崔穎，趙良娟，陳文碩，逯玉鳳

（1.天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津300461；2.北京海光儀器有限公司，北京100015）

阿散酸（arsanilic，ASA）、洛克沙砷（roxarsone，ROX）、硝苯砷酸（nitarsone，NIT）都屬于有機砷類制劑，具有刺激動物生長的作用，而且具有較廣的抗菌譜，可以改善畜禽的肉質(zhì)，提高飼料報酬和肉品中色素沉著。雖然有機砷的毒性很小[1]，但大劑量作用時，也會導(dǎo)致中毒，如洛克沙砷可使動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，使腦病和視神經(jīng)萎縮的發(fā)病率提高，因此不能忽視其殘留的安全性問題。為此，世界各國都對有機砷制劑作了嚴(yán)格的使用規(guī)定，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）對動物產(chǎn)品肉和肝、腎臟中的有機砷允許殘留限量分別為0.5 mg/kg 和2 mg/kg。而日本的肯定列表中規(guī)定：豬肉、豬脂肪、雞肉、雞脂肪、家禽蛋中的硝羥苯砷酸允許殘留限量為0.5 mg/kg。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第2638 號公告規(guī)定，停止在食用動物中使用氨苯砷酸、洛克沙砷等獸藥。自2018 年5 月1 日起，停止生產(chǎn)氨苯砷酸、洛克沙砷等獸藥的原料藥及各種制劑；2019 年5 月1 日起，停止經(jīng)營、使用氨苯砷酸、洛克沙砷等獸藥的原料藥及各種制劑。

聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的高效分離功能和元素檢測器的高選擇性，與單一檢測技術(shù)相比，聯(lián)用技術(shù)的靈敏度、選擇性更高，所以聯(lián)用技術(shù)是砷形態(tài)分析的重要手段[2]。目前主要的聯(lián)用技術(shù)有高效液相色譜與氫化物發(fā)生原子吸收光譜（atomic absorption spectrometry，AAS）、原子熒光光譜 （atomic fluorescence spec trometry，AFS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupledplasma-Atomicemissionspectrometry，ICP-AES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-Mass spectrometry，ICP-MS）等連用。其中 ICP-MS 有靈敏度高，近幾年發(fā)展訊速，越來越多將其應(yīng)用于砷含量測定的報道[3]。Gallard 等[4]把海洋動物肝臟樣品冷凍后，用甲醇∶水（9 ∶1）浸提，再用檢測各種形態(tài)砷含量。Spall 等[5]采用高效液相色譜-電感耦合等離子體發(fā)射光譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-Inductively coupled plasma-Atomic emission spectrometry，HPLC-ICP-AES）分析生物樣品中砷形態(tài)的方法，用直線梯度淋洗，分離砷酸根（arsenate，AsⅤ）、亞砷酸根（arsenite，AsⅢ）、一甲基砷（monomethyl arsenic，MMA）和二甲基砷（dimethyl arsenic dimethyl arsenic，DMA）在波長為197.19 nm 處用 ICP-AES 測定，檢測限達到60 ng/mL。李衛(wèi)華等[6]和劉桂華等[7]用HPLCICP-MS 法對我國不同海域海藻的砷形態(tài)進行了分析。何小青等[8]用反相離子對HPLC-ICP-MS 成功分離了 AsⅤ、AsⅢ、MMA 和 DMA4 種砷化合物。Fumta 等[9]用IonPac AS 4A-SC 陰離子交換色譜柱-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ion exchange chromatography-inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，IC-ICP-AES）測定了不同氧化態(tài)的砷，AsⅤ和AsⅢ的檢出限分別為70、170 ng/mL。

本試驗考慮到液相色譜-電感耦合等離子體/質(zhì)譜法，儀器價格昂貴，日常運行成本高，該方法較難推廣[10]，因此為完善砷元素形態(tài)技術(shù)，本試驗建立了液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法對動物源食品樣品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸殘留量同時測定的方法，保障了我國食品安全，具有很強的應(yīng)用前景和潛在的社會效益。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

