劉田園，丁惠，陳衍男，趙恒強(qiáng)，王曉，王明林，崔莉，*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355）

金銀花又名二花、雙花等[1]，是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花，其主要成分包括有機(jī)酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷類、糖類等[2-3]。金銀花藥用歷史悠久，幾千年來用于中醫(yī)治療傳染病以及溫病發(fā)熱、癰腫疔瘡、咽喉腫痛等癥[4-5]，更是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材，廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[6]。金銀花工業(yè)化提取的核心是煎煮加熱，綠原酸等有機(jī)酸類成分是金銀花清熱解毒功效的重要藥理學(xué)基礎(chǔ)[7]，以金銀花水提液為基礎(chǔ)開發(fā)的功能飲料不僅能夠清熱降火、消暑解渴，還具有一定的利膽保肝、降低血脂、增強(qiáng)免疫力等保健作用[8-9]。

目前金銀花提取的研究以醇提取物為主[10]，水提物及提取過程研究相對(duì)較少。段曉穎[11]采用正交試驗(yàn)法以綠原酸為指標(biāo)優(yōu)選出了金銀花的最佳水提工藝；許哲等[12]以綠原酸為指標(biāo)對(duì)金銀花的傳統(tǒng)水煎法、乙醇回流法、動(dòng)態(tài)溫浸法、超聲提取法、乙醇滲漉法等各種工藝進(jìn)行了比較研究；尚麗霞等[13]采用高效液相色譜法研究了不同提取工藝、不同提取時(shí)間、不同濃縮干燥方法對(duì)綠原酸含量的影響；余杰等[14]考察了加水量、煎煮溫度、煎煮時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響；王盈峰等[15]通過正交試驗(yàn)，綜合水浸出物、氨基酸、黃酮和綠原酸含量4 項(xiàng)指標(biāo)得到金銀花的最適浸提條件。相關(guān)研究主要集中在工藝優(yōu)化，而水提工藝中的浸提時(shí)間的選擇尚未見系統(tǒng)研究報(bào)道，而且目前相關(guān)研究主要以綠原酸為單一質(zhì)量指標(biāo)，金銀花中有機(jī)酸成分主要是綠原酸類化合物，迄今已分離出40 多種，雖然綠原酸是其中主要的成分，但金銀花的內(nèi)在質(zhì)量并不是靠單一成分所決定的，而是多種成分相結(jié)合，并同時(shí)起作用才可達(dá)到預(yù)期效果[16]，金銀花浸提水提過程中多種有機(jī)酸成分的變化規(guī)律亟待研究，因此本文采用多指標(biāo)評(píng)價(jià)的方法研究浸泡時(shí)間對(duì)金銀花中多種有機(jī)酸類成分水提效果的影響，以期為金銀花加工生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

金銀花：山東宏濟(jì)堂醫(yī)藥有限公司中藥廠；乙腈（色譜純）：美國Tedia 公司；甲酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；綠原酸對(duì)照品（純度＞98%）：成都德思特生物技術(shù)有限公司；異綠原酸A/B/C 對(duì)照品、異綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品、獐牙菜苷對(duì)照品（純度均＞98%）：上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA2202S-CW）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DFD-700 儀表恒溫水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司；高效液相色譜儀（S6000）：華譜新創(chuàng)科技有限公司；YMC-Pack ODS-A 色譜柱（250×4.6 mml.D.，S-5 μm，12 nm）：日本 YMC 公司；針筒式濾膜過濾器：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸泡時(shí)間對(duì)水提效果影響的考察

熱水浸提，以1 ∶30 質(zhì)量比進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置不同的浸泡時(shí)間（0、30、60、90 min），分別采用 80、95 ℃提取，提取總時(shí)長為120 min，各3 組平行試驗(yàn)。每間隔15 min取 1 mL 提取液，凍干，甲醇復(fù)溶，過 0.45 μm 濾膜注入液相色譜進(jìn)樣瓶待測。

