戰(zhàn)帥帥，嚴(yán)勇亮，劉鑫源，王麗麗，耿洪偉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，新疆烏魯木齊 830091)

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一。不同傳統(tǒng)食品如面條、餃子、饅頭等對小麥面粉品質(zhì)具有不同的要求，品質(zhì)改良已成為小麥遺傳改良的重要內(nèi)容[1]。阿拉伯木聚糖(arabinoxylan，AX)是小麥中重要的親水性非淀粉多糖，雖然含量較低 (2.3%～6.8%)[2]，但可通過阿魏酰阿拉伯木聚糖(feruloyl arabinoxylan，F(xiàn)AX)結(jié)構(gòu)中的阿魏?；趸宦?lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)[3]，進(jìn)而影響小麥的加工品質(zhì)(面筋含量、面粉的水分和吸水性)[4]，另外，AX還具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗氧化[6]、促進(jìn)膳食[7]和腸道益生菌特異性增殖[8]等生物活性作用。AX的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對其功能有重要影響，而FAX含量高低是決定小麥AX結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的關(guān)鍵因素[9]。利用功能標(biāo)記對新疆小麥進(jìn)行等位變異檢測，揭示FAX含量相關(guān)基因在不同小麥品種(系)中的遺傳變異規(guī)律，可為小麥分子育種改良提供一定參考。

有關(guān)FAX的研究已由性能方面逐步向基因挖掘?qū)用嫔钊胙芯縖9]。國內(nèi)外研究指出，小麥FAX由植物特有的BAHD家族的阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基轉(zhuǎn)移酶(arabinoxylan feruloyl transferase，AFT)催化合成[9]。張岐軍等[10]認(rèn)為基因型是影響水溶性阿拉伯木聚糖含量的主要因素，基因型和環(huán)境互作影響不顯著。目前，利用不同小麥群體對AX和FAX含量性狀進(jìn)行全基因連鎖分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies，GWAS)已有相關(guān)報(bào)道[11]。 Nguyen等[12]利用雙單倍體(doubled haploid，DH)群體在2A和4D染色體上檢測到與AX含量相關(guān)的兩個主要的數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci，QTL)。呂文娟等[13]利用周麥16/藁城8901的176個重組自交系(recombinant inbred lines，RIL)群體，使用90 K的iSelect基因芯片對FAX含量進(jìn)行全基因組連鎖分析，檢測到5個在多個環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的QTL，分別位于2AS、2BS、2DL、3AS和6AS染色體上，其中在3A染色體上發(fā)現(xiàn)的QFax.xjau-3AS上可解釋最大的表型變異(18.2%)。Zhan等[14]分別以166份黃淮冬麥區(qū)和90份北部冬麥區(qū)品種(系)為材料，分別利用小麥90 K SNP 芯片的18 189 和13 198 個高質(zhì)量SNP標(biāo)記，對FAX含量進(jìn)行GWAS，其中，在黃淮冬麥區(qū)材料中共檢測到83個與FAX含量顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記(P<0.001)，在北部冬麥區(qū)材料中共檢測到33個與FAX含量顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記(P<0.001)，并利用距QFax.xjau-3AS最近的SNP標(biāo)記進(jìn)行檢測，驗(yàn)證了小麥第3同源染色體組上存在調(diào)控FAX含量的主效 基因。

迄今為止，大麥(HordeumvulgareL.)、水稻(OryzasativaL.)和普通小麥(TriticumaestivumL.)的AFT基因已被克隆[15-16]。戰(zhàn)帥帥等[16]應(yīng)用FR846233為探針，克隆了3A染色體上的TaBahd-A1基因，并基于該基因的SNP位點(diǎn)，開發(fā)了2個互補(bǔ)顯性標(biāo)記AFTA2和AFTB2，用于分辨等位變異TaBahd-A1a(與高FAX含量相關(guān))和TaBahd-A1b(與低FAX含量相關(guān))。Geng等(待發(fā)表)從4個RIL群體的8個親本中發(fā)現(xiàn)了TaBahd-A1基因的新的等位變異類型TaBahd-A1c，并開發(fā)了功能標(biāo)記AFTC8，用于分辨等位變異TaBahd-A1c(與高FAX含量相關(guān))。