由1260 型號高效液相色譜儀：美國Agilent 公司，包括液相色譜泵和進樣裝置；9560 型原子熒光光譜儀：北京海光公司；T18 組織勻漿機：德國IKA 公司；LD4-2 型冷凍離心機：北京醫(yī)用離心機廠；Milli-Q Reference 型超純水儀：德國Millipore 公司。

甲醇溶液（HPLC 級）：德國 Merck 公司；三氟乙酸（分析純）：上海天蓮精細(xì)化工有限公司；阿散酸（p-Arsanilic acid，ASA，CAS 編號：2045-00-3，C6H8AsNO3，純度≥99%）；洛克沙砷（3-Nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid，ROX，CAS 編號：121-19-7，C6H6AsNO6，純度≥97.5 %）；硝苯砷酸（4-Nitrophenylarsonic acid，NIT，CAS 編號：98-72-6，C6H6AsNO5，純度≥95%）。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取適量的阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水分別配成濃度為500 μg/mL 的阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。根據(jù)需要用去離子水稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。在0 ℃～4 ℃冰箱中保存，有效期為6 個月。

雞肉、雞肝、雞腎、雞可、豬肉、豬肝、豬腎：市售。將樣品用絞肉機絞碎，混勻，均分成兩份試樣，分裝入潔凈的盛樣袋內(nèi)， 密閉并標(biāo)明標(biāo)記，于-18 ℃以下冷凍保存。

1.2 液相色譜和原子熒光光譜條件

1.2.1 液相色譜參考條件

色譜柱：Luna C18 柱（5 μm，250 mm×4.60 mm）；流動相：甲醇-三氟乙酸（0.1 %）-磷酸二氫鉀溶液（10.2.4）（5 ∶95，體積比）；流速：1.2 mL/min；進樣體積：100 μL。

1.2.2 原子熒光檢測參考條件

負(fù)高壓：330 V；燈電流：100 mA；載氣流量：400 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；鹽酸溶液流速：120 r/min；硼氫化鉀流速：120 r/min；過硫酸鉀溶液流速：110 r/min；讀數(shù)模式：峰面積。

1.3 測定方法

稱取1 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL 離心管中，加 10 mL 甲醇-水提取液（1 ∶1，體積比），水浴振蕩萃取120 min，10 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中。殘渣再加5mL 提取液25 mL 容量瓶中。重復(fù)“殘渣再加5 mL 提取液，在渦旋混合器上充分混合，10 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中”操作一次。合并上清液于25 mL 容量瓶中，定容。取4 mL 上清液，氮氣吹掃，用提取液定容至2 mL，經(jīng)0.45 μm 有機濾膜過濾后進行測定。按同一操作方法作空白試驗。

分別準(zhǔn)確吸取1.00 mg/L 硝苯砷酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.00 mg/L 洛克沙砷標(biāo)準(zhǔn)工作液 0.00、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 和1.20 mL，及1.00 mg/L 阿散酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80 mL 和 1.00 mL 于 6 個 10 mL容量瓶，用水稀釋至刻度，此混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的阿散酸濃度為 0.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg/L 和 100.0 μg/L，硝苯砷酸和洛克沙砷濃度均為 0.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/L 和120.0 μg/L。測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液得到色譜圖，以保留時間定性，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相濃度的優(yōu)化

本部分主要分析了流動相濃度對有機砷形態(tài)分離的影響。在反相色譜分離中，向流動相添加乙酸、三氟乙酸或甲酸等酸性緩沖液或者是添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀或磷酸氫銨等緩沖鹽，有助于改善色譜峰形并且提高色譜峰的分離度。本試驗選擇甲醇和含1 %三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液作為流動相，以100 μg/L 的有機砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為測試對象，結(jié)果見圖1。

