋療效確切的膠質(zhì)瘤免疫治療方案，主要包括被動(dòng)免疫治療、過(guò)繼免疫治療和主動(dòng)免疫治療。被動(dòng)免疫治療是利用抗體或毒素等免疫效應(yīng)分子，在不直接激活免疫系統(tǒng)的情況下靶向殺傷腫瘤細(xì)胞；過(guò)繼免疫治療是通過(guò)過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移和應(yīng)用嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR?T），在體外以腫瘤抗原激活T細(xì)胞，然后再將這種可特異性識(shí)別腫瘤的活化T細(xì)胞輸入患者體內(nèi)，達(dá)到免疫治療目的。主動(dòng)免疫治療通常稱(chēng)為疫苗接種，通過(guò)各種來(lái)源的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），如腫瘤裂解物、腫瘤細(xì)胞、mRNA或多肽，直接激活患者免疫系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤之目的。

1.靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的單克隆抗體 由單克隆抗體介導(dǎo)的靶向腫瘤抗原的免疫治療已逾30年，由于單克隆抗體的直接細(xì)胞殺傷和免疫調(diào)節(jié)作用而在腫瘤免疫治療中曾占據(jù)重要地位［20］，隨著各種膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物陸續(xù)得到鑒定，各類(lèi)人源化小分子多功能單克隆抗體被寄予厚望。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因擴(kuò)增和突變是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的重要遺傳學(xué)特征［21］，直接靶向EGFR的單克隆抗體已用于膠質(zhì)瘤的治療，其中研究最多、應(yīng)用最廣泛的是西妥昔單抗，通過(guò)干擾配體結(jié)合和EGFR細(xì)胞外二聚體形成，阻斷EGFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮功能［22］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β（TGF?β）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與膠質(zhì)瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，惡性膠質(zhì)瘤患者血清TGF?β表達(dá)變化與腫瘤分級(jí)和預(yù)后呈正相關(guān)［23］，TGF?β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞相關(guān)基因如SOX4、SOX2、LIF，實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新并抑制其分化［23?24］。臨床研究顯示，靶向TGF?β的免疫治療無(wú)明顯不良反應(yīng)，復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤細(xì)胞可被抗TGF?β抗體GC1008靶向結(jié)合，并在治療早期即顯示出良好的腫瘤抑制作用，但并不能阻止治療后期臨床和影像學(xué)出現(xiàn)的腫瘤進(jìn)展，故而未能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期臨床獲益［25］。貝伐單抗是另一用于治療膠質(zhì)瘤的單克隆抗體，是美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療高級(jí)別膠質(zhì)瘤的人源血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）單克隆抗體，具有顯著的抗腫瘤血管生成作用，且可干擾膠質(zhì)瘤干細(xì)胞小生境中的血管狀態(tài)，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤干細(xì)胞易受其他治療方法的損傷［26?27］，但在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中并未觀(guān)察到明顯的生存獲益，僅可在一定時(shí)間內(nèi)控制瘤周水腫以改善臨床癥狀，以及在放射治療所致假性進(jìn)展方面有確切療效［28］。

