臧學(xué)麗，陳 光*

（1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，是人類攝取最廉價(jià)和最優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來(lái)源[1]。大豆蛋白中人體必需氨基酸含量豐富[2]，各成分分布均衡[3]，是人類獲取植物蛋白的主要來(lái)源。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是大豆中主要的蛋白成分，主要由7S及11S球蛋白組成，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[4]。SPI具有一定溶解性、凝膠性、乳化性等功能特性，并被廣泛應(yīng)用于食品等多個(gè)領(lǐng)域[5-7]。但天然的SPI功能特性并不理想，未經(jīng)加工的SPI功能尚不能滿足人們?cè)谌粘Ｉa(chǎn)中的需求。目前大豆蛋白改性的方法有物理法、化學(xué)法、生物酶法。物理法和化學(xué)法改性存在凝膠效果不好或食品發(fā)全等問(wèn)題，生物酶法具有發(fā)全可靠、反應(yīng)溫和等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究熱點(diǎn)[8-9]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）是一種能催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的-氨基與谷氨酸上γ-羥酰胺基之間發(fā)生聯(lián)合反應(yīng)的酶[10]，能聚合蛋白多肽之間形成共價(jià)聚合物。TGase交聯(lián)能改變SPI的溶解性、凝膠特性、疏水性等[11]。Walsh等[12]采用TGase對(duì)SPI進(jìn)行處理，研究表明經(jīng)TGase處理后，SPI的溶解性顯著提高，溶解特性得到改善。Gan等[13]采用TGase為改性劑交聯(lián)SPI，研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)TGase改性的SPI凝膠強(qiáng)度和黏彈性均有顯著的變化。SPI經(jīng)過(guò)酶作用后，蛋白內(nèi)部的非極性氨基酸殘基暴露到表面，使蛋白的疏水性增大，發(fā)生聚集效應(yīng)[14]，形成凝膠。但TGase處理大豆蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化的關(guān)系及作用機(jī)制的研究還不系統(tǒng)，限制了酶改性SPI工業(yè)的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熱力學(xué)、波譜學(xué)、微觀結(jié)構(gòu)等方法對(duì)TGase交聯(lián)SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析，采用差示掃描量熱儀、紅外光譜、掃描電鏡、X-射線衍射、圓二色譜[15-16]等研究TGase交聯(lián)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步探索TGase交聯(lián)對(duì)SPI分子結(jié)構(gòu)的影響，為T(mén)Gase交聯(lián)SPI的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，以期為大豆制品的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吉林芽豆SPI由實(shí)驗(yàn)室自制；TGase 美國(guó)Sigma公司；氨基酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品 日本W(wǎng)ako公司；溴化鉀（分析純） 美國(guó)Amresco公司；磷酸鹽緩沖溶液 東莞樹(shù)萬(wàn)化工有限公司；戊二醛（分析純） 廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純） 常州市啟迪化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900型氨基酸全自動(dòng)分析儀 日本日立公司；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；ALPHA1-4LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；DSCq2000差示掃描量熱儀 美國(guó)TA儀器公司；Sanyo Versatile圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；AF206制冰機(jī) 美國(guó)Scotsman制冰機(jī)系統(tǒng)有限公司；BC-163D酸度計(jì) 北京市華云分析儀器研究所；D8廣角X-射線衍射儀、TENSOR 27紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；MLS-3780超低溫冰箱日本Sanyo Labo Autoclave公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；85-1C磁力攪拌機(jī) 上海梅穎浦有限公司；EVO MA 25掃描電鏡 德國(guó)卡爾蔡思公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參照Sorgentini等[17]方法并略作改動(dòng)。吉林芽豆經(jīng)粉碎脫脂后得到大豆粉為原料，按照豆粉與水的比例1∶10（g/mL）混合，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0。4 ℃低溫?cái)嚢杼崛? h，8 000×g離心30 min。上清液用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.5，在室溫下靜止1 h，再次離心，條件同上，棄掉上清液。沉淀用去離子水溶解，并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0。充分?jǐn)嚢枞芙夂螅? ℃低溫條件下對(duì)提取液透析24 h除鹽，冷凍干燥制備得SPI，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 TGase交聯(lián)SPI樣品的制備