圖1 液相色譜-原子熒光光譜圖Fig.1 LC-AFS chromatogram

圖1 發(fā)現(xiàn)：當(dāng)流動相中甲醇與0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液體積比為5 ∶95 時，阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸均能在20 min 內(nèi)出峰且峰形良好，有極佳的靈敏度。

試驗考察了甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液不同體積比對各有機砷形態(tài)保留時間的影響，甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液的體積比分別是：5 ∶95、10 ∶90、15 ∶85、20 ∶80，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度流動相對應(yīng)3 種砷形態(tài)的峰面積Fig.2 Peak area of three arsenic speciations corresponding to different concentration mobile phases

如圖2 所示：當(dāng)增加甲醇的體積時，各砷形態(tài)的相對峰面積也降低，這是由于甲醇會對原子熒光檢測器有熒光猝滅效應(yīng)。因此，綜合考慮以上因素，優(yōu)化后的流動相組成為體積比5 ∶95 的甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液。

2.1.2 流動相流速的選擇

流動相流速對液相色譜來說，流動相的流速越小，理論塔板高度（H）值也越小，柱效率就越高，但很難找出H 的極小值，因為在很小的流速下，分子擴散也不明顯，對H 值沒有明顯影響，可以使用較高的流速，柱效損失不大，有利于實現(xiàn)快速分離。較好的分離度與分析時間有關(guān)。試驗考察了不同的流動相流速對3 種有機砷形態(tài)保留時間的影響，流動相流速分別為1.0、1.1、1.2 mL/min，結(jié)果見圖 3。

圖3 不同的流動相流速對應(yīng)3 種砷形態(tài)的保留時間Fig.3 Retention time of three arsenic speciations corresponding to different flow velocities of mobile phase

試驗結(jié)果如圖3 顯示：流速越快，峰的保留時間越短。本試驗在分離度足夠時選擇保留時間短的流速，最終選擇的流動相流速為1.20 mL/min。

2.1.3 氧化劑濃度的優(yōu)化

有機砷經(jīng)色譜分離后進入在線紫外氧化消解，將有機砷轉(zhuǎn)化成無機砷進行測定。通過在線紫外氧化消解，提高了有機砷轉(zhuǎn)化成無機砷的效率，提高了靈敏度，色譜峰的拖尾現(xiàn)象能明顯得到改善。本方法以100 μg/L 的有機砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的試驗結(jié)果為依據(jù)來優(yōu)化，選擇過硫酸鉀作為氧化劑。試驗考察了不同濃度氧化劑對3 種有機砷形態(tài)峰面積的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 過硫酸鉀濃度對峰面積的影響Fig.4 Effect of potassium persulfate concentration on peak area

由圖4 可知：當(dāng)過硫酸鉀濃度為3%時，峰面積最大，靈敏度最高，此后趨于穩(wěn)定。最終選定氧化劑過硫酸鉀濃度為3%。

2.1.4 氫化物發(fā)生條件的優(yōu)化

2.1.4.1 還原劑流速的優(yōu)化

試驗反應(yīng)所需的載流鹽酸溶液和硼氫化鉀溶液是通過蠕動泵傳輸?shù)綒浠锇l(fā)生裝置的，蠕動泵最大泵速為120 r/min。為了在氫化物發(fā)生過程中得到最大的靈敏度，在相同的液相色譜分離條件下，以100 μg/L的有機砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的試驗結(jié)果為依據(jù)來優(yōu)化硼氫化鉀的流速。試驗考察了硼氫化鉀流速對3 種有機砷形態(tài)峰面積的影響，在鹽酸流速為120 r/min、濃度為5%，硼氫化鉀濃度為20.0 g/L 條件下，做了還原劑不同流速對比試驗，流速分別設(shè)為70、80、90、100、110 和 120 r/min，結(jié)果見圖5。

圖5 不同的還原劑流速對應(yīng)3 種砷形態(tài)的峰面積Fig.5 Peak area of three arsenic speciations corresponding to different flow velocities of reductant