目前尚無新疆小麥FAX含量相關(guān)基因等位變異檢測的報(bào)道。因此，本研究利用TaBahd-A1基因位點(diǎn)已開發(fā)的功能標(biāo)記AFTA2、AFTB2和AFTC8對新疆冬小麥進(jìn)行等位變異分子檢測，明確TaBahd-A1位點(diǎn)的等位變異在新疆冬小麥材料中的分布，以期為新疆小麥品質(zhì)遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為124份新疆小麥品種(系)，其中98份為冬小麥品種(系)，包含自育品種(系)43份，引進(jìn)品種(系)38份，地方品種17份；26份為新疆春小麥品種(系)，全部為自育品種(系)。上述材料包含了新疆麥區(qū)不同時期主要種植品種(系)和骨干親本及選育的品種，具有很好的代表性。2018-2019年度種植于新疆瑪納斯試驗(yàn)基地，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，3行區(qū)，行長2 m，行距25 cm，田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培管理方式，小麥田間長勢良好，正常收獲，無倒伏和穗發(fā)芽現(xiàn)象。全部材料均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種課題組收集。

1.2 小麥基因組DNA的提取

參考Zhan等[14]的方法，采取酚氯仿抽提法進(jìn)行小麥DNA提取，試劑取用量略加改良。

1.3 PCR擴(kuò)增與檢測

1.3.1 檢測引物

利用戰(zhàn)帥帥等[16]開發(fā)的顯性互補(bǔ)標(biāo)記AFTA2、AFTB2及Geng等(待發(fā)表)開發(fā)的標(biāo)記AFTC8對新疆小麥材料3A染色體上TaBahd-A1位點(diǎn)進(jìn)行等位變異檢測。PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段大小以及引物序列等相關(guān)信息詳見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 TaBahd-A1基因等位變異引物序列、擴(kuò)增片段

1.3.2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

以小麥基因組DNA為模板，在MJ Research PTC-200 PCR儀上進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括Taq DNA polymerase(2.5 U· μL-1)0.25 μL，上、下游引物(4 μmol·L-1)各1.0 μL，dNTP(2.5 μmol·L-1)1 μL，10×Loading Buffer 2.5 μL，然后用水補(bǔ)充至25 μL。所有試劑均購于北京天根生化科技公司。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度如表1所示，退火50 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

利用1.2%的瓊脂糖凝膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，電泳時所采用的緩沖液體系為 1×TAE溶液，120 V電壓電泳30～40 min， 0.5%的溴化乙錠(EB)染色15 min，蒸餾水漂洗后平鋪在VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)上，拍照并保存到計(jì)算機(jī)中。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

對124份新疆小麥品種進(jìn)行編號，根據(jù)每個小麥品種(系)3粒種子基因組DNA的檢測結(jié)果，判斷該品種的TaBahd-A1位點(diǎn)等位變異類型，選擇PCR產(chǎn)物條帶明晰、單一且符合目標(biāo)條帶位置的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，若結(jié)果不一致，需重新提取該品種的其余籽粒DNA，并重新檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆小麥品種的 TaBahd-A1等位變異類型

AFTB2在攜帶等位變異TaBahd-A1b的材料(阿克庫孜蓋、白冬麥、熱衣木夏、早洋麥和新冬22號)中能擴(kuò)增出438 bp的片段，而在其他材料中不能擴(kuò)增出該片段(圖1)。AFTA2在攜帶等位變異TaBahd-A1a的材料(納瓦提然、綏來小紅冬麥、紅旗1號、新冬41號和新冬5號)中能擴(kuò)增出692 bp的片段，而在其他材料中不能擴(kuò)增出該片段(圖2)。AFTC8在攜帶等位變異TaBahd-A1c的材料(北京7號、拉瓦得朗、新冬17號、新冬20號、新春22、伊農(nóng)16、昌冬5號和喀冬4號)中能擴(kuò)增出782 bp的片段，而在其他材料中不能擴(kuò)增出該片段(圖3)。

M：Marker DL2000；1：阿克庫孜蓋；2：白冬麥；3：熱衣木夏；4：早洋麥；5：新冬22號；6：納瓦提然；7：綏來小紅冬麥；8：紅旗1號；9：新冬41號；10：新冬5號。下同。