將SPI配制成2%蛋白溶液，按照TGase交聯(lián)SPI制得凝膠強(qiáng)度最佳條件[18]，即酶添加量34.67 U/g、反應(yīng)溫度60 ℃、pH 7.22、反應(yīng)時(shí)間2.21 h，立即放入冰浴中，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到SPI交聯(lián)樣品。

1.3.3 表面疏水性的測(cè)定

采用1-苯胺基-8-萘磺酸（1-a n i l i n o-8-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光分光光度計(jì)法。準(zhǔn)確稱取交聯(lián)前后最佳條件下的SPI樣品0.01 g，溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，在室溫下，攪拌1 h，10 000 r/min離心20 min。上清液用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）稀釋成不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%。以上稀釋液樣品分別量取4 mL，加入濃度為8 mmol/L的ANS（配制時(shí)，采用同一緩沖溶解）溶液40 μL，充分混勻。在室溫條件下靜止10 min。溶液中不加ANS作為空白，在激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm條件下，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定蛋白樣品的熒光強(qiáng)度。橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)的濃度，縱坐標(biāo)為不同濃度蛋白對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，作圖。蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（S0）用曲線初始階段的斜率表示。

1.3.4 自由氨基含量的測(cè)定

取酶交聯(lián)前后最佳條件下的SPI 250 μL，加入4.0 mL 0.2 mol/L pH 8.2的磷酸緩沖液混勻，加入0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液2 mL，混合均勻。置于50 ℃水浴鍋中水浴30 min，然后在反應(yīng)體系中加入亞硫酸鈉溶液4.0 mL，終止反應(yīng)。靜止20 min，在室溫下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)420 nm處吸光度。以不加入SPI的樣品作為對(duì)照，計(jì)算自由氨基含量。

1.3.5 差示掃描量熱分析

準(zhǔn)確稱取5.0 mg交聯(lián)前后最佳SPI凝膠強(qiáng)度的蛋白凍干粉，放置于鋁干鍋中，用壓片機(jī)壓片密封，選擇空白壓片干鍋盒作為對(duì)照，升溫速率為5 ℃/min，升溫范圍30～140 ℃。分析差示掃描量熱曲線，得到最佳條件下交聯(lián)前后蛋白樣品的變性溫度和變性焓值。

1.3.6 TGase加入后SPI凝膠掃描電鏡分析

取適量的TGase交聯(lián)前后最佳條件下SPI的蛋白凍干粉。5 000 r/min離心10 min，保留沉淀并均勻分散于4%的戊二醛溶液中，4 ℃冰箱中過(guò)夜固定。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3 次。使用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、85%、95%）逐級(jí)脫水，無(wú)水乙醇脫水2 次，每次脫水時(shí)間為15 min。5 000 r/min離心10 min回集沉淀物。真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，電鏡檢測(cè)。

1.3.7 X-射線衍射分析

將交聯(lián)前后最佳條件下SPI的蛋白凍干粉樣。放入X-射線衍射儀中，對(duì)廣角X-射線衍射進(jìn)行分析。測(cè)試條件：波長(zhǎng)0.154 nm，電壓40 kV，電流50 nA，衍射角范圍3～50 ℃。

1.3.8 紅外光譜掃描

準(zhǔn)確稱取1 mg交聯(lián)前后最佳條件下干燥蛋白凍干粉。加入100 mg溴化鉀，充分研磨混勻，進(jìn)行全波段掃描，波長(zhǎng)范圍為4 000～400 cm-1。分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次。

1.3.9 圓二色譜分析

稱取交聯(lián)前后最佳條件下5 mg SPI樣品，溶于5 mL pH 7.2的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，室溫條件下攪拌25 min，8 000 r/min離心10 min?；丶锨逡合♂屩?.1 mg/mL進(jìn)行圓二色譜檢測(cè)。圓二光譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為190～250 nm。

1.3.10 氨基酸組分分析

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》的方法測(cè)定。利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定TGase交聯(lián)前后最佳條件下SPI蛋白凍干粉樣品17 種氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase對(duì)SPI表面疏水性的影響

圖1 TGase交聯(lián)對(duì)表面疏水性的影響Fig. 1 Effect of TGase cross-linking on the surface hydrophobicity of SPI