2.靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的溶瘤病毒 溶瘤病毒（OVs）是經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的具有選擇性在腫瘤細(xì)胞中繁殖并殺傷腫瘤細(xì)胞的治療藥物。其重要設(shè)計(jì)原則是減弱或刪除病毒毒力因子，使溶瘤病毒無(wú)法在正常組織中復(fù)制，但仍保留在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞的能力［29］。目前已證實(shí)腫瘤特異性基因，如RAS、TP53、RB1、同源性磷酸酶?張力蛋白（PTEN）和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的編碼基因及其他腫瘤相關(guān)基因，可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)病毒的易感性［30］，這是由于促腫瘤與抗病毒的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間形成干擾，從而為病毒復(fù)制提供適宜的環(huán)境。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗病毒過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是由干擾素（IFN）介導(dǎo)的，而腫瘤細(xì)胞中IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷，不具有較強(qiáng)的抗病毒能力［31］。腫瘤干細(xì)胞同樣具有腫瘤特異性基因突變和IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷的特點(diǎn)，故溶瘤病毒可以有效殺傷腫瘤干細(xì)胞，該療法已在荷瘤小鼠體內(nèi)顯示出一定的抗腫瘤療效［32］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，攜帶白細(xì)胞介素?12（IL?12）的溶瘤性單純皰疹病毒（HSV）可使荷瘤小鼠腦腫瘤消退［33］。溶瘤病毒治療膠質(zhì)瘤進(jìn)展較快，由于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高度富集整合素如αvβ3或αvβ5，通過(guò)基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)的溶瘤病毒可以通過(guò)這些整合素進(jìn)入膠質(zhì)瘤干細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤作用，其中DNX?2401是一種具有腫瘤特異性和強(qiáng)感染能力的溶瘤病毒，已用于Ⅰ期臨床試驗(yàn)且安全性良好、腫瘤體積明顯縮小、患者生存期延長(zhǎng)［34?35］。除直接的溶瘤作用外，趨化性增強(qiáng)的免疫細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞也參與抗腫瘤過(guò)程，從而產(chǎn)生明顯的臨床療效［35］。除腦膠質(zhì)瘤外，溶瘤病毒對(duì)多種體部惡性腫瘤的腫瘤干細(xì)胞亦具有殺傷效應(yīng)。在乳腺癌模型中，溶瘤病毒GLV?1h68可在腫瘤干細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制并殺傷高表達(dá)乙醛脫氫酶 1（ALDH1）的腫瘤干細(xì)胞［36］；在卵巢癌模型中，拮抗趨化因子受體4（CXCR4）的溶瘤病毒對(duì)CD44+CD117+腫瘤干細(xì)胞具有明顯殺傷作用［37］；在結(jié)腸癌模型中，靶向腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的溶瘤腺病毒可以選擇性感染CD133+腫瘤干細(xì)胞［38］，溶瘤病毒與氟尿嘧啶（5?FU）聯(lián)合應(yīng)用對(duì)CD133+和CD44+腫瘤干細(xì)胞具有明顯治療效果［39］；在肝癌模型中，溶瘤性麻疹病毒可靶向并裂解CD133+腫瘤干細(xì)胞［40］。此外，溶瘤病毒還具有調(diào)節(jié)荷瘤宿主機(jī)體免疫力的作用，使免疫系統(tǒng)可以更好地適應(yīng)病毒抗腫瘤活性［41］。

3.靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的嵌合抗原受體T細(xì)胞過(guò)繼性T細(xì)胞治療（ACT）是一種個(gè)性化治療，這種免疫細(xì)胞具有直接抗腫瘤活性。過(guò)繼性T細(xì)胞治療需首先從患者體內(nèi)分離出浸潤(rùn)腫瘤的T細(xì)胞，在IL?2的刺激下，經(jīng)體外培養(yǎng)使其具備特異性識(shí)別腫瘤的能力，然后再將其回輸至患者體內(nèi)［42］。與通過(guò)腫瘤相關(guān)抗原刺激固有免疫系統(tǒng)的主動(dòng)免疫不同，過(guò)繼轉(zhuǎn)移的CAR?T細(xì)胞可以直接靶向腫瘤相關(guān)抗原而不依賴(lài)抗原提呈過(guò)程。嵌合抗原受體（CAR）可以靶向腫瘤表面抗原并激活T細(xì)胞，從而達(dá)到抗腫瘤作用［43］。相對(duì)于體內(nèi)固有的數(shù)目少且功能低下的腫瘤特異性T細(xì)胞，CAR?T細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增至較高水平，從而誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)。CAR?T細(xì)胞目前已成功用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，由于實(shí)體腫瘤表面缺乏特異性抗原，該療法在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用尚待深入探索［44］。晚近靶向腫瘤干細(xì)胞的CAR?T細(xì)胞療法，已在各種類(lèi)型腫瘤模型中進(jìn)行觀(guān)察研究，以評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性：在前列腺癌模型中，針對(duì)EpCAM抗原的CAR?T細(xì)胞可以根除PC3M和PC3腫瘤模型中的腫瘤干細(xì)胞［45］；膜嵌合IL?15構(gòu)建的CAR?T細(xì)胞在CD19+白血病中可誘導(dǎo)生成靶向腫瘤干細(xì)胞的記憶性T細(xì)胞［46］；在結(jié)腸癌模型中，過(guò)繼轉(zhuǎn)移的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞可特異性識(shí)別腫瘤干細(xì)胞抗原ASB4，進(jìn)而選擇性消滅腫瘤干細(xì)胞［47］。但是考慮到CAR?T細(xì)胞療法對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，如認(rèn)知功能障礙、腦積水等，其治療膠質(zhì)瘤的報(bào)道尚不多見(jiàn)［48?49］。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中最常見(jiàn)的EGFR基因特異性突變——表皮生長(zhǎng)因子受體變異體Ⅲ（EGFRvⅢ）目前已成為CAR?T細(xì)胞療法的重要靶點(diǎn)。靶向EGFRvⅢ的CAR?T細(xì)胞療法在荷瘤小鼠模型以及Ⅰ期臨床試驗(yàn)（試驗(yàn)編號(hào)：NCT02209376）中可清除表達(dá)EGFRvⅢ的腫瘤細(xì)胞［50］，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，可使CAR?T細(xì)胞表達(dá)特異性IL?13Rα2或人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2），進(jìn)而靶向殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；由于CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)IL?13Rα2和HER2，故可被 CAR?T 細(xì)胞識(shí)別并殺傷［51?52］。上述研究表明，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可能成為CAR?T細(xì)胞療法的潛在靶點(diǎn)。

