覃雯，成秋宸，卓朗

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023)

染料木素(genistein，GS)化學名為4'，5，7-三羥基異黃酮，廣泛存在于大豆、山豆根、槐角等豆科植物根部，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂等多種生物學活性，且對大多數動物的毒性極低[1-2]，開發(fā)應用前景廣闊。1996年，美國國家腫瘤研究中心已將染料木素列入腫瘤化學預防藥物臨床發(fā)展計劃[3]。目前，國內外已有多種以染料木素為主藥的制劑，包括染料木素膠囊、骨寶昕腎片、血脂康膠囊、染料木素陰道片、痔特佳片等。染料木素可以溶于二甲亞砜(DMSO)、丙酮、乙醇等有機溶劑，但是其在水中溶解度極低，僅為1.43 μg·mL-1[4]，由于受到水溶性的影響，生物利用度極低。

納米藥物是一種將藥物納米化或者將藥物載入納米藥物載體中的一種新型藥物制劑方法，納米藥物可實現藥物的緩控釋性和靶向性，提高藥物溶解性[5]。納米聚合物膠束載體可以是天然化合物或化學合成聚合物，二者均要求具有良好的生物可降解性和安全性[6-8]?；瘜W合成物可根據藥物的性質進行合成設計。聚乙二醇-聚乳酸(polyethylene glycol-polylactic acid，PEG-PLA)是由聚乙二醇(PEG)和聚乳酸(PLA)通過共聚反應生成的一種共聚物，具有親水和親油兩種基團，是一種兩親性化合物。聚合物納米載藥系統(tǒng)是納米載藥系統(tǒng)中的一種，制備方法包括聚合法、溶劑揮發(fā)法、納米沉淀法等。本研究選用共聚物PEG-PLA為染料木素的藥物載體，在溶劑揮發(fā)法的基礎上稍做改進，制備染料木素共聚物納米膠束，以增加其分散性，從而提高其生物利用度。

液體制劑存在易引起化學降解、霉變和體積大等缺點，不利于長期運輸、存儲和攜帶。筆者選用冷凍干燥法制備出染料木素共聚物納米膠束(genistein micellar，GS-ML)凍干粉，以不同凍干保護劑制備的凍干粉外觀、再分散性、復溶后的粒徑和Zeta電位為考察指標，確定凍干保護劑及凍干工藝，以期制備出易于存儲且在水中分散性較好的GS-ML凍干粉。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LGJ-10E型冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器廠有限公司)，Malven ZS90X型馬爾文納米粒度儀(英國Malven公司 )，磁力攪拌器(美國Scilogex公司)，CP224S型萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)，高壓滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，透射電鏡(日本，HTACHI公司，H-7650型)。

1.2藥品與試劑 PEG-PLA(規(guī)格：20 g，含量：90%，PEG封端，PEG 相對分子質量5000，聚消旋乳酸(PLLDA )相對分子質量45 000，PEG：PLLDA=5：95，西安瑞禧生物科技有限公司，批號：RJ017196)，GS(規(guī)格：100 g，含量：98.25%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：ZL140615063YY)，聚山梨酯-80為藥用級(規(guī)格：500 mL，江西益普生藥業(yè)有限公司)，甘露醇、乳糖均為分析純(規(guī)格：500 g，山東西亞化學工業(yè)有限公司)，甘氨酸、肌醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)均為分析純(規(guī)格：500 g，天津市科密歐化學試劑有限公司)，蔗糖為分析純(規(guī)格：500 g，成都金山化學試劑有限公司)、葡萄糖為分析純(規(guī)格：500 g，西隴化工股份有限公司)，丙酮、PEG400均為分析純(規(guī)格：500 mL，天津市大茂試劑廠)，可溶淀粉、山梨醇均為分析純(規(guī)格：500 g，天津市大茂試劑廠)，麥芽糖、右旋糖酐、半乳糖均為分析純(規(guī)格：500 g，合肥志宏生物技術有限公司)，海藻糖為分析純(規(guī)格：500 g，上海麥克林生化科技有限公司)，DMSO、硫酸亞鐵(FeSO4)均為分析純(規(guī)格：500 mL，天津市富宇精細化工有限公司)，過氧化氫(H2O2，規(guī)格：500 mL，含量：30%，成都市科龍化工試劑廠)，水楊酸為分析純(規(guī)格：500 g，天津市博迪化工股份有限公司)，無水乙醇(規(guī)格：2500 mL，成都市科隆化學品有限公司)。

