余水 丁海霞 羅玉英 程歡歡 姚偉偉 彭麗娟

摘 要：為探究貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）MT310的生防機制，為該菌田間防病試驗提供依據(jù)，本文采用平板對峙、二分格平板和指示培養(yǎng)基等3種方法對其抑菌譜、揮發(fā)性物質及促生機制進行了檢測。結果表明，MT310對煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、石榴干腐病菌（Phomopsis sp.）、高粱葉斑病菌（Phyllosticta sorghina）和高粱炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）5種植物病原真菌有明顯抑制效果，對煙草赤星病菌抑制效果最佳，抑制率為68.76 %;其產生的揮發(fā)性物質（Volatile organic compounds， VOCs）對上述5種植物病原真菌也有抑制效果，對煙草赤星病菌抑制效果最好，抑制率為49.96 %。VOCs對烤煙幼苗的葉長、葉寬、株高和根長有明顯的抑制作用，對煙苗根生長抑制效果最明顯，相對抑制率為94.44 %。此外，MT310可產生嗜鐵素、磷酸酯酶，具有較強的運動能力，可產生復雜的生物膜結構。該結果對菌株MT310合理、安全地運用到大田生產具有一定指導意義。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌;抑菌效果;揮發(fā)性物質

Abstract：In order to explore the biocontrol mechanism of Bacillus velezensis MT310 and provide the basis for its field disease control test， the antibacterial spectrum， volatile substances and growth-promoting mechanism of B. velezensis MT310 were detected by three methods such as plate confrontation， dichotomy plate and indicator medium. The results showed that MT310 had obvious inhibitory effect on five kinds of plant pathogenic fungi， including， Alternaria alternata， Fusarium sp.， Phomopsis sp.， Phyllosticta sorghina and Colletotrichum graminicola. MT310 had the best inhibitory effect on A. alternata， with an inhibition rate of 68.76%. The volatile organic compounds （VOCs） produced by MT310 also had inhibitory effect on the above five plant pathogenic fungi， and also had the best inhibitory effect on A. alternata， with the inhibition rate of 49.96%. VOCs could significantly inhibit the leaf length， leaf width， plant height and root length of tobacco seedlings， and the most obvious inhibitory effect on tobacco seedling was found on root growth， with the relative inhibition rate of 94.44%. In addition， MT310 could generate siderophore and phosphatase， which had strong movement ability and could produce complex biomembrane structure. The results have certain guiding significance for the reasonable and safe application of strain MT310 to field production.

Keywords：Bacillus velezensis;antimicrobial activity;volatile organic compounds

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）MT310是從貴州省遵義市植煙區(qū)烤煙根圍土壤中分離的有益生防菌株，在2018年田間試驗作為生防菌劑施用對煙草黑脛病田間防效高達70.1%[1]，是一株極具應用效果的生防芽孢桿菌。芽孢桿菌生防機制多樣，其首要的作用條件是定殖于植物根部或根部環(huán)境中，從而發(fā)揮生防效用[2-3]。拮抗效果是其抗菌防病的重要機制之一[4-5]，芽孢桿菌能產生的拮抗物質主要包括抗生素、細胞壁降解酶類以及揮發(fā)性物質（Volatile organic compounds，VOCs）等，能夠直接或間接地作用于病原菌[4]。例如，馬冠華[6]研究發(fā)現(xiàn)，煙草內生細菌Itb57對煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）等多種植物病原真菌均具有良好的拮抗效果，且還具有促進種子萌發(fā)的功效;陳海英等[7]發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）CP7對多種植物病原細菌具有抑菌活性;鄭香香等[8]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的揮發(fā)性物質能夠顯著抑制鏈格孢菌（Alternaria alternata）菌落生長。因為生防產品作用機理是其應用效果穩(wěn)定的主要原因[9]。因此，本研究通過MT310抑菌譜檢測，揮發(fā)性物質作用和生防相關酶類檢測等進一步明確其生防機制，為提高MT310田間生防效果以及生防制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

煙草赤星病菌（A.alternata）、黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、石榴干腐病菌（Phomopsis sp.）、高粱葉斑病菌（Phyllosticta sorghina）和高粱炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）和貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）MT310均由貴州大學農學院植物病理教研室提供。

1.1.2 供試烤煙

選用貴州烤煙繁育中心生產的K326包衣種。包衣種用無菌水清洗去除外種子外部包衣，75%乙醇溶液滅菌1min，40%NaClO浸泡20min，再用無菌水清洗離心3次，于超凈工作臺上吹干種子備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基用于芽孢桿菌培養(yǎng)，LB液體培養(yǎng)基用于生物膜測定;PDA培養(yǎng)基用于植物病原真菌培養(yǎng)及對峙試驗;LB半固體培養(yǎng)基（0.8%瓊脂）用于芽孢桿菌運動性檢測;MS培養(yǎng)基用于烤煙種子培養(yǎng);磷酸脂酶檢測培養(yǎng)基、嗜鐵素檢測培養(yǎng)基、葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基[10]用于檢測芽孢桿菌是否產生嗜鐵素、磷酸酯酶、葡聚糖酶。