1.2.2 金銀花水提液中成分分析

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測水提液中主要有機(jī)酸類成分，色譜條件：流速 0.3 mL/min，進(jìn)樣量 5 μL，檢測波長254 nm，流動(dòng)相為：A 乙腈（1.0%甲酸），B 水（1.0%甲酸），梯度洗脫：0～5 min，10%～17%A；5 min～30 min，17 %～22 %A；30 min～40 min，22 %～35 %A；40 min～45 min，35%～40%A；45 min～60 min，40%A。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用無水甲醇準(zhǔn)確配制濃度為1.00 mg/mL 的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取200 μL 混合，按上述色譜條件進(jìn)樣 1、5、10、15、20 μL，測定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。新綠原酸：y=394.92x-40.564，R2=0.999 1；綠原酸：y = 501.99x-311.37，R2=0.999 2；隱綠原酸：y=504.63x-176.01，R2=0.999 4；獐牙菜苷：y=603.29x-284.05，R2=0.999 2；異綠原酸 B：y=618.31x-445.99，R2=0.999 2；異綠原酸 A：y=611.15x-139.42，R2=0.999 1；異綠原酸 C：y=672.35x-342.59，R2=0.999 3。R2均大于0.999，線性良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC分析

建立金銀花水提液中7 種成分的HPLC 檢測方法，見圖1。

圖1 金銀花提取液和7 種化合物混標(biāo)的HPLC 圖Fig.1 HPLC diagram of the mixed extract of Lonicera japonica Thunb.water extract and seven compounds

通過HPLC 標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)7 種化合物分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，同時(shí)采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）進(jìn)行定性確認(rèn)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.2 金銀花水提液中有機(jī)酸類成分的變化規(guī)律

2.2.1 新綠原酸

新綠原酸的提取效果如圖2 所示。

圖2 新綠原酸在不同溫度下提取量變化圖Fig.2 Change of extraction amount of new chlorogenic acid at different temperature

在80 ℃和95 ℃提取時(shí)，4 種條件下水提液中新綠原酸含量均呈上升趨勢，且直接提?。窘?0 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min，直接提取的效果明顯優(yōu)于常溫（20 ℃左右）浸泡，特別是95 ℃提取時(shí)，不浸泡直接提取時(shí)新綠原酸溶出速度快、提取量大，所得的水提液中的新綠原酸含量最高。80 ℃提取時(shí)整個(gè)提取時(shí)段中90 min～120 min 內(nèi)新綠原酸含量相對(duì)穩(wěn)定。與80 ℃條件相比，95 ℃下各組間提取效果差異更明顯，新綠原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃效果好，其中95 ℃直接提取得到的新綠原酸含量最高，在浸泡90 min 后提取時(shí)，均在105 min 后出現(xiàn)含量下降的趨勢。

2.2.2 綠原酸

綠原酸是金銀花最主要的有機(jī)酸成分，在檢測的7 種有機(jī)酸中含量最高，結(jié)果見圖3。

圖3 綠原酸在不同溫度下提取量變化圖Fig.3 Change of extraction amount of chlorogenic acid at different temperature

80 ℃提取時(shí)綠原酸提取量：浸泡30 min＞浸泡60 min＞直接提取＞浸泡90min，常溫浸泡30 min 時(shí)提取60 min 后綠原酸溶出速率降低。95 ℃提取時(shí)綠原酸提取量：浸泡30 min＞浸泡60 min＞浸泡90 min＞直接提取，75 min 以后各組提取量均增速變緩。80 ℃和95 ℃下均在浸泡30 min 后提取效果最好好，提取45 min 時(shí)的提取量均高于直接浸提105 min 時(shí)的提取量，其中浸泡30 min 后95 ℃提取得到的綠原酸含量最高。在浸泡時(shí)間達(dá)到90 min 后，均在浸提105 min 后出現(xiàn)綠原酸含量下降?？傮w來看綠原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃提取效果稍好。

2.2.3 隱綠原酸

隱綠原酸提取量的變化規(guī)律與新綠原酸相似，但其含量較新綠原酸低，結(jié)果見圖4。

圖4 隱綠原酸在不同溫度下提取量變化圖Fig.4 Change of extraction amount of cryptochlorogenic acid at different temperature

80 ℃和95 ℃提取時(shí)隱綠原酸含量均為：直接提?。窘?0 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min，隨著提取時(shí)間的延長，水提液中隱綠原酸的含量總體呈上升趨勢。隱綠原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃效果好，直接提取組的隱綠原酸溶出速度快、提取量大，所得的水提液中的隱綠原酸含量最高。與綠原酸類似，在浸泡90 min 后浸提時(shí)，在提取105 min 后隱綠原酸含量也出現(xiàn)下降。

2.2.4 獐牙菜苷

獐牙菜苷是一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有良好的抗炎效果[17]，其提取效果見圖5。