2 方法與結果

2.1實驗方法

2.1.1GS-ML的制備 溶劑揮發(fā)法制備GS-ML[9-12]。分別稱取PEG-PLA 40 mg，GS 5 mg、聚山梨酯-80 165 mg溶于6 mL丙酮中，混勻。將混勻的丙酮混合溶液加入攪拌狀態(tài)的純化水60 mL中，磁力攪拌8 h，揮發(fā)溶液中的丙酮，得到GS-ML。

改良溶劑揮發(fā)法制備GS-ML[9-12]。分別取PEG-PLA 40 mg、GS 5 mg、聚山梨酯-80 165 mg溶于丙酮6 mL中，混勻。將混勻的丙酮混合溶液加入攪拌狀態(tài)的純化水60 mL中，磁力攪拌8 h，揮發(fā)溶液中的丙酮，得到GS-ML混合溶液。參考高壓均質法[13]，用高壓滅菌鍋在溫度121 ℃、0.3 MPa條件下高壓GS-ML混合溶液20 min，冷卻，即得GS-ML。將采用溶劑揮發(fā)法和改良溶劑揮發(fā)法制備的GS-ML靜置，觀察兩種膠束體系的穩(wěn)定性。

稱取適量凍干保護劑加入GS-ML中，混勻，進行預凍和凍干，得到GS-ML凍干粉。

2.1.2染料木素共聚物納米膠束的形態(tài)觀察 取少量染料木素共聚物納米膠束清液于銅網上，晾干后進行透射電鏡測試，電壓為100 kV，放大300 000倍，觀察樣品形態(tài)。

2.1.3凍干保護劑的選擇 ①凍干保護劑種類的初步篩選。按設定程序進行預凍和凍干，分別考察以甘露醇、甘氨酸、蔗糖、乳糖、葡萄糖、PVP、PEG400、可溶淀粉、山梨醇、肌醇、麥芽糖、右旋糖酐、半乳糖、海藻糖為凍干保護劑制備GS-ML凍干粉的凍干效果[14]。同時設立無凍干保護劑的空白對照。分別取各處方凍干樣品，觀察凍干粉的外觀，加入純化水復溶測定凍干粉再分散性，記錄再分散時間，用馬爾文激光納米粒度儀測定凍干樣品粒徑、Zeta電位，初步篩選出凍干效果較好的凍干保護劑。

②凍干保護劑具體用量的確定。通過評價不同濃度凍干保護劑GS-ML凍干粉的凍干效果，確定凍干保護劑的具體用量。

③冷凍干燥的工藝研究。對共聚物納米膠束進行預凍過程參數測定，繪制出物料預凍過程中的物料溫度-時間曲線，以此估計共晶點溫度。樣品升華干燥過程的第一階段溫度必須低于共晶點溫度，通過擱板控溫控制樣品的升華干燥過程，繪制出物料升華干燥過程中的物料溫度-時間曲線。