如圖5 顯示：隨著還原劑硼氫化鉀流速的增大，3種砷形態(tài)的峰面積也相應(yīng)增強。為了使3 種砷形態(tài)有最佳的靈敏度，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)還原劑流速為120 r/min。

2.1.4.2 濃度的優(yōu)化

在硼氫化鉀濃度為20.0 g/L 條件下，研究了鹽酸濃度為：2、5、8、10%（體積分?jǐn)?shù)）對砷形態(tài)氫化物發(fā)生的影響見圖6；在鹽酸濃度為5%時，研究了還原劑濃度為：10、15、20、25、30 g/L 對砷形態(tài)氫化物發(fā)生的影響見圖7。

圖6 鹽酸濃度對砷形態(tài)氫化物發(fā)生的影響Fig.6 Effect of HCl concentration on the formation of arsenic hydride

圖7 硼氫化鉀濃度對砷形態(tài)氫化物發(fā)生的影響Fig.7 Effect of potassium borohydride concentration on the formation of arsenic hydride

由圖6 可知：當(dāng)鹽酸濃度較低時，各有機砷形態(tài)的峰面積隨著鹽酸濃度的增大而增強，當(dāng)鹽酸濃度為5%時，各有機砷形態(tài)有最佳的峰面積響應(yīng)，之后隨著鹽酸濃度的增大各有機砷形態(tài)的峰面積先降低而后又緩慢上升，所以鹽酸的濃度設(shè)為5%。由圖7 可知：當(dāng)硼氫化鉀的濃度為20.0 g/L 時3 種砷形態(tài)都可以得到較高的峰面積響應(yīng)。這是因為當(dāng)硼氫化鉀濃度較小時導(dǎo)致氫化反應(yīng)不完全，而當(dāng)硼氫化鉀濃度較高時卻又產(chǎn)生了過多的氫氣，導(dǎo)致樣品的氣態(tài)氫化物濃度被稀釋了，從而靈敏度也跟著下降了。所以優(yōu)化后，鹽酸的濃度設(shè)定為5%，硼氫化鉀的濃度設(shè)定為20.0 g/L。

2.1.5 提取溶劑的選擇

有機物的提取劑一般選擇丙酮-水溶液、乙醇-水溶液、甲醇-水溶液。試驗選擇了3 種提取溶劑：丙酮-水溶液（1 ∶1，體積比），乙醇-水溶液（1 ∶1，體積比）和甲醇-水溶液（1 ∶1，體積比），微波輔助萃取條件參考儀器條件。試驗對3 種提取溶劑的提取效率進行研究，考察指標(biāo)為加標(biāo)100 μg/L 的豬肝樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果見圖8。

圖8 甲醇-水溶液、丙酮-水溶液和乙醇-水溶液3 種提取溶劑的提取效率Fig.8 Different extraction efficiencies of Methanol-water solution，Acetone-water solution and Ethanol-water solution

結(jié)果如圖8 顯示：甲醇-水的提取效率最高，丙酮-水的提取效率次之，用乙醇-水做提取溶劑提取效率最低。從試驗提取液可以看出，乙醇-水溶液容易將動物源性食品中的可溶性有機物提取出來，提取液中溶解的有機物增多了不僅使提取液顏色變深而且液體變得黏稠，因此導(dǎo)致萃取不完全，不利于各有機砷形態(tài)充分提取，從而影響試驗結(jié)果的正確測定。丙酮由于極性大、穿透力強，對有機砷有較好的提取效果，但是豬肝樣品中含有較高的脂肪，而丙酮容易將大量的脂肪提取出來，這樣不利于后面提取液的濃縮和凈化。因此，提取溶劑最終選擇甲醇-水溶液。

2.1.6 提取劑比例的優(yōu)化

由于動物源性食品中的可溶性有機物也能部分溶于甲醇中，為減少溶解的可溶性有機物對提取效率的影響，對甲醇-水溶液的比例進行優(yōu)化。試驗用體積比為 1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3 的甲醇-水溶液對加標(biāo)100 μg/L 的豬肝樣品進行提取，考察了不同甲醇溶液濃度對提取率的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 甲醇溶液濃度對提取率的影響Fig.9 Effect of methanol solution concentration on extraction rate