圖2 功能標(biāo)記AFTA2對10種材料的多態(tài)性檢測

M：Marker DL 2000；1：北京6號；2：北京7號；3：新冬15；4：拉瓦得朗；5：新冬17號；6：新冬20號；7：新春22；8：伊農(nóng)16；9：昌冬5號；10：喀冬4號。

2.2 不同類型新疆小麥品種中 TaBahd-A1基因等位變異的分布頻率

通過對TaBahd-A1基因等位變異在冬小麥品種(系)和春小麥品種(系)的頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表2～4)發(fā)現(xiàn)，124份新疆小麥品種(系)中，17份材料攜帶與高FAX含量相關(guān)的TaBahd-A1a等位變異基因，占13.7%;71份材料攜帶與低FAX含量相關(guān)的TaBahd-A1b等位變異基因，占57.2%；36份材料攜帶與高FAX含量相關(guān)的TaBahd-A1c等位變異基因，占29.1%。98份冬小麥品種(系)中，攜帶TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異的材料占比分別為12.2%和26.5%；攜帶TaBahd-A1b等位變異的材料占比61.3%。在26份新疆春小麥品種(系)中，攜帶TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異的材料占比分別為 19.2%和42.3%；攜帶TaBahd-A1b等位變異的材料占比38.4%。在不同類型冬小麥品種(系)中，TaBahd-A1a等位變異的分布頻率表現(xiàn)為引進(jìn)品種(系)>地方品種>自育品種(系)，TaBahd-A1b等位變異的分布頻率表現(xiàn)為自育品種(系)>地方品種>引進(jìn)品種(系)，TaBahd-A1c等位變異的分布頻率表現(xiàn)為自育品種(系)>引進(jìn)品種(系)>地方品種。

表2 新疆春小麥品種(系)的 TaBahd-A1基因型

3 討 論

3.1 功能標(biāo)記的選擇

選用快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的分子標(biāo)記是加速小麥品質(zhì)改良的有效手段[17]。近幾年功能標(biāo)記在小麥品質(zhì)[18]、穗發(fā)芽[19]、產(chǎn)量[20]、抗旱[21]等方面作為輔助分子育種的有效手段，已逐漸成為研究熱點(diǎn)。戰(zhàn)帥帥等[16]選用與FAX含量相關(guān)的基因特異性分子標(biāo)記AFTA2和AFTB2，利用中國春缺體-四體系將其定位于3A染色體上，并利用功能標(biāo)記AFTA2 和 AFTB2對253份國內(nèi)外冬小麥品種(系)材料進(jìn)行檢測，表明不同基因型間FAX含量的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，驗(yàn)證了標(biāo)記的實(shí)用性[16]。而中國春缺體-四體系是小麥遺傳研究學(xué)珍貴的科研資源，過去十幾年時間內(nèi)，定位了許多基因的染色體物理位置[22]。Hessler等[22]將硬粒小麥的LOX基因定位于4BS染色體上。Geng等[23]將普通小麥TaPod-D1基因開發(fā)的功能標(biāo)記定位于7D染色體上。同樣，Geng等(待發(fā)表)將開發(fā)的標(biāo)記AFTC8定位于3AL染色體上，用于新等位變異TaBahd-A1c的檢測。FAX含量是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，呂文娟等[13]研究表明，位于3A染色體上的QFax.xjau-3AS可解釋的表型變異最大，因此，本研究選用此位點(diǎn)所開發(fā)的功能標(biāo)記對新疆小麥品種(系)進(jìn)行等位變異檢測，為高面筋含量新疆小麥品種的選育提供一定依據(jù)。下一步將繼續(xù)挖掘3B、3D染色體上的相關(guān)功能標(biāo)記，通過多基因分子標(biāo)記組合檢測，提高輔助育種選擇的準(zhǔn)確性。

表3 新疆冬小麥品種(系)的 TaBahd-A1基因型

(續(xù)表3 Continued table 3)