4.靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的腫瘤疫苗 腫瘤疫苗可以激活宿主免疫系統(tǒng)，識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，屬主動(dòng)免疫治療。激活免疫系統(tǒng)的最佳途徑是刺激多功能抗原呈遞細(xì)胞（APC），如樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)B細(xì)胞），其中以樹(shù)突狀細(xì)胞為最佳選擇。樹(shù)突狀細(xì)胞自外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中分離純化，先由IL?4和粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM?CSF）刺激生成未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞，再以 IL?1b、IL?6、前列腺素 E2（PGE2）和腫瘤壞死因子?α（TNF?α）混合物成分刺激，獲得成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞［53］。樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療腫瘤的主要目的是產(chǎn)生特異性輔助性T細(xì)胞（Th），從而激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤作用［54］。腫瘤細(xì)胞中可被樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別的各種成分稱(chēng)為腫瘤相關(guān)抗原，激活的樹(shù)突狀細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)后，通過(guò)向腫瘤特異性T細(xì)胞提呈腫瘤相關(guān)抗原以增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)［55］。惡性實(shí)體腫瘤動(dòng)物模型的觀(guān)察結(jié)果業(yè)已顯示，靶向腫瘤干細(xì)胞相關(guān)抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗具有明確的療效：在惡性黑色素瘤模型中，由腫瘤干細(xì)胞裂解物致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞可使荷瘤小鼠分泌更多的INF?γ和IL?4，抑制腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠存活期［56］；在卵巢癌模型中，包含NANOG肽的樹(shù)突狀細(xì)胞可以識(shí)別腫瘤干細(xì)胞并誘導(dǎo)高度特異性抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)［57］；有研究顯示，樹(shù)突狀細(xì)胞可通過(guò)共同提呈腫瘤特異性抗原和Toll樣受體（TLR）激活宿主對(duì)黑色素瘤的免疫反應(yīng)［58］，腫瘤細(xì)胞崩解后部分成分又可增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)主動(dòng)免疫的刺激；臨床研究顯示，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后接受樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療安全、有效［59］。由此可見(jiàn)，腫瘤疫苗通過(guò)將腫瘤相關(guān)抗原更多地暴露給免疫細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗腫瘤作用，因此，能否制備出有效識(shí)別腫瘤干細(xì)胞并激活免疫反應(yīng)的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗是提高免疫治療效果的關(guān)鍵。Jachetti等［60］的研究顯示，與經(jīng)分化腫瘤細(xì)胞致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞相比，以耐受放射治療的腫瘤干細(xì)胞致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞可促使機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的T細(xì)胞毒性并分泌更多的 IFN?γ。Dashti等［56］分別通過(guò)小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10和腫瘤干細(xì)胞裂解物致敏樹(shù)突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)后者致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞可明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活期。Ning等［61］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腫瘤干細(xì)胞裂解物致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞可使接受免疫治療的荷瘤小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG，從而在補(bǔ)體存在的情況下增強(qiáng)其細(xì)胞毒性；此外，在黑色素瘤和鱗狀細(xì)胞癌模型中，通過(guò)腫瘤干細(xì)胞致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞可以使荷瘤小鼠體內(nèi)產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有相同的樹(shù)突狀細(xì)胞致敏能力，因此直接靶向這一腫瘤細(xì)胞亞群，進(jìn)而建立針對(duì)膠質(zhì)瘤的腫瘤疫苗有望成為有效的治療方案［62］。臨床試驗(yàn)顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者通過(guò)移植轉(zhuǎn)染自體膠質(zhì)瘤干細(xì)胞mRNA的樹(shù)突狀細(xì)胞，激發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，使腫瘤消 退 ，延 長(zhǎng) 總 生 存 期（OS）［63］。 