袁濤，文坤明

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是發(fā)病率及致死率均較高的惡性腫瘤，2018年全球癌癥統(tǒng)計數據顯示，全球結直腸癌發(fā)病率在男性、女性惡性腫瘤中分別位列第3位和第2位，死亡率在男性、女性惡性腫瘤中分別位列第4位和第3位［1］。盡管手術方式、放化療技術的改進使結直腸癌患者的生存率有所提高，但目前結直腸癌的總體生存率仍不滿意。最新數據顯示結直腸癌的5年總生存率僅為65%，而Ⅳ期患者5年生存率僅12%［2-3］。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中存在的一小部分特殊的細胞亞群，既具有自我更新、多向分化和無限增殖的能力，又表現出腫瘤細胞的特點，它是惡性腫瘤復發(fā)、轉移及耐藥的根本原因［4］。近來研究表明微小核糖核酸（microRNAs）在維持結直腸癌CSCs的自我更新、耐藥等干細胞特性方面發(fā)揮著重要作用［5］。microRNAs作為今后靶向藥物作用位點以及新型腫瘤標志物的潛質得到了大量研究者的關注。本文就microRNAs在調控結直腸癌CSCs信號通路中的作用機制綜述如下。

1 microRNAs的合成途徑及生物學作用機制

microRNAs是一類長度約為18～25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA，它由DNA轉錄產生，不直接參與編碼蛋白質，但卻可以通過RNA誘導的沉默復合體（RISC），在轉錄后對靶基因的表達實施調控［6］。microRNA的生物合成主要包括以下步驟［7-9］：首先在細胞核內microRNA基因經過RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成初級轉錄產物pri-microRNA即原始microRNA，之后由Drosha（一種核糖核酸酶Ⅲ）與DGCR8（一種雙鏈RNA結合蛋白）一起構成蛋白復合體對pri-microRNA進行加工、剪切，形成含60～100個核苷酸且具有發(fā)夾結構的pre-microRNA即前體microRNA，接著在Ras相關核蛋白GTP酶（Ran-GTP）和轉運蛋白Exporting-5共同作用下，由細胞核轉運到細胞質中，最后在細胞質中Dice酶（一種核糖核酸酶Ⅲ）識別pre-microRNA的雙鏈部分并將其莖環(huán)基部的兩圈螺旋解開，Dicer酶對兩條鏈進行切割形成含有22個核苷酸的microRNA雙鏈體，其中一條與RISC結合形成成熟的microRNA，另一條互補鏈則被降解。microRNAs 5′端第2～7個核苷酸與目的基因3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）結合的部位稱為種子序列。microRNAs可以通過降解或抑制目的基因翻譯兩種途徑參與轉錄后調控，但對目的基因具體所起的作用，還要取決于microRNAs 5′端與靶基因mRNA 3′-UTP堿基互補配對程度。當microRNAs 5′端與靶基因mRNA 3′-UTP完全配對時，靶基因mRNA被Argonaute（AGO）蛋白的核酸內切酶降解。但大多數情況下microRNAs 5′端與目的基因mRNA 3′-UTP不完全配對，而是主要通過抑制目的基因mRNA翻譯調控基因轉錄過程［10］。

2 microRNAs在調控結直腸癌CSCs相關信號通路中的作用

越來越多的證據表明，microRNAs可以通過CSCs相關信號通路對結直腸癌CSCs起調控作用［11］。這些通路主要包括Wnt/β-catenin［12］、Notch［13］、JAK/STAT3［14］、Hedgehog（HH）［15］、上皮間質轉化（EMT）［16］等。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路研究表明Wnt信號通路對腸道干細胞的存活和腸道內環(huán)境的穩(wěn)定至關重要，而其中Wnt/β-catenin信號通路在約90%的結直腸癌中發(fā)生突變，這些突變主要存在于大腸腺瘤性息肉?。ˋPC）和β-catenin基因中［17-18］。Wnt/βcatenin信號通路不僅在細胞增殖、分化，調節(jié)組織的動態(tài)平衡和自我更新方面起關鍵作用，對于維持CSC的自我更新和治療抵抗也起重要作用［17］。Yu等［19］通過研究發(fā)現，相較于結腸癌親本細胞（HCT-116和HT-29），miR-21在 結 腸 癌CSCs（HCT-116CSCs和HT-29CSCs）中表達明顯上調；同時在結腸癌細胞（HCT-116）中過表達miR-21增加了結腸CSCs的比例，結腸CSCs的自我更新能力提高了60%～80%。進一步研究表明過表達miR-21可通過靶向調控轉化生長因子β受體Ⅱ（TGFBR2）抑制表達，而TGFBR2的下調導致Wnt/β-catenin信號通路、T細胞特異性轉錄因子/淋巴增強因子結合因子的激活，并增加下游靶基因c-Myc和cyclin-D1的表達，從而在結腸CSCs調節(jié)中發(fā)揮重要作用。Jiang等［20］研究發(fā)現miR-30-5p在結直腸癌組織和CD133+CRC細胞中表達下調，而過表達miR-30-5p則明顯降低了CD133+CRC細胞干細胞標志物（CD133和Sox2）的表達和成球能力，進一步研究表明miR-30-5p通過靶向調控Wnt/β-catenin靶基因（Axin2和myc）的表達而抑制結直腸癌CSCs的特性和耐藥性。但Axin2和myc與miR-30-5p作用機制仍有待進一步研究。上述研究表明microRNAs可以通過靶向調控Wnt/β-catenin信號通路從而參與結直腸癌CSCs的調控，這部分microRNAs有望成為結直腸癌治療的潛在靶點。