表4 新疆小麥品種 TaBahd-A1基因等位變異檢測及分布規(guī)律

3.2 不同類型新疆小麥品種中 TaBahd-A1等位變異的分布規(guī)律

本研究發(fā)現(xiàn)，98份新疆冬小麥品種(系)中，攜帶與高FAX含量相關(guān)的等位變異類型TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的材料占比分別為12.2%和26.5%，而攜帶與低FAX含量相關(guān)的等位變異TaBahd-A1b的材料有60份，占 61.3%，表明新疆冬小麥材料中，TaBahd-A1b型占主導(dǎo)地位，可能是新疆地區(qū)對小麥阿拉伯木聚糖關(guān)注度不高，F(xiàn)AX含量對小麥品質(zhì)方面研究起步較晚造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，26份新疆春小麥品種(系)中，攜帶與高FAX含量相關(guān)的等位變異類型TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的材料占比分別為19.2%和42.3%，而含有與低FAX含量相關(guān)的等位變異類型TaBahd-A1b占比為38.4%。白 璐等[24]利用新疆春小麥材料對TaLox-B1位點(diǎn)進(jìn)行檢測，表明早期品種均為優(yōu)異等位變異的材料，其分布頻率遠(yuǎn)高于晚期品種。因此，推測本研究所使用的春小麥材料可能包含較多的早期品種，是TaBahd-A1c基因型的材料分布頻率較高的原因之一。因此，通過選擇具有TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異基因的小麥品種(系)，有助于小麥品質(zhì)性狀的遺傳改良。

新疆自育和外引品種與地方品種間均存在明顯的遺傳差異。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型冬小麥品種(系)中，與高FAX含量相關(guān)的TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的分布頻率表現(xiàn)為引進(jìn)品種(系)>地方品種>自育品種(系)；與低FAX含量相關(guān)的TaBahd-A1b的分布頻率表現(xiàn)為自育品種(系)>地方品種>引進(jìn)品種(系)。這可能與新疆小麥品種(系)的演變有關(guān)，早期的地方品種在后期被有選擇性的引進(jìn)品種所取代，引進(jìn)品種在長期的選育中，逐漸積累具有與高FAX含量相關(guān)的優(yōu)異等位變異。因此，在新疆小麥品種(系)育種中，通過選擇具有TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異基因的引進(jìn)小麥品種(系)，可以選育出高FAX含量的小麥品種。

3.3 不同麥區(qū) TaBahd-A1等位變異的分布規(guī)律

新疆冬麥區(qū)的小麥與其他冬麥區(qū)小麥相比，其優(yōu)異等位變異TaBahd-A1a的分布頻率占比較低。戰(zhàn)帥帥等[16]研究表明，在北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)，與高FAX含量相關(guān)的等位變異TaBahd-A1a占比遠(yuǎn)高于與低FAX含量相關(guān)的等位變異TaBahd-A1b(36%)。新疆地區(qū)小麥與其他麥區(qū)之間表現(xiàn)出的差異，反映了一定程度的地域特性，可能與其他麥區(qū)早期就有針對性地選育強(qiáng)筋、面團(tuán)流變學(xué)特性較好的小麥品種有關(guān)。Hao等[25]也指出，對于同一基因組，不同麥區(qū)具有不同的選擇牽連作用。且FAX含量為多基因控制的數(shù)量性狀，利用全基因組連鎖分析[13]及全基因組關(guān)聯(lián)分析[14]的方法，均在不同染色體上發(fā)現(xiàn)有多個有效位點(diǎn)，不同染色體的基因互作及同一染色體基因不同位點(diǎn)的影響都可能導(dǎo)致不同麥區(qū)的差異。

此外，本研究僅對新疆冬小麥材料中FAX含量相關(guān)位點(diǎn)TaBahd-A1等位變異進(jìn)行了基因型檢測，暫未對其進(jìn)行FAX含量測定和關(guān)聯(lián)驗(yàn)證。今后，我們將進(jìn)一步對新疆小麥FAX含量進(jìn)行檢測，并結(jié)合基因型進(jìn)行顯著性分析，同時開發(fā)其他染色體上與FAX含量相關(guān)的功能標(biāo)記，通過優(yōu)異等位基因的組合，進(jìn)一步提高分子標(biāo)記輔助育種的準(zhǔn)確性，進(jìn)而對小麥品質(zhì)遺傳改良提供參考。