Finocchiaro 和Pellegatta［62］經(jīng)對(duì)一系列臨床前研究結(jié)果的總結(jié)，得出以富含膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞群致敏樹(shù)突狀細(xì)胞可以增強(qiáng)膠質(zhì)瘤免疫治療效果的結(jié)論，進(jìn)而提出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)的FABP7、GLAST、CD133、SOX2等是腫瘤疫苗免疫治療的良好靶點(diǎn)，有利于提高膠質(zhì)瘤患者整體生存率。制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞腫瘤疫苗，需先將手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本制備為單細(xì)胞懸液，然后在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下分離單個(gè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并增殖為干細(xì)胞球，再提取膠質(zhì)瘤干細(xì)胞mRNA并轉(zhuǎn)染至單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞。ICT?107疫苗是由6種合成多肽致敏自體外周血單個(gè)核細(xì)胞分化的樹(shù)突狀細(xì)胞，可靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相關(guān)抗原，例如 HER2、黑色素瘤缺乏因子 2（AIM2）、gp100、IL?13Rα2、酪氨酸相關(guān)蛋白?2（TRP?2）、黑色素瘤抗原基因?1（MAGE1）等。Phuphanich 等［64］在針對(duì)新發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案中增加了ICT?107疫苗治療，結(jié)果顯示，患者中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）為16.9個(gè)月、中位總生存期為38.4個(gè)月，部分患者接種該疫苗后經(jīng)歷再次手術(shù)切除，切除標(biāo)本中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞數(shù)目明顯減少，提示該疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫靶向殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。Wen等［65］的Ⅱ期臨床試驗(yàn)是首個(gè)針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并獲得陽(yáng)性結(jié)果的免疫治療的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，觀(guān)察新發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者手術(shù)和放化療后加用樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗對(duì)患者無(wú)進(jìn)展生存期或總生存期的影響，其結(jié)果顯示，ICT?107組患者中位無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)2個(gè)月且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總生存期也有所延長(zhǎng)但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Vik?Mo等［63］研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者接受規(guī)范化綜合治療后于皮下注射膠質(zhì)瘤干細(xì)胞疫苗，可成功誘導(dǎo)出增強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)（7/10例）；接種疫苗的患者無(wú)進(jìn)展生存期較對(duì)照者延長(zhǎng)2.9倍且無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)。在生理狀態(tài)下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在主動(dòng)免疫治療過(guò)程中激活的樹(shù)突狀細(xì)胞較少，需補(bǔ)充造血干/祖細(xì)胞以提供樹(shù)突狀細(xì)胞并持續(xù)誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞反應(yīng)，造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后分化為CD86+CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞，呈現(xiàn)出活化樹(shù)突狀細(xì)胞表型和功能，從而激發(fā)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)。造血干/祖細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因高表達(dá)CD86等共刺激分子而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤免疫作用［66］。近年來(lái)，SOX2作為一種維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是主動(dòng)免疫治療的新靶點(diǎn)，SOX2肽疫苗可以顯著增強(qiáng)全身和局部免疫反應(yīng)，并在腫瘤模型中延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物存活期，無(wú)論是否聯(lián)合化療均可觀(guān)察到確切的療效［67］。因此，靶向SOX2等膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的疫苗可以為主動(dòng)免疫治療提供新的方案。

