李巧峽 王 玉 黃永林

（西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070）

發(fā)育生物學是在動物胚胎學的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門學科，主要研究動物胚胎發(fā)育模式與發(fā)育機理。隨著發(fā)育生物學學科的發(fā)展，它與形態(tài)解剖學、細胞生物學、生物化學、分子生物學和分子遺傳學等學科之間具有越來越強的依存性和相融性。與該學科相應(yīng)的發(fā)育生物學實驗課教學，不僅能加深學生對論知識的理解和記憶，而且在學生的知識結(jié)構(gòu)與認知體系中占有非常重要的地位。目前大多數(shù)本科院校主要以動物為材料開設(shè)發(fā)育生物學實驗課，這些實驗僅適合簡單的胚胎學觀察，對于發(fā)育機理等分子操作方面的實驗，很多學校面臨諸多困難，例如材料培養(yǎng)耗時、耗經(jīng)費，實驗儀器缺乏，實驗技術(shù)支撐不夠等。目前，隨著植物發(fā)育生物學學科的發(fā)展，各種材料與技術(shù)方法層出不窮。因此，在發(fā)育生物學實驗中，引入花器官發(fā)育等實驗，結(jié)合發(fā)育機理方面的研究進展，更好地培養(yǎng)學生的觀察能力、實踐動手能力、分析問題與解決問題的能力及科研創(chuàng)新能力。

開花是有花植物生活史中一個重大轉(zhuǎn)折點，是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長最明顯的標志，該轉(zhuǎn)折受到環(huán)境、生理和基因表達的調(diào)控。開花可分為成花誘導(dǎo)和花器官形成等過程。在植物花發(fā)育的過程中，一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用組成一個分子網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控花器官的身份與發(fā)育。植物一旦誘導(dǎo)成花后，在花分生組織的兩側(cè)就會遵循ABC 模型相繼發(fā)育成花萼、花瓣、雄蕊與雌蕊4 輪花器官。在ABC 模型中，A 類基因調(diào)控花萼的身份與發(fā)育，A+B 類基因調(diào)控花瓣的身份與發(fā)育，B+C 類基因調(diào)控雄蕊的身份與發(fā)育，C 類基因調(diào)控雌蕊的身份與發(fā)育［1］。如果這些基因發(fā)生突變，就會影響花器官的發(fā)育及花器官的同源異型轉(zhuǎn)換［2］。A 類基因發(fā)生突變的結(jié)果是心皮取代萼片，雄蕊取代花瓣；B 類基因發(fā)生突變的結(jié)果是萼片取代花瓣，心皮取代雄蕊；C 類基因發(fā)生突變的結(jié)果是花瓣取代雄蕊，雌蕊群則由另一個C 類基因突變花代替［2］。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是利用RNA 干擾誘導(dǎo)植物中目標基因沉默的技術(shù)［3］。具有方便、快速的優(yōu)點，并避開了植物遺傳轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性。由pTRV（pTRV1 和pTRV2）載體介導(dǎo)的VIGS 技術(shù)首先在煙草（Nicotiana）中成功建立［5-6］，目前已是一種非常成熟的基因沉默技術(shù)，并在多種植物中成功建立［7-9］。因此，以模式植物本氏煙草（Nicotiana benthamiana）為材料，選取ABC 模型中任何一類基因，運用VIGS 的實驗方法，讓學生理解花器官發(fā)育的分子機理，并學會一系列的實驗操作方法，可調(diào)動學生參與實驗教學的積極性和主動性，激發(fā)學生的學習興趣和潛能，培養(yǎng)學生自主式與探究式的學習能力。

1 綜合性實驗內(nèi)容

1.1 教師準備環(huán)節(jié) 為避免與分子實驗沖突，縮短實驗進程，在實驗準備環(huán)節(jié)，VIGS 載體（pTRV2∶∶探針序列）構(gòu)建與本氏煙草幼苗培養(yǎng)由教師在課前提前完成。