1.2 方法

1.2.1 抑菌譜測定

參考周霄等[11]的對峙試驗稍作改動，測定貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）MT310對煙草赤星病菌（A. alternata）、黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、石榴干腐病菌（Phomopsis sp.）、高粱葉斑病菌（P. sorghina）和高粱炭疽病菌（C. graminicola）等5種植物病原真菌的拮抗效果。采用十字交叉法[10]測量菌落直徑，使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan新復極差法對其抑制率數(shù)據(jù)進行分析。

抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.2.2 揮發(fā)性物質抑菌譜檢測

采用二分格平板法[10]，使用90mm的二分隔培養(yǎng)皿測定MT310揮發(fā)性物質對5種病原菌的抑制效果。在第二分隔培養(yǎng)皿一側加入10mLPDA培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)植物病原真菌;另一側加入10mLLB培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)MT310，以一側不培養(yǎng)MT310，另一側培養(yǎng)值物病原真菌為對照[8-9]。培養(yǎng)皿外用Parafilm 封口膜封住，隔斷皿內外空氣的流通。每處理5個重復，密封后于28℃，黑暗條件下倒置培養(yǎng)，7d后觀察病原真菌的生長狀況。數(shù)據(jù)收集和處理方法同1.2.1。

1.2.3 生防相關酶類及運動性測定

接種MT310于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min黑暗條件下勻速震蕩12h，再10000r/min離心4min棄上消度，收集菌體，加入100μL無菌水制備成菌體懸浮液備用;滴加2 μL菌液于磷酸酯酶檢測培養(yǎng)基、嗜鐵素檢測培養(yǎng)基和葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基中央處，封口膜密封于37℃黑暗條件下培養(yǎng)7d，觀察培養(yǎng)基上是否出現(xiàn)消解圈;滴加2μL菌液于LB培養(yǎng)基（0.8%瓊脂）中央處，封口膜密封，于黑暗條件下培養(yǎng)12h，觀察MT310的運動狀況。挑取單菌落接入3mLLB液體培養(yǎng)基于 30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12h，菌液離心，棄上清液，菌體按原始體積的1/100 接種到盛有2mLLB液體培養(yǎng)基的12孔板中，平緩移至水平桌面上靜置， 室溫培養(yǎng)， 每處理3個重復，每12h觀察一次生物膜的形成情況。

1.2.4 揮發(fā)性物質對烤煙幼苗生長的影響

試驗設2個處理，每處理5個重復;使用90mm直徑的二分格培養(yǎng)皿測定芽孢桿菌MT310對烤煙幼苗生長的影響。在二分格兩側均加入MS固態(tài)培養(yǎng)基10mL，培養(yǎng)皿一側培養(yǎng)芽孢桿菌（芽孢桿菌劃線長度40mm），另一側培養(yǎng)10粒烤煙種子，參照文獻[12]對烤煙種子進行培養(yǎng);以一側只培養(yǎng)烤煙種子，另一側不培養(yǎng)芽孢桿菌的處理為對照（CK）。培養(yǎng)皿用Parafilm封口膜密封，于25℃光照12h，20℃條件下暗處理培養(yǎng)15d，測量煙苗的農藝性狀，參考 YC/T142-2010《煙草農藝性狀調查測量方法》稍作改動后13d側量。

2 結果與分析

2.1 菌株MT310抑菌譜測定

MT310對煙草赤星病菌（A.alternata）、黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、石榴干腐病菌（Phomopsissp.）、高粱葉斑病菌（P. sorghina）和高粱炭疽病菌（C. graminicola）等5種植物病原真菌均具有明顯的抑制效果（圖1），抑菌率分別為68.76%、57.57%、44.64%、35.56%和42.25%（表1）。其中，對煙草赤星病菌（A. alternata）的抑制率最高。

2.2 揮發(fā)性物質抑菌譜檢測

MT310產生的揮發(fā)性物質（VOCs）對煙草赤星病菌（A. alternata）、黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、石榴干腐病菌（Phomopsis sp.）、高粱葉斑病菌（P. sorghina）和高粱炭疽病菌（C. graminicola）等5種植物病原真菌均有一定抑制作用（圖2），抑菌率分別為49.96 %、18.79 %、10.32 %、35.93 %和32.94 %（表2）。其中，對煙草赤星病菌（A. alternata）的抑制率最高。