5.針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自然殺傷細(xì)胞 以自然殺傷（NK）細(xì)胞為基礎(chǔ)的過(guò)繼免疫治療無(wú)論對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤還是實(shí)體腫瘤均是一種有前景的免疫治療策略［68］。NK細(xì)胞抗腫瘤的基礎(chǔ)依賴(lài)NK細(xì)胞及其活化性受體［如NK細(xì)胞活化性受體NKG2D、DNAX輔助分子1（DNAM?1）等］對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的對(duì)應(yīng)配體［如主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類(lèi)鏈相關(guān)分子A和B（MICA和MICB）、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒糖蛋白UL?16結(jié)合蛋白（ULBP）、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）、黏連蛋白2等］的識(shí)別，識(shí)別并激活后的NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。正常細(xì)胞可表達(dá)較高水平的被NK細(xì)胞抑制性受體識(shí)別的主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ（MHCⅠ）類(lèi)分子，從而免受NK細(xì)胞的攻擊［69］。體外研究顯示，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可表達(dá)高水平的PVR和黏連蛋白2，NK細(xì)胞活化性受體DNAM?1可以特異性識(shí)別上述兩種配體，進(jìn)而殺傷膠質(zhì)瘤干細(xì)胞［70］。大多數(shù)惡性腫瘤的腫瘤干細(xì)胞MHCⅠ類(lèi)分子表達(dá)水平較低，刺激NK細(xì)胞抑制性受體的作用較弱，從另一方面活化NK細(xì)胞多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤干細(xì)胞中NK細(xì)胞配體的調(diào)節(jié)［71?72］，其中 MICA、MICB 和 ULBP 在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中上調(diào)，RAS/PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可促進(jìn)NKG2D對(duì)應(yīng)的配體在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)［73］。NK細(xì)胞可對(duì)病毒感染和腫瘤形成產(chǎn)生快速反應(yīng)，在活化性受體陽(yáng)性且抑制性受體陰性的情況下，NK細(xì)胞可直接裂解MHCⅠ缺失的腫瘤細(xì)胞或其他病原體［74］。有多項(xiàng)研究支持腫瘤干細(xì)胞是NK細(xì)胞免疫殺傷作用的易感靶點(diǎn)：Tseng等［75］的研究顯示，與分化腫瘤細(xì)胞相比，NK細(xì)胞與口腔鱗癌干細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞和人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（iPSCs）進(jìn)行共同孵育時(shí)，NK 細(xì)胞毒性增強(qiáng)，IFN?γ分泌增加；Castriconi等［70］發(fā)現(xiàn)，源于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)經(jīng)IL?2或IL?15激活的NK細(xì)胞介導(dǎo)的裂解物高度敏感；新鮮純化的同種異體NK細(xì)胞可識(shí)別并殺傷結(jié)直腸癌來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞，而分化的腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的敏感性較低，這種NK細(xì)胞對(duì)腫瘤干細(xì)胞和普通腫瘤細(xì)胞易感性的差異與腫瘤干細(xì)胞表面活化性受體對(duì)應(yīng)配體的表達(dá)水平相關(guān)，腫瘤干細(xì)胞中特異性結(jié)合激活性受體NKp30和NKp44的配體表達(dá)水平明顯高于非腫瘤干細(xì)胞［76］。上述研究表明，NK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療有可能在根除殘留腫瘤干細(xì)胞方面發(fā)揮積極作用，NK細(xì)胞除直接殺傷腫瘤干細(xì)胞外，還可誘導(dǎo)其分化。在腫瘤干細(xì)胞和IL?2同時(shí)存在的情況下，CD16可抑制NK細(xì)胞毒性并促進(jìn)其細(xì)胞因子分泌，NK細(xì)胞這種狀態(tài)稱(chēng)為“分裂無(wú)力”。NK細(xì)胞可分泌大量IFN?γ，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞中的MHCⅠ、分化受體和細(xì)胞程序性死亡蛋白配體1（PDL1）表達(dá)水平升高，并降低腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44表達(dá)水平，這種誘導(dǎo)分化腫瘤干細(xì)胞的作用可使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移受到抑制［77］。由此可見(jiàn)，NK細(xì)胞通過(guò)兩步機(jī)制抑制腫瘤進(jìn)展，先殺傷一部分腫瘤干細(xì)胞，然后在NK細(xì)胞分裂停滯的狀態(tài)下，誘導(dǎo)剩余腫瘤干細(xì)胞群體細(xì)胞分化［78］。