如圖1所示，交聯(lián)后提高了SPI的表面疏水性，表面疏水性指數(shù)由原來(lái)的282.10增加到383.32，提高了35.9%。表面疏水性提高，分析原因有可能是表面疏水性由蛋白質(zhì)的表面殘基暴露的程度所決定。暴露于分子表面疏水性殘基越多，表面疏水性越強(qiáng)，SPI經(jīng)TGase催化后，使SPI的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，多肽鏈展開(kāi)，疏水區(qū)域從分子內(nèi)部基團(tuán)逐漸暴露出來(lái)，使表面疏水性升高。

2.2 TGase交聯(lián)SPI表面自由氨基含量的變化

圖2 TGase對(duì)SPI自由氨基含量的影響Fig. 2 Effect of TGase cross-linking on the free amino content of SPI

如圖2所示，TGase交聯(lián)SPI交聯(lián)產(chǎn)物的自由氨基含量降低，自由氨基含量由未交聯(lián)的8.12 μmol/g下降到的2.13 μmol/g，下降了73.8%。自由氨基含量降低，原因是TGase催化蛋白質(zhì)交聯(lián)的過(guò)程中，使蛋白質(zhì)肽段上的氨基轉(zhuǎn)變成NH3釋放出來(lái)，發(fā)生了脫氨反應(yīng)；另外一方面原因有可能是TGase的作用使谷氨酸分子上酰胺基與賴氨酸上的氨基發(fā)生結(jié)合，使交聯(lián)產(chǎn)物自由氨基的含量降低。同時(shí)自由氨基含量的下降在一定程度上說(shuō)明了TGase作用后交聯(lián)作用的發(fā)生程度。

2.3 差示掃描量熱分析

圖3 TGase交聯(lián)前后SPI的差示掃描量熱圖譜Fig. 3 DSC thermograms of native and TGase cross-liked SPI

表1 TGase處理前后差示掃描量熱分析Table 1 DSC characteristics of native and TGase cross-liked SPI

由圖3可以看出，T G a s e作用后的變性溫度和熱焓值都有所提高，交聯(lián)前S P I的變性溫度為（7 3.7 5±0.1 3）℃，交聯(lián)后變性溫度為（76.30±0.22）℃。變性溫度提高反應(yīng)蛋白的熱穩(wěn)定性，說(shuō)明交聯(lián)后SPI熱穩(wěn)定性有所提高。熱焓值交聯(lián)前為（176±0.52）J/g，交聯(lián)后熱焓值為（193±0.32）J/g，熱焓值能反映蛋白質(zhì)的疏水性和聚集程度，熱焓值提高，原因可能是酶交聯(lián)后蛋白側(cè)鏈上特定基團(tuán)交聯(lián)形成更大的分子，產(chǎn)生了大量的高能異肽共價(jià)鍵，從而使產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性提高，與Jiang Shujuan等[19]研究結(jié)果相一致。從這一結(jié)論可以看出交聯(lián)可能產(chǎn)生了異肽共價(jià)鍵，熱穩(wěn)定性升高，凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.4 TGase對(duì)SPI凝膠結(jié)構(gòu)的影響

圖4 TGase交聯(lián)SPI（a～c）和SPI（A～C）凝膠電鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of TGase cross-linked SPI (a-c)and native SPI (A-C)

由圖4可以看出，未添加TGase的SPI凝膠的表面光滑，呈球形結(jié)構(gòu)，TGase交聯(lián)后結(jié)構(gòu)由球形結(jié)構(gòu)變成凹陷坑洼球形結(jié)構(gòu)。說(shuō)明TGase對(duì)SPI凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)或集團(tuán)之間的相互作用有著非常重要的調(diào)節(jié)作用[20]，酶交聯(lián)改變的大豆蛋白的表面形貌。Arzeni等[21]利用掃描電鏡觀察高場(chǎng)強(qiáng)超聲波處理大豆蛋白的變化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)更加明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，超聲波處理屬于物理改性，超聲波處理后大豆蛋白的表面形貌改變與TGase交聯(lián)表面形貌改變的不同，說(shuō)明不同的方法處理大豆蛋白對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)有不同的影響。