2.1.4GS-ML凍干粉理化性質考察 ①分散性：取篩選出凍干劑制備的GS-ML凍干粉重新分散于純化水中，觀察GS-ML在水中的分散性。②對羥自由基清除作用：根據Fenton反應原理產生·OH，H2O2的量和Fenton反應產生的·OH量成正比。取GS 10 mg溶于DMSO 200μL或含GS 10 mg的GS-ML凍干粉溶于水200 μL中，分別配置成含1.25，2.5，5，10，20，40，80，160 μg·mL-1GS溶液。吸取60 μL 不同濃度樣品于96孔板中，加入10 mmol·L-1FeSO4溶液60 μL，再加入10 mmol ·L-1水楊酸-乙醇溶液60 μL，最后加入8.8 mmol·L-1H2O220 μL啟動反應。37 ℃反應30 min，以純化水作參比，測定不同樣品在510 nm下的吸光度值[15]。

A0：空白對照液的吸光度；Ax：樣品溶液的吸光度；Ano：不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

2.2實驗結果

2.2.1染料木素共聚物納米膠束的穩(wěn)定性和形態(tài) 將溶劑揮發(fā)法和改良溶劑揮發(fā)法制備的GS-ML靜置觀察。3 d后采用溶劑揮發(fā)法制備的GS-ML出現白色沉淀，改良溶劑揮發(fā)法制備的GS-ML在7 d內為略帶藍光的溶液體系且無明顯沉淀，故選擇改良溶劑揮發(fā)法進行后續(xù)GS-ML制備實驗。

改良溶劑揮發(fā)法制備的GS-ML透射電鏡圖如圖1所示，形態(tài)為一個圓環(huán)狀中空光圈，粒徑約100 nm，大小均勻。

圖1 染料木素共聚物納米膠束透射電鏡圖

Fig.1MorphologyofgenisteinmicelleobservedbyTEM

2.2.2凍干保護劑的選擇 ①凍干保護劑種類的初步篩選：大部分藥物凍干時加入凍干保護劑濃度為4%～25%，凍干樣品以顏色均勻、孔隙致密、保持凍干前體積、性狀基本不變，形成疏松團塊結構為宜[16]。用不同凍干保護劑凍干制備出的GS-ML凍干粉的狀態(tài)和溶解性見表1，粒徑和多分散性指數(polydispersity index,PDI)見表2。初步篩選結果顯示，選用20%蔗糖、20%海藻糖作為凍干保護劑，凍干樣品呈粉餅狀且樣品平整飽滿，粒徑約200 nm，PDI<0.3，再分散時間<30 s，凍干效果較好，初步確定蔗糖和海藻糖可作為GS-ML的凍干保護劑。

表1 GS-ML凍干保護劑的初步篩選

Tab.1ThepreliminaryscreeningofcryoprotectantforGS-MLn=3

保護劑凍干樣品狀態(tài)再分散時間/s空白不符合要求不符合要求20%海藻糖呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷1020%甘氨酸呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷1010%乳糖呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷1020%蔗糖呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷3020%甘露醇呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷3020%麥芽糖呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷3010%PVP呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷6020%葡萄糖呈白色,有大量孔隙6020%PEG400不符合要求1020%山梨醇不符合要求3010%肌醇呈白色,粉餅狀,飽滿,無塌陷不符合要求20%半乳糖呈白色,有大量孔隙不符合要求20%右旋糖呈白色,有大量孔隙不符合要求10%可溶淀粉不符合要求不符合要求

表2 GS-ML凍干粉的粒徑及PDI

Tab.2ParticlesizeandPDIofGS-MLlyophilizedpowder

不同保護劑制備的GS-ML凍干粉粒徑/nmPDI20%海藻糖226.10±32.420.110±0.03420%甘氨酸1 095.40±342.370.209±0.13010%乳糖660.27±52.810.219±0.15120%蔗糖234.43±17.180.210±0.07320%甘露醇351.97±44.440.353±0.05920%麥芽糖696.83±127.780.154±0.13210%PVP1 281.90±580.080.190±0.09820%葡萄糖243.27±11.640.162±0.00920%PEG400258.77±112.120.296±0.10420%山梨醇644.63±25.830.390±0.091