三、針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞微環(huán)境免疫抑制的治療策略

通過(guò)增強(qiáng)腫瘤特異性抗原表達(dá)促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)以達(dá)到治療效果的研究一直備受關(guān)注。晚近研究顯示，腫瘤干細(xì)胞免疫微環(huán)境中存在一種抑制免疫反應(yīng)的機(jī)制，干擾免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用，免疫檢查點(diǎn)在免疫抑制的腫瘤干細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)這些免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)已成為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)［79?80］，其中細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA?4）和細(xì)胞程序性死亡蛋白1（PD1）是重要治療靶點(diǎn)。CTLA?4亦稱(chēng)為CD152，是T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)因子，與T細(xì)胞具有高度親和性，從而導(dǎo)致其耗盡并抑制其活化［81?82］。PD1 表達(dá)于各種免疫細(xì)胞中，如活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞［83］。多項(xiàng)研究顯示，各種惡性腫瘤組織中均可檢測(cè)到呈高表達(dá)的PD1及配體PDL1，與T細(xì)胞耗盡相關(guān)［84］，二者相互作用可明顯抑制活化的T細(xì)胞分泌IFN?γ并使T細(xì)胞無(wú)功能化［85］。CTLA?4抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用已被闡明，表明抗CTLA?4治療可以解除T細(xì)胞的抑制作用，從而支持抗腫瘤免疫反應(yīng)［86］。外周淋巴細(xì)胞CTLA?4表達(dá)水平下調(diào)可以改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后［87］。膠質(zhì)瘤進(jìn)展期患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）中的PD1表達(dá)上調(diào)，膠質(zhì)瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中PD1表達(dá)亦上調(diào)［88］，PD1軸在腫瘤進(jìn)展和免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵促進(jìn)作用［89］。因此，在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的惡性腫瘤中，阻斷PD1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是挽救免疫抑制并維持抗腫瘤免疫反應(yīng)的有效方法。

針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境中免疫抑制的研究一直是神經(jīng)腫瘤學(xué)的熱點(diǎn)。膠質(zhì)瘤中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腫瘤有明顯促進(jìn)作用［90］，這兩種細(xì)胞功能?chē)?yán)重依賴(lài)集落刺激因子1受體（CSF1R），阻斷CSF1R，無(wú)論是在膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型中還是膠質(zhì)瘤患者中均顯示出較好的療效［91?92］。M2型TAMs在腫瘤微環(huán)境中可促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展，當(dāng)以CSF1R抑制劑為靶點(diǎn)時(shí)，TAMs可切換為抗腫瘤作用的M1型。PLX3397是一種可透過(guò)血?腦屏障的CSF1R抑制劑，可減少TAMs和小膠質(zhì)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的募集［93］。另一種CSF1R抑制劑BLZ945，可顯著抑制腫瘤進(jìn)程并提高腫瘤模型中荷瘤動(dòng)物的存活率，經(jīng)BLZ945治療后，M2型TAMs標(biāo)志物表達(dá)水平減少，促腫瘤能力受到抑制［91］。雖然抑制CSF1R提供了一種具有前景的治療策略，但有研究顯示，PI3K、胰島素樣生長(zhǎng)因子?1及其受體（IGF?1/IGF?1R）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可能對(duì)GSF1R抑制劑耐藥，因此，聯(lián)合應(yīng)用GSF1R抑制劑與PI3K、IGF1R抑制劑可延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者總生存期［92］。

盡管在膠質(zhì)瘤免疫治療中各種免疫檢查點(diǎn)的研究一直受到高度關(guān)注，但PD1和CTLA?4始終是最多被研究的分子，并經(jīng)臨床試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)膠質(zhì)瘤的作用切實(shí)有效［94］。目前業(yè)已取得臨床進(jìn)展的免疫治療藥物，以抗PD1抗體Nivolumab最受關(guān)注，但其在膠質(zhì)瘤治療中的療效十分有限，聯(lián)合應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑與標(biāo)準(zhǔn)治療方案可以在一定程度上提高部分膠質(zhì)瘤患者的生存期［95］，改善預(yù)后，減少藥物不良反應(yīng)［96］。此外，我們課題組的前期研究也顯示，TAMs可被膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)并且發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［97］，成為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞組織重構(gòu)進(jìn)程中的重要組成部分，此類(lèi)惡性轉(zhuǎn)化的免疫細(xì)胞亦構(gòu)成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤高度異質(zhì)性的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［98］。

四、結(jié)論

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境決定了膠質(zhì)瘤的發(fā)生進(jìn)展。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、各種免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子之間的復(fù)雜多向相互作用，最終形成對(duì)腫瘤有支持作用的腫瘤免疫微環(huán)境，促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞始動(dòng)的腫瘤發(fā)生、增殖和侵襲。針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤微環(huán)境中免疫抑制機(jī)制的研究，有助于研發(fā)免疫治療藥物，從而針對(duì)潛在的膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。

利益沖突無(wú)