2.5 X-射線衍射分析

由圖5可知，SPI衍射峰分別出現(xiàn)在衍射角為9.6°和20.2°處，明顯的衍射峰出現(xiàn)在20.2°處；TGase衍射峰出現(xiàn)在衍射角為20.1°處，TGase交聯(lián)后SPI衍射峰出現(xiàn)在衍射角為20.2°處；經(jīng)過(guò)酶交聯(lián)后SPI，在衍射角為9.6°處衍射峰消失，在衍射角為20.2°處衍射峰強(qiáng)度相對(duì)TGase和未交聯(lián)的SPI相比較均有所減弱，但峰形變的尖銳；衍射峰能夠形成結(jié)晶行為的樣品必須具備有序的分子結(jié)構(gòu)，TGase經(jīng)SPI交聯(lián)后衍射峰減弱。說(shuō)明SPI經(jīng)TGase處理后，使SPI結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，對(duì)SPI微觀晶體結(jié)構(gòu)有所影響。分析原因有可能交聯(lián)后蛋白多肽鏈充分伸展，結(jié)晶度降低。

圖5 TGase、TGase交聯(lián)前后SPI的X-射線衍射圖譜Fig. 5 X-ray diffraction analysis of native and TGase cross-liked SPI

2.6 紅外光譜分析

2.6.1 TGase對(duì)SPI紅外圖譜的影響

圖6 TGase、TGase交聯(lián)前后SPI紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of native and TGase cross-liked SPI

如圖6、表2所示，SPI 3 600～3 300 cm-1波段的吸回峰值不變，最強(qiáng)吸回峰均為3 409 cm-1，遷移到了3 420 cm-1，遷移了11 cm-1。說(shuō)明TGase交聯(lián)會(huì)引起SPI分子內(nèi)和分子間的氫鍵改變，或O—H伸縮振動(dòng)、N—H伸縮振動(dòng)[22]。2 980～2 850 cm-1波段SPI最強(qiáng)吸回峰在2 940 cm-1，TGase交聯(lián)后最強(qiáng)吸回峰為2 933 cm-1，酶交聯(lián)引起吸回峰遷移7 cm-1，且峰值升高。說(shuō)明TGase處理后SPI能夠引起蛋白質(zhì)分子飽和結(jié)構(gòu)中CH3和CH2基團(tuán)的C—H伸縮振動(dòng)增強(qiáng)，可能交聯(lián)后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)或進(jìn)一步斷裂，與X-射線衍射分析相一致。1 700～1 600 cm-1波段，SPI高峰在1 651 cm-1，酶交聯(lián)后最高峰在1 633 cm-1，并且吸回峰的強(qiáng)度有所增強(qiáng)。說(shuō)明酶交聯(lián)后酰胺I帶C—O伸縮振動(dòng)和H—O—H彎曲振動(dòng)增加。

2.6.2 TGase對(duì)SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的紅外圖譜中，蛋白質(zhì)主要包括4 種構(gòu)相結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲等。二級(jí)結(jié)構(gòu)與各波段吸回峰的位置關(guān)系為α-螺旋對(duì)應(yīng)波段l 650～1 658 cm-1，β-折疊為1 610～1 640 cm-1和1 682～1 700 cm-1，β-轉(zhuǎn)角為1 664～1 681 cm-1，無(wú)規(guī)卷曲為1 640～1 650 cm-1。酰胺III 1 220～1 330 cm-1波段內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與波段對(duì)應(yīng)關(guān)系為：α-螺旋為1 290～1 340 cm-1，無(wú)規(guī)卷曲為1 255～1 288 cm-1，β-折疊結(jié)構(gòu)1 181～1 248 cm-1。如圖6所示，未處理SPI高峰在1 651 cm-1，酶交聯(lián)后最高峰在1 633 cm-1，遷移了15 cm-1。這說(shuō)明SPI經(jīng)TGase交聯(lián)后β-折疊結(jié)構(gòu)含量有較大的提高。分析原因有可能蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的一部分α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為β-折疊，形成了穩(wěn)定的β折疊構(gòu)造，SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.7 圓二色譜分析

從圖7可以看出，SPI和TGase交聯(lián)SPI樣品的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖在194 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)正峰，218 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)負(fù)肩峰，這是高度有序的β類型結(jié)構(gòu)的一種特征。通過(guò)Reed擬合計(jì)算，得到2 種樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成見(jiàn)表3。

表3 TGase交聯(lián)前后SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Table 3 Secondary structure compositions of native and TGase crossliked SPI