2.2 Notch信號通路Notch基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，調節(jié)多種生物細胞的生長發(fā)育、凋亡、增殖及細胞邊界的形成，同時能夠促進不同類型的癌癥進展［21］。在正常干細胞中，Notch通路是不對稱分裂的關鍵調節(jié)因子，與正常干細胞的情況類似，干擾不對稱分裂可以改變CSCs自我更新和分化之間的平衡，并影響腫瘤生長［22］。大量研究表明Notch信號在多種CSCs中過度激活，已證實Notch的激活突變與結直腸癌［13］、乳腺癌［23］、肺癌［24］CSCs表型的獲得及自我更新有關。Jin等［25］發(fā)現miR-195-5p在32例結直腸癌組織中表達明顯下調，通過結直腸癌細胞系（SW620和HT29）在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)出SW620 CSCs和HT29 CSCs，發(fā)現過表達miR-195-5p后CSCs標志物（CD133和Sox2）表達下調、成球能力減弱、裸鼠體內成瘤能力下降，進一步研究發(fā)現miR-195-5p直接靶向調控Notch信號蛋白（Notch2和RBPJ）的3′UTR，抑制CSCs的干性和腫瘤生長。Bu等［26］通過從新鮮結腸癌組織中培養(yǎng)出CSCs，實時熒光定量PCR（qPCR）證實結腸癌CSCs中miR-34a表達下調，進一步研究發(fā)現miR-34a充當Notch信號通路的切換開關，即miR-34a通過靶向Notch信號通路調節(jié)結腸癌CSC自我更新和腫瘤形成。Bu等［27］發(fā)現miR-34a可通過與Notch1和Numb（一種抑癌基因）mRNA的3′UTR結合來抑制Notch1和Numb翻譯，Numb則通過促進Notch1的內吞和降解來抑制Notch1，即miR-34a、Numb和Notch1形成不連貫的前反饋回路，調節(jié)小腸和結腸癌中的不對稱干細胞分裂。以上研究表明microRNAs可以通過靶向Notch通路干擾結直腸癌CSCs的不對稱分裂，進而調控結直腸癌CSCs的自我更新。

2.3 JAK/STAT3信號通路Janus激酶信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路最初是在干擾素（IFN）-α、IFN-γ和白細胞介素-6（IL-6）介導的下游信號通路中發(fā)現的［28］。已證實JAK/STAT3在包括CRC在內的多種腫瘤中過度激活［29］。在STAT蛋白家族的7個成員中，STAT3對促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤為重要，是腫瘤治療最有前途的新靶點之一。目前研究認為STAT3信號通路在調控CSCs的自我更新中起重要作用［30］。有研究表明microRNAs可以通過直接靶向或通過STAT3上游或下游的靶基因激活STAT3信號通路［31］。Ren等［14］發(fā)現miR-196b-5p在大腸癌組織中表達顯著上調并且與大腸癌患者的預后不良有關，結直腸癌細胞系（SW480和HT116）過表達miR-196b-5p后，上述結直腸癌細胞的成球能力增強、側群細胞（SP細胞）比例增加、干細胞因子（NANOG、BMI-1、OCT4和Sox2）的表達上調；沉默miR-196b-5p后上述指標變化趨勢則相反；進一步研究表明miR-196b-5p通過靶向調控STAT3信號通路的負調控因子SOCS1和SOCS3，激活STAT3信號通路，從而促進CRC細胞的干性和對5-氟尿嘧啶的耐藥性。