80 ℃提取時(shí)提取量：浸泡90 min＞浸泡60 min＞浸泡30min＞直接提取，其中直接浸提和浸泡30min 后提取效果相近，在45 min 后提取量變化趨緩。95 ℃提取時(shí)：浸泡90 min＞浸泡60 min＞直接提?。窘?0min。浸泡60 min、90 min 后，隨提取時(shí)間的延長，獐牙菜苷含量在80 ℃提取時(shí)比95 ℃時(shí)增加更快，且最終提取量更高，浸泡90 min 后95 ℃提取時(shí)獐牙菜苷含量持續(xù)較高且相對(duì)穩(wěn)定。浸泡90 min 后，兩個(gè)溫度下浸提105 min 時(shí)獐牙菜苷含量都出現(xiàn)下降。

圖5 獐牙菜苷在不同溫度下提取量變化圖Fig.5 Change of extraction amount of sweroside at different temperature

2.2.5 異綠原酸B

異綠原酸B 在兩個(gè)提取溫度下總體變化規(guī)律類似，結(jié)果見圖6。

隨提取時(shí)間的延長，均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在60 min 前增加迅速，之后含量的增加減緩，趨于平穩(wěn)，浸泡時(shí)間對(duì)提取量的影響差別較小。95 ℃直接提取時(shí)異綠原酸B 含量呈現(xiàn)明顯的先增加后減小的趨勢，與其他3 組差異明顯，在浸泡90 min 的兩個(gè)提取溫度下，均在105 min 后出現(xiàn)含量下降現(xiàn)象。

圖6 異綠原酸B 在不同溫度下提取量變化圖Fig.6 Change of extraction amount of isochlorogenic acid B at different temperature

2.2.6 異綠原酸A

異綠原酸A 的提取量總體呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢見圖7。

圖7 異綠原酸A 在不同溫度下提取量變化圖Fig.7 Change of extraction amount of isochlorogenic acid A at different temperature

隨著浸泡時(shí)間延長，提取量減少，浸泡60 min 和浸泡90 min 差異不明顯，即直接提?。窘?0 min＞浸泡90 min 和浸泡60 min。80 ℃浸提時(shí)，提取45 min～60 min 后異綠原酸A 含量開始下降，95 ℃浸提時(shí)，隨提取時(shí)間的延長，異綠原酸A 含量的降低速率較80 ℃浸提時(shí)更快。80 ℃直接提取，45 min 時(shí)提取量最高。

2.2.7 異綠原酸C

浸泡時(shí)間對(duì)異綠原酸C 提取量的影響差別顯著，結(jié)果見圖8。

圖8 異綠原酸C 在不同溫度下提取量變化圖Fig.8 Change of extraction amount of isochlorogenic acid C at different temperature

直接提?。窘?30 min ＞浸泡 90 min 和浸泡60 min，隨提取時(shí)間延長，各組均呈現(xiàn)緩慢穩(wěn)態(tài)上升的趨勢，95 ℃直接提取時(shí)含量顯著優(yōu)于其他各條件，異綠原酸C 在水提液中的含量：95 ℃直接提?。窘?0 min，95 ℃提?。?0 ℃直接提?。窘?90 min，95 ℃提?。窘?60 min，95 ℃提?。窘?30 min，80 ℃提?。窘?60 min，80 ℃提?。窘?90 min，80 ℃提取。在浸泡90 min 后提取105 min 時(shí)出現(xiàn)含量下降。

2.2.8 7 種有機(jī)酸類成分總提取量

對(duì)7 中有機(jī)酸類成分的總提取量進(jìn)行比較，結(jié)果見圖9。

80 ℃時(shí)提取量：直接提?。窘?0 min＞浸泡60 min＞浸泡 90 min；95 ℃時(shí)：直接提?。窘?30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min。綜合比較來看，直接95 ℃提?。窘?0 min 95 ℃提?。局苯?0 ℃提取＞浸泡30 min 80 ℃提?。窘?90 min 95 ℃提取＞浸泡 60 min 95 ℃提?。窘?0 min 80 ℃提?。窘?0 min 80 ℃提取。

圖9 7 種化合物在不同溫度下總提取量變化圖Fig.9 Total extraction amount of 7 compounds at different temperature