②凍干保護劑具體用量的確定：分別以5%，10%，20%，30%蔗糖或海藻糖為凍干保護劑凍干GS-ML，確定兩種凍干保護劑的具體用量。以不同濃度蔗糖或海藻糖為凍干保護劑制備凍干樣品的再分散性及PDI值見表3，粒徑和Zeta電位見圖2。不同濃度蔗糖為凍干保護劑再分散后的粒徑差異有統(tǒng)計學意義(F=38.39，P<0.01)；Zeta電位差異有統(tǒng)計學意義(F=10.18，P<0.01)。不同濃度海藻糖為凍干保護劑再分散后的Zeta電位差異有統(tǒng)計學意義(F=10.87，P<0.01)。未凍干GS-ML溶液和以5%蔗糖為凍干保護劑再分散后粒徑分布見圖3，4。結果顯示，選擇5%蔗糖作為凍干保護劑的凍干樣品凍干效果較好，確定5%蔗糖為GS-ML的凍干保護劑。

表3 蔗糖或海藻糖為凍干保護劑的再分散性及PDI值

凍干保護劑再分散時間PDI蔗糖 5%++0.119±0.006 10%++0.175±0.049 20%+0.210±0.073 30%+0.388±0.067海藻糖 5%++0.123±0.043 10%++0.110±0.009 20%++0.110±0.035 30%+0.104±0.041

+：30 s內溶解完全；++：10 s內溶解完全。

+：Completely dissolved in 30 s；++：Completely dissolved in 10 s.

2.2.3冷凍干燥的工藝研究 ①預凍階段：凍結過程的降溫速率對凍干樣品的性質有較大影響，樣品降溫速率越快，晶核越多結晶越小，凍干產品結構均一且細膩。預凍過程中若樣品不完全凍結，升華干燥過程會出現噴瓶現象，預凍時必須在共晶點以下保持2～3 h[12]。將樣品置于-60 ℃冷肼中預凍，對共聚物納米膠束進行預凍過程參數測定，繪制出冷凍干燥機物料溫度-時間曲線，如圖5所示，樣品在約-7 ℃出現了溫度回升，提示該樣品的最低共晶點區(qū)間在約-7 ℃。預凍時間設置為5 h，樣品完全凍結，溫度達到-50 ℃，升華干燥過程不出現噴瓶的現象。

②升華干燥階段：冷凍干燥機通過擱板控溫進行樣品的升華干燥。升華階段設定為-35 ℃，升溫1 min，恒定2 h；-33 ℃，升溫1 min，恒定5 h；-30 ℃，升溫1 min，恒定5 h；0 ℃，升溫1 min，恒定2 h；25 ℃，升溫1 min，恒定2 h。樣品升華過程中物料溫度-時間曲線，如圖6所示。升華干燥16 h后，樣品達到17 ℃，升華干燥階段結束。

①與含5%凍干保護劑組比較，P<0.05；②與含5%凍干保護劑組比較，P<0.01。

①Comparison with 5% cryoprotectant,P<0.05；②Comparison with 5% cryoprotectant,P<0.01.

圖3 未凍干GS-ML粒徑分布圖

Fig.3ParticlesizedistributionofGS-MLwithoutfreeze-drying

圖4 以5%蔗糖為凍干保護劑再分散后GS-ML粒徑分布圖

Fig.4ParticlesizedistributionofGS-MLwith5%sucroseascryoprotectantafterredispersion

圖5 冷凍干燥機預凍階段物料溫度-時間曲線

Fig.5Materialtemperature-timecurveoffreezedryingatpre-freezingstage

圖6 冷凍干燥機升華干燥階段物料溫度-時間曲線

Fig.6Materialtemperature-timecurveoffreezedryingatsublimationstage

2.2.4GS-ML凍干粉理化性質考察 ①分散性：取GS-ML凍干粉0.2 g，加入純化水500 μL，得到略帶淡藍色乳光的膠束體系，靜置后不分層，體系中GS含量達到333.32 μg·mL-1。