2.4 HH信號通路自從在果蠅中首次發(fā)現HH信號通路以來，HH信號通路受到了廣泛的關注［32］。目前研究已證實HH信號通路與細胞生長分化密切相關，不僅在內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、干細胞調控、組織再生方面發(fā)揮重要作用，而且在多種腫瘤組織與細胞系中異常激活并參與腫瘤的增殖分化、細胞凋亡、血管生成、侵襲轉移和CSC的維持［33］。microRNAs通過HH通路調控結直腸癌CSCs，可能與microRNAs參與調控與細胞分化相關的信號通路有關。Wang等［34］利用腫瘤基因圖譜數據分析發(fā)現miR-372/373在607例CRC患者癌組織中表達上調，進一步研究發(fā)現過表達miR-372/373可通過增加結直腸癌CSC標志物陽性細胞（CD24+CRC、CD26+CRC、CD44+CRC和CD133+CRC）的比率而增強結直腸癌CSCs的特性，表現為自我更新、化療耐藥性以及侵襲能力的增強。為了研究miR-372/373誘導干性的機制，Wang等［34］通過細胞信號通路分析發(fā)現，當過表達miR-372/373后，與CRC干性相關的HH通路表達上調；而與分化相關的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK/Erk）通路和維生素D相關受體（VDR）通路等則被miR372/373明顯抑制，提示miR-372/373通過抑制分化基因的表達來增強CRC的干性，該研究為結直腸癌靶向治療提供了新的思路，然而關于HH通路和分化相關的信號通路仍然知之甚少，需要更深入的研究。

2.5 EMT EMT過程不僅參與腫瘤轉移，而且與CSCs特性的獲得與保持也密切相關，經歷EMT的腫瘤細胞可以獲得CSCs特性。大量研究發(fā)現在多種上皮腫瘤細胞內過表達EMT啟動子（Twist1或Snail）激活EMT后，腫瘤細胞出現了多種CSC特性，包括CSC特異性細胞表面標志物表達的升高、懸浮培養(yǎng)腫瘤細胞成球能力的增加、小鼠體內致瘤能力的增加［35-36］。有研究認為，EMT激活后癌細胞分泌蛋白譜發(fā)生改變，導致其建立了自分泌信號通路，這有助于腫瘤細胞干性的出現［37］。Zhu等［16］通過建立穩(wěn)定過表達Snail（EMT轉錄因子）的結直腸癌細胞系（DLD1-Snail和HCT116-Snail），發(fā)現其干細胞特性增強，同時產生了放療抵抗，通過miR-145啟動子熒光素酶實驗還發(fā)現Snail可以結合miR-145啟動子的核心序列并抑制miR-145表達，反之，過表達miR-145則逆轉了Snail介導的干細胞特性并恢復癌細胞對放療的敏感性。Ning等［38］研究證實miR-147在結腸癌細胞中表達下調，進一步在CRC細胞系（HCT116和SW480）中過表達miR-147后發(fā)現EMT過程被抑制，表現為上皮標志物E鈣蛋白表達升高，間質標志物纖維連接蛋白和波形蛋白表達降低，同時CSC標志物（OCT4、Sox2和NANOG）的表達下調，經EMT誘導劑轉化生長因子β1（TGF-β1）激活EMT后，上述指標變化趨勢相反，表明過表達miR-147通過抑制EMT過程進而抑制CRC的CSCs特性。以上研究結果表明microRNAs可以通過靶向調控EMT過程在調控結直腸CSCs中發(fā)揮作用。盡管CSCs與EMT的相關性在大量研究中得到證實，但具體的分子機制仍不清楚，仍需要更深層次的研究。

3 小結與展望

盡管大量研究表明microRNAs通過靶向不同的信號通路及EMT調控結腸CSCs的干性。但關于microRNAs的具體功能和調控結直腸癌CSCs詳細機制仍不清楚。目前以microRNAs為靶點治療結直腸癌研究的實驗對象多基于離體細胞，尚缺乏足夠的臨床研究數據。因此，仍需大量的動物實驗和臨床研究驗證體外試驗的結果。已知的與結直腸癌CSCs相關的microRNAs較多，如何篩選及驗證與結直腸癌CSCs確切相關的microRNAs，以及是否能結合其他預測指標，建立預測模型和microRNAs在結直腸癌CSCs的表達譜，用于指導臨床上個體化治療，都是亟待解決的問題，故需要更加優(yōu)良的實驗設計來進一步研究。開發(fā)專門針對結直腸癌CSCs的治療方法仍任重而道遠。