付喜梅，黃慶華，俞秋華

（四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610041）

軍團(tuán)菌是一種可以引起急性細(xì)菌性呼吸道疾?。ㄜ妶F(tuán)菌病）的細(xì)菌，且90%以上的軍團(tuán)菌病是因?yàn)楦腥臼确诬妶F(tuán)菌所致（Legionella pneumophila，Lp）[1]。嗜肺軍團(tuán)菌是革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然水體、人工水系統(tǒng)、空調(diào)冷卻系統(tǒng)及沐浴用水中，可通過氣溶膠的方式傳播給人體[2]。目前，中央空調(diào)在公共場所中使用廣泛，人工噴泉往往也在人口密集的場所，這些因素都會(huì)增加嗜肺軍團(tuán)菌的感染。因嗜肺軍團(tuán)菌生長周期長，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法操作繁雜、陽性檢出率較低，不利于公共環(huán)境的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)，同時(shí)也不便于在臨床普及應(yīng)用[3]。因此，主要針對(duì)集中空調(diào)冷凝水中分離出的血清1型噬肺軍團(tuán)菌進(jìn)行稀釋培養(yǎng)和Legiolert定量盤檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑

GVPC選擇培養(yǎng)基（北京陸橋），BCYE軍團(tuán)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（北京陸橋），軍團(tuán)菌診斷血清，Legiolert配套試劑，Legiolert定量盤。

1.2 儀器

371型 CO2恒 溫 培 養(yǎng) 箱，Thermo ELECTRON CORPORATION；16824 型過濾器，Sartorius Biotech；DL30 型 水 浴 鍋，Thermo SCIENTIFIC； Quant-Tray sealer plus型 Legiolert定量儀，IDEXX。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本研究在2017年和2019年共采集冷卻水樣12份，依據(jù)WS394-2012《公共場所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》處理樣品，將500 mL水樣無菌操作進(jìn)行過濾，取下濾膜并將其置于15 mL滅菌水中，充分洗脫，處理后進(jìn)行接種培養(yǎng)及分離鑒定。隨后取陽性菌株嗜肺軍團(tuán)菌血清1型用無菌水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，選擇適宜稀釋度懸液接種，吸取0.1 mL稀釋液接種于GVPC平皿上并均勻涂布，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，然后將培養(yǎng)皿放入 37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。Legiolert定量盤檢測(cè)方法如下：取上述稀釋度的懸液1 mL至含100 mL無菌水的不含硫代硫酸鈉的無菌取樣瓶中，后加入配套Legiolert試劑，蓋上瓶蓋，搖勻至試劑完全溶解。將處理好的樣品全部倒入Legiolert定量盤中，輕拍或輕彈定量盤，以排出空氣，然后立即放入Quanti-tray PLUS程控定量封口機(jī)中封口，取出定量盤并將紙板面向下于（37±0.5）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照來判讀結(jié)果，培養(yǎng)時(shí)需在培養(yǎng)箱底部放入托盤，內(nèi)置一定體積的水，保證80%的濕度。

2 結(jié)果與分析

采集的12份冷卻水中共檢出嗜肺軍團(tuán)菌陽性2份，其中嗜肺軍團(tuán)菌血清1型1份，嗜肺軍團(tuán)菌2-15型1份。

分別取嗜肺軍團(tuán)菌稀釋濃度為1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010的稀釋液0.1 mL接種在GVPC平皿上，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)第7 d的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果分別為247 CFU、12 CFU、2 CFU、0 CFU。Legiolert定 量 盤檢測(cè)方法培養(yǎng)不足7 d出現(xiàn)的陽性反應(yīng)可以確定嗜肺軍團(tuán)菌檢出，但準(zhǔn)確的定量結(jié)果需要在第7 d讀取。分別取嗜肺軍團(tuán)菌稀釋濃度1∶107、1∶108、1 ∶ 109、1 ∶ 1010的稀釋液 1 mL至100 mL的Legiolert試劑瓶中，封口后的定量盤培養(yǎng)第7 d時(shí)計(jì)數(shù)，稀釋濃度分別為 1∶107、1∶ 108、1∶109、1∶1010，計(jì)數(shù)后查表檢測(cè)濃度為 1 109 MPN、98.9 MPN、18.7 MPN、3.9 MPN。

