莊子萌， 蔣葉香， 阿迪拉·阿里木， 張珺媛， 蔣沐岐， 宋 耿， 梁華敏， 王 維， 朱敏潔

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，武漢 430030

近年來(lái)空氣質(zhì)量問(wèn)題備受關(guān)注，“霧霾”的重要組成成分細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)更是近年來(lái)環(huán)境衛(wèi)生研究的熱點(diǎn)?？諝庵械念w粒物進(jìn)入氣道后的位置與其直徑大小有關(guān)，直徑小于2.5 μm的細(xì)顆粒物可以進(jìn)入肺泡，引起全身毒性[1]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，妊娠期暴露于PM2.5與多種先天性心臟畸形(congenital heart defects，CHDs)有關(guān)[2-5]。CHDs是心臟結(jié)構(gòu)的先天發(fā)育畸形，發(fā)病率高且治療費(fèi)用昂貴，平均每300名新生兒中就有1例CHDs發(fā)生，在發(fā)達(dá)國(guó)家CHDs造成的新生兒死亡人數(shù)占總新生兒死亡人數(shù)的1/3[6]，研究CHDs的危險(xiǎn)因素對(duì)減輕醫(yī)療衛(wèi)生負(fù)擔(dān)和提高民眾健康水平有著重要意義。然而PM2.5引起CHDs的機(jī)制仍不明確，目前對(duì)機(jī)制的研究主要集中于氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[7]、甲基化水平改變和線粒體功能障礙[6]等方面，這些生物學(xué)效應(yīng)與PM2.5組分和各組分的協(xié)同作用有關(guān)。從交通尾氣中提取的PM2.5可以分為水溶性成分、有機(jī)成分、碳芯成分，單獨(dú)作用時(shí)，有機(jī)成分的生物學(xué)效應(yīng)最明顯，碳芯成分的生物學(xué)效應(yīng)最弱，而水溶性成分和有機(jī)成分的聯(lián)合作用與PM2.5整體作用時(shí)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)相似，且這種聯(lián)合作用強(qiáng)于任一組分的單獨(dú)作用[8]。DNA甲基化是一種共價(jià)修飾，主要指胞嘧啶的第5號(hào)碳原子在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下被甲基化修飾為5-甲基胞嘧啶，屬于表觀遺傳學(xué)的范疇，是真核生物在染色質(zhì)水平控制基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制。雖然目前的研究嘗試通過(guò)甲基化水平改變將PM2.5暴露與CHDs聯(lián)系起來(lái)，但是甲基化水平改變與CHDs直接關(guān)聯(lián)的機(jī)制仍未確定，本文將從甲基化水平改變這一可能機(jī)制對(duì)PM2.5暴露與CHDs的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 PM2.5影響DNA甲基化的機(jī)制

PM2.5可通過(guò)影響甲基供體水平和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)DNA甲基化產(chǎn)生作用。PM2.5會(huì)干擾甲基供體S-S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的合成，降低SAM水平，使SAM與S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine，SAH)比值下降，從而導(dǎo)致DNA總體低甲基化[8]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基供體SAM轉(zhuǎn)移到DNA上的組蛋白[9]，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PM2.5反復(fù)暴露后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低，且降低的水平與濃度有關(guān)[10]，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的降低也會(huì)引起甲基化水平降低，從而使PM2.5影響DNA甲基化水平。

PM2.5暴露會(huì)導(dǎo)致總體甲基化水平降低[11-12]，并改變個(gè)別基因通路甲基化水平[13-15]，但后者研究較少。PM2.5暴露會(huì)引起心臟和肺的甲基化水平下降[10，16]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)妊娠期暴露于柴油廢氣(DE)組成的PM2.5會(huì)降低富含CpG的區(qū)域中DNA的甲基化水平[11]。