從表3可以看出，TGase交聯(lián)前后SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定的差別。與未經(jīng)過(guò)酶交聯(lián)的SPI相比，經(jīng)過(guò)TGase交聯(lián)后的大豆蛋白有序度更高，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量較低；而β-折疊相對(duì)含量增加，與紅外光譜結(jié)果一致，與王辰等[23]的相關(guān)研究，表面疏水性隨著SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量降低而增大，β-折疊相對(duì)含量升高而增大的結(jié)果相一致。進(jìn)一步證明了SPI的功能特性與二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。胡曉[24]利用紅外光譜分析了TGase交聯(lián)后花生蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，得出交聯(lián)后α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量降低，β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲含量增加，與本研究結(jié)果不一致，可能是由于TGase交聯(lián)使不同作用底物二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同的變化。

2.8 氨基酸測(cè)定結(jié)果

表4 TGase交聯(lián)前后SPI氨基酸的成分及含量Table 4 Amino acid compositions of native and TGase cross-liked SPI

由表4可以看出，SPI中氨基酸含量最高的為天冬氨酸。絲氨酸、組氨酸、脯氨酸等氨基酸的含量有所降低。交聯(lián)前后8 種必需氨基酸和疏水性氨基酸比較，必需氨基酸占比由34.96%升高到36.90%，升高了5.5%。分析原因有可能是交聯(lián)后蛋白質(zhì)谷氨酸酰胺基和賴氨酸的氨基之間結(jié)合形成含有共價(jià)聚合物的交聯(lián)，賴氨酸等必需氨基酸被引入SPI中，TGase改善了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特性，提高了蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。疏水性氨基酸占比由31.13%提高到35.63%，提高了14.5%。研究[25-27]表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性顯著影響蛋白質(zhì)的凝膠性，SPI經(jīng)酶交聯(lián)后，必需氨基酸的含量升高，疏水性氨基酸含量升高。蛋白中疏水性氨基酸的含量與其表面疏水性呈正比例相關(guān)，交聯(lián)后疏水性氨基酸含量升高說(shuō)明表面疏水性升高，與表面疏水性一致，進(jìn)一步證明了疏水性氨基酸含量與凝膠強(qiáng)度正相關(guān)。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)TGase交聯(lián)后SPI的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征，交聯(lián)后表面疏水性提高，表明SPI經(jīng)TGase催化后，使SPI的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，多肽鏈展開(kāi)，疏水區(qū)域從分子內(nèi)部基團(tuán)逐漸暴露出來(lái)，使表面疏水性升高。自由氨基的含量降低，說(shuō)明交聯(lián)后發(fā)生了脫氨反應(yīng)或使谷氨酸分子上酰胺基與賴氨酸上的氨基發(fā)生結(jié)合，使交聯(lián)產(chǎn)物自由氨基的含量降低。交聯(lián)前后掃描電鏡分析，表明交聯(lián)后由球形結(jié)構(gòu)變成陷孔狀結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。X-射線衍射分析表明交聯(lián)后多肽鏈充分伸展，空間結(jié)構(gòu)改變，結(jié)晶度降低。紅外光譜、圓二色譜對(duì)交聯(lián)前后二級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明交聯(lián)后有序度更高，β-折疊相對(duì)含量增加，形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量降低。而氨基酸含量測(cè)定結(jié)果表明交聯(lián)后引入賴氨酸等必需氨基酸，必需氨基酸占比由34.96%升高到36.90%，疏水性氨基酸占比由31.13%提高到35.63%，交聯(lián)后可以提高疏水性氨基酸的含量，改善SPI的表面疏水性，提高β-折疊含量，使凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)。本研究結(jié)果可以看出，TGase交聯(lián)后結(jié)構(gòu)由球形結(jié)構(gòu)變成凹陷坑洼球形結(jié)構(gòu)，與胡曉[24]研究的交聯(lián)花生蛋白結(jié)構(gòu)變化不同，說(shuō)明TGase交聯(lián)使不同作用底物二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同的變化。TGase交聯(lián)SPI后產(chǎn)生了異肽共價(jià)鍵，熱穩(wěn)定性升高，凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)，表明選育含疏水性氨基酸高的大豆品種可以提高凝膠強(qiáng)度，為食品加工專用型大豆品種的選育提供了可行的研究思路。