實驗中的VIGS 載體為pTRV1 和pTRV2。已有的探針序列（例如NbGLO1）通過引物引入限制性內(nèi)切酶酶切位點，pTRV2 用相同的內(nèi)切酶同時進行過夜酶切，酶切溫度參考說明書提供的最佳酶切反應(yīng)溫度。將酶切回收后的cDNA 片段與pTRV2 進行連接，用T4 DNA ligase 連接酶進行過夜連接。連接產(chǎn)物加于50 μL 剛解凍的Trans-T1感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，置于冰盒中冰浴30 min。42℃水浴鍋中熱激45 s，立即置于冰上2 min。然后加入500 μL 室溫的LB 液體培養(yǎng)基，37℃下200 r／min 孵育1 h。孵育好的菌液取100 μL 涂于篩選平板上（含50 μg／mL kanamycin），37℃倒置培養(yǎng)12～16 h。挑選白色克隆，置于有50 μg／mL kanamycin的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃下200 r／min搖菌4 h，取0.5 μL 菌液用作PCR 反應(yīng)的模板。用156F、156R 正、反向引物鑒定陽性克隆的重組子，并送至公司（華大）進行測序，合適的陽性克隆進行質(zhì)粒提取，用于下一步的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

實驗中使用的本氏煙草幼苗提前1 個月開始準備。首先在培養(yǎng)皿中進行種子萌發(fā)，待種子萌發(fā)后，用鈍頭鑷子移至含有營養(yǎng)土與蛭石（體積比為2∶1）的塑料花盆中，繼續(xù)生長，每個花盆保留1 株苗。植株培養(yǎng)溫度為25℃左右，光照強度120 mol／（m2·s）左右、空氣濕度保持在48%左右，16 h 光照條件下培養(yǎng)。約1 個月后幼苗長出4 片真葉，即可用于農(nóng)桿菌注射。

1.2 學生實驗環(huán)節(jié)

1.2.1 植株培養(yǎng)與農(nóng)桿菌滲入法 用冷凍法將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101 中。將10 μL 的陽性克隆質(zhì)粒加入50 μL 的感受態(tài)農(nóng)桿菌（GV3101）中，置于液氮中將其快速冷凍，再置于37℃的水浴鍋中使其溶解，反復(fù)2 次。然后將含有pTRV1 和pTRV2∶∶探針序列（例如NbGLO1）質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101 分別涂到Y(jié)EB（含50 μg／mL kanamycin 和100 μg／mL rifampicin）平板上，28℃培養(yǎng)。2 d 后，挑選單個克隆于5 mL 的YEB 液體培養(yǎng)基（含50 μg／mL kanamycin 和100 μg／mL rifampicin）中，28℃，250 r／min小搖過夜。將小搖的菌液進一步用156 引物進行檢測，檢測是否為陽性克隆。隨后將小搖過夜的陽性克隆菌液混合于250 mL 的YEB 液體培養(yǎng)基（含50 μg／mL kanamyin，100 μg／mL rifampicin，10 mmol／L MES 和0.2 mmol／L acetosyringone） 中，28℃，250 r／min 大搖。待菌液在600 nm 處OD 值達到2.0 左右時，收集菌液。菌液進一步用滲透緩沖液 （10 mmol／L MgCl2，10 mmol／L MES，200 mmol／L acetosyringone）重懸，并在室溫下孵育3 h，之后將含有pTRV1 和pTRV2∶∶探針序列（例如NbGLO1）質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101 的滲透液按照1∶1 的比例進行混合。然后用1 mL 無針的注射器將混合液注射到4 真葉本氏煙草所有葉子的下表皮中。暗培養(yǎng)2 d，隨后置于光照培養(yǎng)箱，22～25℃、光照強度120 mol／（m2·s）、空氣濕度為48%、16 h 光照條件下培養(yǎng)。

在此實驗過程中，提出問題引導(dǎo)學生思考：為什么冷凍法能進行目的片段的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化？平板上在涂板前為什么要涂相應(yīng)的抗生素？菌液懸浮為什么要用到MgCl2、MES 和acetosyringone 等藥品？轉(zhuǎn)化有pTRV2∶∶目的基因的農(nóng)桿菌為什么還要混合pTRV1 的農(nóng)桿菌？注射農(nóng)桿菌時，為什么要在葉子的下表皮進行注射？