②羥自由基清除作用：含不同濃度GS的單體和GS-ML凍干粉的羥自由基清除率如圖7所示。結果顯示，GS濃度在1.25～80 μg·mL-1范圍內，GS-ML凍干粉的羥自由基隨著體系中GS濃度的升高清除率逐漸增強；而GS單體的羥自由基清除率隨著濃度的增加先增大后減小。

3 討論

GS是一種具有抗氧化性和較好穩(wěn)定性的異黃酮類化合物，由于溶解性差使其生物利用度極低[4，17-19]。共聚物聚己內酯-聚乙二醇(PEG-PCL)和中鏈三酰甘油曾被作為GS的藥物載體，PEG-PLA也曾作為表沒食子兒茶素沒食子酸的藥物載體，提高了表沒食子兒茶素沒食子酸的藥效[4]。借鑒此思路制備GS納米乳，可提高GS的溶解性、緩控釋性，解決了GS生物利用度低的問題[20]。溶劑揮發(fā)法是將聚合物和藥物溶于有機溶劑中，加入含有表面活性劑的溶液中，通過連續(xù)攪拌等方式把有機溶劑揮發(fā)除去。但此法制備出的納米膠束通常粒徑不夠均勻，且膠束體系不穩(wěn)定。本研究在溶劑揮發(fā)法的基礎上稍作修改，增加類似于均質化過程的高壓步驟，制備出了尺寸均勻、粒徑達納米級的GS-ML。

①與GS比較，P<0.01。

①Compared with GS，P<0.01.

納米膠束系統(tǒng)具有熱力學不穩(wěn)定性的特點，為實現納米制劑的長期保存，可選用冷凍干燥法進行凍干。研究表明，冷凍干燥法是通過升華作用實現樣品干燥的，但在冷凍干燥過程中由于易使樣品樣品發(fā)生團聚，加入凍干保護劑可避免樣品發(fā)生團聚而保持其物理化學性質[21]。本研究中，不加凍干保護劑的空白樣品由于沒有凍干保護劑的支撐保護作用，樣品凍干后聚集、萎縮、呈膜狀，無法在純化水中再分散。加入凍干保護劑的樣品在納米膠束之間形成空間保護層，可維持納米膠束的空間結構，從而起到了防止GS-ML團聚的作用。研究發(fā)現不同類型的凍干保護劑對凍干的影響很大，可能與不同類型糖基與共聚物及藥物之間的相互作用有關。凍干保護劑蔗糖的用量對GS-ML凍干粉凍干狀態(tài)、再分散效果及粒徑大小有較大影響，加入更多的蔗糖并不能提高GS-ML的穩(wěn)定性，反而使得GS-ML更易聚集在一起，形成膠束之間的黏連。預凍過程中，在初步確定了共聚物膠束共晶點范圍的基礎上，建立了共聚物膠束凍干工藝曲線。凍干過程通過擱板控溫進行樣品的升華干燥，實現的樣品凍干過程不出現噴瓶現象，得到符合凍干制劑外觀要求的樣品。

分散性實驗結果顯示，體系中GS含量達到333.32 μg·mL-1，是文獻報道的GS在水中溶解度1.43 μg·mL-1的233倍，GS-ML體系顯著提高GS在水溶液體系中的含量。GS-ML凍干粉在水溶液體系中分散性好，粒徑也較小，隨著加入量的增多并不會聚集成大顆粒；而GS在水中的溶解度比較低，加入量越多使得GS單體聚集成大顆粒，影響GS的生物利用度，從而降低了GS單體的羥自由基清除率。

在此凍干保護劑和凍干工藝的基礎上制備出的凍干粉粒徑及Zeta電位變化較小，且大大提高了GS的溶解度，增強GS的體外羥自由基清除率，該工藝可以較大程度發(fā)揮GS的生物學效應，為深入探討GS的生物學機制奠定基礎。