2 CHDs發(fā)生中的甲基化水平改變

甲基化水平改變是解釋CHDs發(fā)生的可能機(jī)制之一，甲基化水平改變的位點(diǎn)和變化方向影響基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加CHDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。基因內(nèi)部位點(diǎn)的高甲基化與基因表達(dá)升高有關(guān)，而啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化則會(huì)抑制下游基因的表達(dá)[17]；總體甲基化水平降低與染色體穩(wěn)定性降低和基因組功能改變有關(guān)[18]。胎盤或胎兒某些基因甲基化的改變可增加CHDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，有研究認(rèn)為胎盤DNA胞嘧啶核苷酸甲基化水平可以預(yù)測(cè)法洛四聯(lián)征的發(fā)生[19]。目前關(guān)于CHDs發(fā)生與甲基化水平的研究主要有兩類，一類以唐氏綜合征(Down syndrome)患兒為對(duì)象，唐氏綜合征患兒中有40%～60%伴發(fā)CHDs，是目前研究甲基化水平CHDs的良好模型；另一類研究以發(fā)生與未發(fā)生CHDs的胎兒為對(duì)象。這兩類研究均有對(duì)于甲基化水平改變的報(bào)道。

針對(duì)CHDs患兒的研究已發(fā)現(xiàn)許多與心臟形態(tài)或心血管疾病有關(guān)的基因甲基化發(fā)生了有意義的改變，例如MSX1基因[17]、GATA4基因[17]、PRDM16基因[20]、APOA5基因[21]、Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路[22]。MSX1是編碼肌節(jié)同源盒基因家族的一個(gè)成員[17]，已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其可以抑制動(dòng)脈圓錐處細(xì)胞過(guò)度增殖，參與流出道形態(tài)的形成[23]。在發(fā)生CHDs的心臟中檢測(cè)到MSX1基因內(nèi)部甲基化水平升高[17]。在室間隔缺損病例中發(fā)現(xiàn)PRDM16基因一個(gè)位點(diǎn)甲基化水平明顯升高，該基因表達(dá)抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白PRDM16，而TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)控制組織形態(tài)學(xué)發(fā)生，對(duì)室間隔形成起重要作用，敲除TGF-β2基因會(huì)引起包括室間隔缺損在內(nèi)的嚴(yán)重的心臟畸形[20]。APOA5基因與血漿三酰甘油水平相關(guān)，該基因的2種亞型可作為高脂蛋白血癥的生物標(biāo)志物，有研究發(fā)現(xiàn)在主動(dòng)脈瓣狹窄者APOA5基因甲基化發(fā)生有意義變化，但對(duì)這種改變是否會(huì)增加主動(dòng)脈瓣狹窄風(fēng)險(xiǎn)仍存分歧[20-27]。GATA4基因在心臟發(fā)育中起作用，GATA4基因的變異與包括法洛四聯(lián)征、主動(dòng)脈瓣缺損、室間隔缺損等在內(nèi)的許多種CHDs有關(guān)，該基因轉(zhuǎn)錄很大程度上受其翻譯產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，GATA4第300號(hào)賴氨酸的甲基化會(huì)降低GATA4基因的轉(zhuǎn)錄[24]。在CHDs患兒中檢測(cè)到GATA4基因甲基化水平升高，但這種變化在不伴發(fā)CHDs的唐氏綜合征病例中也可檢測(cè)到[17]，故兩者關(guān)系仍待探討。以上針對(duì)單個(gè)已知作用的基因甲基化水平改變的研究提示甲基化在CHDs發(fā)生中的確發(fā)揮一定作用。甲基化水平變化可以反映基因表達(dá)水平的改變，同時(shí)甲基化作為表觀遺傳學(xué)的理論之一，可將環(huán)境因素與CHDs發(fā)生相關(guān)聯(lián)以解釋環(huán)境因素作用機(jī)制。