1.2.2 形態(tài)觀察 將VIGS 后的本氏煙草花芽與野生型對照花芽的不同發(fā)育階段置于體視顯微鏡下解剖并拍照，得到花芽與各個花器官的發(fā)育進程與形態(tài)結(jié)構(gòu)。通過形態(tài)觀察，學生理解花器官發(fā)育的過程，思考目的基因（例如NbGLO1）被沉默后，花器官會發(fā)生哪些形態(tài)變異？花器官為什么會發(fā)生形態(tài)變異？從而掌握VIGS 實驗技術(shù)原理與目的基因的功能。

1.2.3 qRT-PCR 分析 VIGS 實驗后，為了檢驗變異花芽中目的基因（例如NbGLO1）的表達量，取本氏煙草花芽為材料（變異花芽與野生型花芽），TRIZOL 法提取總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Premix EX TaqⅡ進行qRT-PCR 分析。用DNAman 軟件設(shè)計目的基因（例如NbGLO1）的特異引物，以Nbactin為內(nèi)參基因。擴增程序為95℃變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)。實驗過程中使用3 次獨立的生物實驗樣本。采用2-△△Ct 法相對定量分析數(shù)據(jù)。在此步驟中應(yīng)讓學生理解qRT-PCR 分析基因表達的目的與意義、定量引物設(shè)計時需要注意的事項、選內(nèi)參基因的意義、實驗設(shè)置對照樣本的原因、用3 次獨立生物學實驗樣本的目的等。最后結(jié)合花芽形態(tài)觀察實驗，讓學生將花芽變異、目的基因表達與目的基因沉默三者有效地聯(lián)系起來，進一步理解實驗的原理與目的，從而達到實驗教學的效果。

2 實驗的實施與效果

植物花器官發(fā)育是植物發(fā)育過程中一個重要時期，實驗結(jié)果與現(xiàn)象明顯有趣。在花器官發(fā)育機理實驗實施過程中，能綜合諸如VIGS 技術(shù)、PCR技術(shù)、植物培養(yǎng)及顯微操作等多項技術(shù)，可于后半學期進行綜合實驗課的開設(shè)，也可于暑假進行暑期特色實驗的開設(shè)。同時可拆分成若干個小實驗，供學生在合適的實驗課時間按部就班地進行實驗。在實驗課的開設(shè)過程中，貫穿以學生為中心的實驗教學理念，采用講解、視頻與操作實驗相結(jié)合的教學方法。教學內(nèi)容主要包括實驗原理、實驗?zāi)康?、實驗步驟、實驗結(jié)果與實驗討論。讓學生盡量親自動手操作實驗，同時讓學生知其然更要知其所以然。

最后根據(jù)學生對實驗原理與每一種藥品在實驗中所起作用的理解，文獻的查閱，對實驗結(jié)果的預(yù)測性，以及對結(jié)果的觀察、描述與解釋等方面，對學生進行實驗考核。通過本次綜合性實驗，既讓學生理解植物花器官發(fā)育的過程與機理，又讓學生掌握將來需要的一些實用實驗技術(shù)，從而充分調(diào)動學生參與實驗教學的積極性和主動性，激發(fā)學生的學習興趣和潛能，同時培養(yǎng)學生獨立思考與自學的能力。

3 思考與結(jié)語

發(fā)育生物學是生命科學領(lǐng)域的一門主流課程，最近20 多年，該學科領(lǐng)域的理論與技術(shù)發(fā)展非常迅速。因此，其實驗課的開設(shè)也應(yīng)與時俱進，不應(yīng)僅停留在胚胎發(fā)育的形態(tài)觀察水平，只有將形態(tài)觀察與分子機理相結(jié)合，才能讓學生體會到自己所學的課程是與目前學科的發(fā)展緊密結(jié)合的，才能讓學生置身于生命科學學科的發(fā)展之中，而不僅僅是一個旁觀者。開設(shè)綜合性實驗，對于培養(yǎng)學生的責任心、增強學生的科研興趣與科研素養(yǎng)等都具有非常重要的意義。