3 討論與結(jié)論

隨著社會(huì)進(jìn)步和公共設(shè)施的進(jìn)一步完善，公共衛(wèi)生檢測(cè)工作應(yīng)當(dāng)引起更高的重視。在醫(yī)院、酒店、地鐵站等集中空調(diào)冷卻塔水以及機(jī)場管道水、沐浴用水、景觀水等公共場所均能分離出軍團(tuán)菌[4-8]。在這些水體系統(tǒng)中，冷卻水中軍團(tuán)菌檢出率相對(duì)較高[6,9-11]，嗜肺軍團(tuán)菌冷卻塔的溫度不僅適宜軍團(tuán)菌生長繁殖，且在系統(tǒng)循環(huán)過程中會(huì)形成氣溶膠造成周圍環(huán)境污染。軍團(tuán)菌在空氣中以氣溶膠的方式經(jīng)呼吸道傳播，引起軍團(tuán)菌肺炎或龐蒂亞克熱[12]。因空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)消毒不及時(shí)、使用維護(hù)不合理等原因，被軍團(tuán)菌污染的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)是造成室內(nèi)空氣污染和人員感染的主要來源。軍團(tuán)菌適宜生長溫度是36～42 ℃，每年的夏秋季節(jié)隨著氣溫升高，公共場所的空調(diào)使用也較頻繁，冷卻塔的水溫會(huì)隨之升高，這有利于軍團(tuán)菌的生長和繁殖，此時(shí)間段檢測(cè)準(zhǔn)確性較高。本研究在調(diào)查年份的6—9月采樣，共抽取12家集中空調(diào)的冷卻水，檢出出2份嗜肺軍團(tuán)菌陽性，說明冷卻塔水適宜嗜肺軍團(tuán)菌生長，需注意冷卻塔水有引發(fā)軍團(tuán)病的危險(xiǎn)，本次調(diào)查結(jié)果與多個(gè)空調(diào)冷卻水、冷凝水軍團(tuán)菌污染調(diào)查結(jié)果一致[13]。軍團(tuán)菌病的預(yù)防主要是切斷空調(diào)冷卻水、景觀水等水體系統(tǒng)中軍團(tuán)菌的污染源，常用的含氯消毒劑能有效殺滅軍團(tuán)菌但是長期使用對(duì)空調(diào)設(shè)備有損傷，因此有效且易實(shí)施的消毒方式對(duì)環(huán)境中軍團(tuán)菌的控制起著至關(guān)重要的作用。

軍團(tuán)菌是一種專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，其生長需要多種鈣、鎂、錳等元素，營養(yǎng)要求較高，實(shí)驗(yàn)室不易培養(yǎng)。分離培養(yǎng)法和Legiolert定量盤檢測(cè)方法均可檢出活菌存在與否，實(shí)驗(yàn)過程均能獲得活菌用于后續(xù)研究。分離培養(yǎng)法是軍團(tuán)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性高達(dá)100%，但是該方法敏感性比較低，檢出率為25%～75%，受實(shí)驗(yàn)室人員技術(shù)影響較大，且培養(yǎng)必須在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行[12-13]。Legiolert定量盤檢測(cè)方法是基于酶底物反映的原理，通過與陰性對(duì)照組對(duì)比顏色和濁度的差異判斷結(jié)果，7 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)任何顯褐色的跡象或者濁度大于陰性對(duì)照，均表明嗜肺軍團(tuán)菌陽性，即嗜肺軍團(tuán)菌檢出。濁度大于陰性對(duì)照說明有嗜肺軍團(tuán)菌生長，但其中的指示劑還未顯示出來。7 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)陽性說明嗜肺軍團(tuán)菌檢出，但定量結(jié)果需要在第7 d讀取。Legiolert定量盤檢測(cè)方法操作時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)人員暴露風(fēng)險(xiǎn)降低，受實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)影響較少，實(shí)驗(yàn)人員的日檢測(cè)數(shù)量可以大幅度提高，無需二氧化碳培養(yǎng)箱，常規(guī)的培養(yǎng)箱即可達(dá)到培養(yǎng)條件。本研究中Legiolert定量盤檢測(cè)方法初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果中嗜肺軍團(tuán)菌檢出范圍為 3.9～2 272.6 MPN/100 mL，其中全部顯褐色的檢出結(jié)果為大于 2 272.6 MPN/100 mL，檢測(cè)范圍較大，適宜于采樣液體量大但嗜肺軍團(tuán)菌含量低的樣本，增加檢測(cè)敏感性，提高檢出率。該方法適用于生活飲用水和非飲用水中噬肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)，若用于冷卻塔水檢測(cè)時(shí)該方法在第7 d可以計(jì)數(shù)查表得到定量結(jié)果。對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌檢出的場所，定量檢測(cè)可以對(duì)消毒效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)公共場所衛(wèi)生消毒工作。