3 PM2.5引起CHDs的機(jī)制

PM2.5對(duì)總體和局部基因甲基化水平的影響是解釋其誘導(dǎo)CHDs發(fā)生的機(jī)制之一。PM2.5暴露導(dǎo)致的總體甲基化水平降低[11-12]可能會(huì)降低染色體穩(wěn)定性，導(dǎo)致基因組功能改變[18]，影響發(fā)育。盡管現(xiàn)有研究可以證明PM2.5暴露會(huì)引起存在基因特異性的甲基化水平變化，并可尋找到變化位點(diǎn)[8，10]，但直接將PM2.5暴露、甲基化水平改變、CHDs聯(lián)系起來(lái)解釋PM2.5生物學(xué)機(jī)制的研究仍較少。PM2.5暴露會(huì)影響Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)是胚胎發(fā)育中一個(gè)重要的通路，涉及包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞的分化過(guò)程，此通路的異常調(diào)節(jié)會(huì)引起包括CHDs在內(nèi)的多種先天畸形，而組蛋白H3K4甲基化在Wnt應(yīng)答基因中發(fā)揮核心作用，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可以穩(wěn)定β-catenin[22]。PM2.5中的可萃取有機(jī)成分可作為AhR的激動(dòng)劑，AhR的激動(dòng)可對(duì)抗Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，從而增加子代CHDs患病率[13]，葉酸對(duì)此有保護(hù)作用[28]，葉酸參與一碳單位代謝產(chǎn)生甲基供體SAM可能是葉酸在此過(guò)程中具有保護(hù)作用的原因[22]。補(bǔ)充葉酸可以抵消PM2.5降低SAM/SAH比值的作用，減弱PM2.5對(duì)控制DNA甲基化基因的表達(dá)影響，這些基因包括dnmt1、dnmt4、uhrf1、tet2、gch1、qdprb等[15]。

盡管有以上研究認(rèn)為甲基化水平改變可能是PM2.5引起CHDs的機(jī)制之一，但仍有研究發(fā)現(xiàn)三者的聯(lián)系存疑。PM2.5作用后針對(duì)胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)位點(diǎn)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，并不是所有的位點(diǎn)都會(huì)發(fā)生甲基化改變，發(fā)生改變的位點(diǎn)也并不是同一時(shí)間出現(xiàn)的[29]。CHDs患兒甲基化水平的研究在甲基化改變方向上目前也有爭(zhēng)議，有研究發(fā)現(xiàn)CHDs患兒全基因組甲基化水平是降低的，但其中甲基化水平變化有意義的位點(diǎn)甲基化水平往往是升高的，而且這些位點(diǎn)大多位于控制轉(zhuǎn)錄的區(qū)域[17]，局部甲基化升高與目前認(rèn)為PM2.5降低甲基化水平的作用相悖[8-10]。同時(shí)甲基化改變對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響程度也有待探討，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)妊娠期暴露于柴油廢氣中的PM2.5后，只有小部分區(qū)域附近的轉(zhuǎn)錄水平有明顯改變，雖然相關(guān)基因涉及細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生命活動(dòng)，但是有改變的基因數(shù)仍然比預(yù)期要少。柴油廢氣暴露的子代成年后心肌肥大和心力衰竭患病率仍然增加，提示甲基化水平改變的影響可能需要在環(huán)境壓力的作用下才能體現(xiàn)[11]。

甲基化水平改變也可能是機(jī)體保護(hù)機(jī)制的反映，這使PM2.5作用機(jī)制更加復(fù)雜，也表明甲基化水平變化是否為PM2.5對(duì)子代心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響的機(jī)制之一仍待確認(rèn)。瘦素(leptin，LEP)是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中的一個(gè)能量調(diào)節(jié)激素，在胚胎植入、子宮內(nèi)生長(zhǎng)和胎兒發(fā)育中均發(fā)揮作用，LEP與其受體結(jié)合會(huì)刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等血管生成因子產(chǎn)生，激活p38、MAPK和Akt通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[14]。有研究發(fā)現(xiàn)左心發(fā)育不全綜合征患兒胎盤LEP水平增加，并猜測(cè)LEP表達(dá)增加是對(duì)血管異常的代償[30]。妊娠中期暴露于PM2.5會(huì)使LEP啟動(dòng)子甲基化水平下降，從而提高LEP水平，胎盤LEP啟動(dòng)子水平又與一種氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激標(biāo)志物胎盤3-NTp的水平呈負(fù)相關(guān)[14]，而氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激是目前對(duì)PM2.5損傷作用的主流解釋[1]，故猜測(cè)PM2.5暴露后LEP水平升高可能是機(jī)體的保護(hù)性反應(yīng)。

4 甲基化水平改變?cè)赑M2.5作用機(jī)制研究中的應(yīng)用展望

甲基化水平改變作為PM2.5暴露引起CHDs的可能機(jī)制之一，還可作為PM2.5產(chǎn)生生物學(xué)作用的標(biāo)志，檢測(cè)PM2.5發(fā)生作用的時(shí)間窗口，驗(yàn)證環(huán)境因素的作用是否存在，從而引導(dǎo)進(jìn)一步的研究。