2.3 討論

浸泡時(shí)間對(duì)提取過程中多種有機(jī)酸類成分的影響存在差異，隨著浸泡時(shí)間的延長，提取量也存在或增或減的不同情況。加水浸泡能讓藥材原本干燥萎縮呈緊密狀態(tài)的細(xì)胞外壁膨脹變軟，水分進(jìn)入細(xì)胞后，原來以結(jié)晶或其他形態(tài)固定于細(xì)胞內(nèi)的化合物溶解并在藥材內(nèi)部形成較高的滲透壓，壓差使高濃度的內(nèi)容物滲出并溶于水中，加熱提取時(shí)，隨著溫度的升高，內(nèi)容物向水中擴(kuò)散的速度加快，藥材內(nèi)部細(xì)胞不斷破裂，水溶液濃度也越來越高，直至藥材與水之間的物質(zhì)交換達(dá)到相對(duì)平衡狀態(tài)。李維德[18]在對(duì)中藥材加水浸泡提取工藝的研究中發(fā)現(xiàn)浸泡比不浸泡直接加熱提取所得提取物平均得率高出6.89%，經(jīng)充分浸泡后再加熱煎煮提取有效成分效果明顯可提高提取得率，減少煎煮時(shí)間，節(jié)省能源消耗，提高經(jīng)濟(jì)效益，但中藥材加水浸泡時(shí)間并非越長越好。本研究中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B 等多種成分均在提取105 min后出現(xiàn)含量下降的趨勢，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

浸泡過程中觀察到金銀花表面在入水片刻后開始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，且靠近水面的金銀花褐變更為嚴(yán)重，推測該現(xiàn)象源自酶促褐變。綠原酸（3-咖啡?？鼘幩幔?、隱綠原酸（4-咖啡酰奎寧酸）、新綠原酸（5-咖啡酰奎寧酸）、異綠原酸 A（3，5-二咖啡?？鼘幩幔惥G原酸 B（3，4-二咖啡?？鼘幩幔?、異綠原酸 C（4，5-二咖啡?？鼘幩幔┚鶠閱慰Х弱？崴岷投Х弱？崴崴M成的綠原酸異構(gòu)體。綠原酸類物質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)中有多元酚、不飽和雙鍵及酯鍵3 個(gè)不穩(wěn)定部分，前兩者易被氧化，后者易發(fā)生水解[19]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是主要參與金銀花酶促褐變的酶類，通過催化酚類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化，導(dǎo)致褐變[20]，綠原酸類物質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)中有多元酚，可作為PPO 底物，金銀花中PPO 主要存在葉綠體內(nèi)囊體的基質(zhì)上[21]，當(dāng)浸泡過程中藥材內(nèi)部細(xì)胞不斷破裂，酶和底物之間的屏障被打破，發(fā)生氧化反應(yīng)以及一系列的連鎖反應(yīng)[22]。有研究證明采后鮮金銀花的酶促褐變會(huì)引起綠原酸和木犀草苷的降解，因此推測干燥金銀花在浸提過程中復(fù)水后酶被激活發(fā)生褐變。

綜上，推測在內(nèi)容物溶出和酶促褐變的雙重作用下，產(chǎn)生了浸泡 0、30、60、90 min 不同條件下各化合物的變化規(guī)律。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C 在95 ℃提取效果比80 ℃時(shí)好；獐牙菜苷在兩種溫度下提取效果相仿；異綠原酸A 在80 ℃下提取效果比95 ℃時(shí)好。水提液中各成分含量從多到少依次為綠原酸＞異綠原酸A＞異綠原酸C＞隱綠原酸＞新綠原酸＞獐牙菜苷＞異綠原酸B，綠原酸在7 種化合物總量中占比最高達(dá)58%。除異綠原酸A 外，各化合物在90 min～120 min 均可得到較為理想的提取效果。由于綠原酸在水提液中含量最高，同時(shí)也是金銀花及其產(chǎn)品評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)成分，以綠原酸為主其他化合物為輔綜合結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)效率考量水提液的提取效果。綠原酸的最佳提取條件為浸泡30 min 95 ℃提取，結(jié)合7 種化合物總提取量的變化，提取90 min 時(shí)含量較高，因而選擇提取方式為浸泡30 min 95 ℃提取90 min時(shí)，綠原酸的提取量和7 種化合物總量均能得到良好的保證。

3 結(jié)論

浸泡對(duì)金銀花的提取產(chǎn)生一定的影響，但不是時(shí)間越久效果越好，綠原酸在浸泡30 min 后提取效果最好，獐牙菜苷在浸泡90 min 后提取效果最好，隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 均為：直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min 和浸泡60 min，適當(dāng)?shù)慕菽軌蚣涌焯崛∵M(jìn)程，提高得率，降低耗能，綜合考慮7 種有機(jī)酸類成分，浸泡30 min 后95 ℃提取90 min 的提取條件，既能保證較高的活性成分提取量又能保證生產(chǎn)效率。