結(jié)果如圖9 看出：在甲醇比例較小時，樣品提取效率隨著甲醇比例的增大而提高，甲醇+水（1 ∶1，體積比）提取效率明顯高于甲醇+水（4 ∶6，體積比），但是當(dāng)甲醇比例增大到一定程度時，樣品提取效率卻隨著甲醇-水體積比的增大而降低，甲醇+水（6 ∶4，體積比）提取效率低于甲醇+水（1 ∶1，體積比）。適量的甲醇有助于提高有機砷的提取效率，但過多的甲醇會提取出樣品中的可溶性有機物質(zhì)，從而降低了樣品的提取效率。因此，選擇體積比1 ∶1 的甲醇-水溶液作為提取溶劑。

2.2 檢測低限、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

采用標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋法測定信噪比大于3 ∶1時，樣品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的檢測低限。分別配制含阿散酸質(zhì)量濃度為 0.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg/L 和 100.0 μg/L（相當(dāng)于樣品 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg）、含硝苯砷酸和洛克沙砷質(zhì)量濃度均為0.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/L 和 120.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于樣品 0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/kg），進樣量為100 μL，在選定的色譜條件下進行測定，用峰面積對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的濃度做圖，其檢測低限、線性方程和線性相關(guān)系數(shù)見表1。

如表1 所示：在 0～120 μg/L 范圍內(nèi)阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表1 阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 The analytical parameters of ASA，ROX and NIT（n=6）

2.3 樣品分析

按照試驗方法對雞肉、雞肝、雞腎、豬肉、豬肝、豬腎6 種市售樣品，在3 個添加水平上進行添加回收率試驗，每個水平重復(fù)做6 次，回收率和精密度結(jié)果見表 2。ASA 添加水平為 0.1 mg/kg～0.5 mg/kg，NIT 和ROX 的添加水平均為0.2 mg/kg～2.0 mg/kg。雞肉樣品中添加 ASA 為 0.1mg/kg，NIT 和 ROX 為 0.2 mg/kg 的液相色譜圖見圖10。

表2 樣品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的添加回收率及精密度試驗數(shù)據(jù)（n=6）Table 2 Recovery of three concentration in samples（n=6）

圖10 雞肉樣品加標(biāo)色譜圖Fig.10 Chromatogram of ASA，ROX and NIT from spiked chicken samples

如表2 所示，6 種市售樣品中3 個添加水平的平均回收率為阿散酸81.0%～102.5%，洛克沙砷80.0%～104.9%，硝苯砷酸81.0%～101.8%；相應(yīng)的RSD 分別為1.61%～6.95%、1.32%～7.52%、0.97%～8.12%。如圖10 所示：阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸檢測低限分別為 0.1、0.2、0.2 mg/kg。

3 結(jié)論

本文介紹了采用液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法同時測定動物源性食品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸3 種有機砷殘留量，探討了試驗條件的優(yōu)化和實驗方法的驗證。其中，試驗條件優(yōu)化包括流動相的選擇、濃度和流速，氧化劑濃度，還原劑濃度和流速，以及提取劑的選擇和濃度比例。實驗方法的驗證包括方法的檢測低限和標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終確立試驗優(yōu)化結(jié)果為：高效液相色譜流動相為5 ∶95 的甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，液相高壓泵泵速為1.20 mL/min；氧化劑過硫酸鉀濃度為3 %；氫化物發(fā)生裝置的載流鹽酸的濃度為5%，還原劑硼氫化鉀的濃度為20.0 g/L，流速為120 r/min；提取試劑為體積比1 ∶1 的甲醇-水溶液。驗證結(jié)果表明本方法具有良好的回收率，并且方法穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，多次試驗結(jié)果的RSD 均小于10%，能夠滿足日常檢測工作的需要。