有研究發(fā)現(xiàn)某些污染物對(duì)先天缺陷發(fā)病增加的影響存在不同的時(shí)間窗口[31-32]，PM2.5暴露也可能存在時(shí)間窗口，且這個(gè)時(shí)間窗口可能早于胚胎心臟發(fā)育時(shí)間[31]，針對(duì)時(shí)間窗口的研究對(duì)孕期保健有指導(dǎo)作用；甲基化水平改變可早于形態(tài)學(xué)變化，以甲基化水平改變?yōu)檠芯恐笜?biāo)可縮小PM2.5暴露時(shí)間窗口的寬度。以往的研究多局限于追溯新生兒CHDs發(fā)生與孕期暴露濃度，只能將時(shí)間范圍局限在妊娠中的若干周，研究的時(shí)間段較為寬泛，如研究發(fā)現(xiàn)室間隔缺損與妊娠第7～10周的PM2.5暴露顯著相關(guān)[33]，房間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺損和肺動(dòng)脈瓣狹窄與妊娠第3～8周的PM2.5暴露顯著相關(guān)[34]，有的研究甚至不關(guān)注時(shí)間窗口[35]。通過(guò)測(cè)定甲基化，可以縮小PM2.5暴露時(shí)間窗口的寬度。研究發(fā)現(xiàn)PM2.5濃度增加與12個(gè)位點(diǎn)的CpG變化有關(guān)，且隨著暴露時(shí)間增長(zhǎng)，相關(guān)的甲基化變化位點(diǎn)越多，其中2個(gè)位點(diǎn)在妊娠后第2、7、28天的甲基化水平存在顯著性差異[29]；但該研究時(shí)間段劃分粗略，并不能確定最明確的時(shí)間窗口。其他研究縮小了時(shí)間窗口，發(fā)現(xiàn)妊娠后第53天PM2.5暴露與肺動(dòng)脈瓣狹窄的發(fā)生有關(guān)，妊娠第50天和第51天的PM2.5暴露與法洛四聯(lián)征發(fā)生有關(guān)，該結(jié)果符合胎兒心血管系統(tǒng)發(fā)育的時(shí)期。但PM2.5暴露作用可能并不只發(fā)生在某段時(shí)間中，體外研究顯示反復(fù)低水平PM2.5暴露會(huì)引起表觀遺傳學(xué)改變[36]，這說(shuō)明最顯著時(shí)間點(diǎn)存在有可能是長(zhǎng)時(shí)間暴露后效應(yīng)積累產(chǎn)生質(zhì)變。

甲基化改變不僅可以用于解釋PM2.5作用機(jī)制，也可以作為其他研究的輔助工具。目前對(duì)妊娠前母親的PM2.5暴露是否與子代CHDs發(fā)病率升高有關(guān)還存在爭(zhēng)議。有人認(rèn)為PM2.5暴露對(duì)后代心血管系統(tǒng)的影響可能不僅限于妊娠期通過(guò)胎盤影響胚胎發(fā)育，親代的接觸同樣會(huì)引起子代心臟發(fā)育異常，并認(rèn)為其機(jī)制與PM2.5對(duì)成人心血管系統(tǒng)影響機(jī)制可能有相同之處，如引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，但針對(duì)PM10在妊娠期暴露的研究并未發(fā)現(xiàn)其與CHDs存在聯(lián)系[33]。妊娠前后PM2.5暴露的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)顆粒物會(huì)引起基因表達(dá)改變，妊娠前接觸可能通過(guò)表觀遺傳影響子代心臟發(fā)育。PM2.5可引起人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞內(nèi)微核產(chǎn)生率增加，誘發(fā)細(xì)胞染色體損傷[37]，故也可能引起生殖細(xì)胞染色體損傷，產(chǎn)生遺傳毒性。為明確妊娠前PM2.5暴露的影響，未來(lái)的妊娠前暴露研究可嘗試應(yīng)用甲基化水平的測(cè)定來(lái)驗(yàn)證影響的存在。