2.3 生防機制及運動性

菌株MT310在LB培養(yǎng)基（0.8% 瓊脂）上培養(yǎng)12h即可長至全皿，還可在72h內形成復雜的生物膜，表明該菌株具有較好的運動與定殖能力。平板檢測發(fā)現(xiàn)，在嗜鐵素和磷酸酯酶檢測平板上產生透明圈，表明MT310可產生嗜鐵素和磷酸酯酶等生防相關酶;但MT310不能使葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基出現(xiàn)消解圈，說明其不產生葡聚糖酶（圖3）。

2.4 揮發(fā)性物質對烤煙幼苗生長的影響

從圖4可知，MT310揮發(fā)性物質對烤煙種子及幼苗生長有一定的影響。其平均葉長、葉寬、株高和根長分別為0.17cm、0.23cm、0.53cm和0.10cm與CK（0.53cm、0.50cm、0.73cm和1.7cm）相比較，相對抑制率為67.92%、54.00%、27.40%和94.12%。由上可知，MT310對烤煙幼苗生長有一定抑制作用，其中對根生長抑制作用最明顯，相對抑制率為94.12%。

3 結論及討論

本研究表明MT310及其揮發(fā)性物質（VOCs）對煙草赤星病菌（A.alternata）、黃連根腐病菌（Fusarium sp.）、石榴干腐病菌（Phomopsis sp.）、高粱葉斑病菌（P.sorghina）和高粱炭疽病菌（C.graminicola）等5種植物病原真菌具明顯抑制作用，其中菌株MT310與其揮發(fā)性物質，對煙草赤星病菌（A.alternata）的抑菌效果最佳，抑制率分別為68.76%和49.96 %。說明該菌株有多種方式對植物病原真菌產生抑制作用。試驗結果表明，MT310對烤煙幼苗生長有一定抑制作用，且對根生長抑制作用最顯著。此外，MT310能夠產生嗜鐵素和磷酸酯酶等生防相關酶類物質，并具備良好的運動和形成復雜生物膜結構的能力，說明貝萊斯芽孢桿菌（B.velezenss）是一株田間表現(xiàn)良好具有生防潛力的菌株。

生防菌株能夠有效發(fā)揮拮抗作用，定殖能力是主要條件，為保證生防菌能在植物根圍或葉圍等環(huán)境中生長繁殖，生防菌的定殖能力與運動性和生物膜形成密切相關[13-15]。在生防菌定殖成功后，菌株可以通過空間競爭、拮抗作用、誘導植物產生抗性和促生等機制，達到防治病害的目的[16-19]。結合前期研究[1]和實驗表明，MT310具有定殖烤煙根部的潛力，是其發(fā)揮生防作用的主要條件之一。

據(jù)報道，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）RSS-55對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）有極強的抑制效果，抑制率高達93.33% [20]。研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7對9株植物病原真菌均具有良好的拮抗效果[21]。此外，芽孢桿菌的揮發(fā)性物質對病原菌同樣具有抑制作用;解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens） XJ5的揮發(fā)性物質對蘋果褐腐病菌（Monilinia fructigena）等多種植物病原真菌具有很好的抑制效果[22];馮福山等[23]通過固相微萃?。℉S-SPME）收集枯草芽胞桿菌（B.subtilis）Y13的揮發(fā)性氣體，與10種植物病原真菌進行對峙，發(fā)現(xiàn)均具有很好的抑制效果，其中對果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）抑制效果最佳，值為83.90%。MT310及其揮發(fā)性物質同樣能抑制多種植物病原真菌的生長，且對煙草赤星病菌（A. alternata）的抑制效果最明顯，說明MT310具有生防潛力，是一株值得開發(fā)的生防芽孢桿菌。

芽孢桿菌可以分泌出磷酸脂酶和嗜鐵素等物質從而分解土壤中的難溶性磷和固態(tài)鐵，使難溶性元素，降解成可供植物直接吸收利用的離子，促進植物生長，同時還可改變土壤中病原菌生長環(huán)境，從而達到抑制病原菌生長的作用;并且有些芽孢桿菌的揮發(fā)性物質還可促進植物生長發(fā)育[24-26]。MT310可以產生嗜鐵素及磷酸酯酶等生防相關類酶類，這表明MT310能夠對土壤中的真菌病害的營養(yǎng)環(huán)境產生影響，從而抑制病原真菌的生長。室內試驗表明，MT310揮發(fā)性物質抑制烤煙K326幼苗生長，而同樣從烤煙根圍分離的另一株芽孢桿菌MT323卻能促進K326幼苗生長[27]。兩株芽孢桿菌所產生的揮發(fā)性物質有何異同，值得進一步深入研究。MT310作為生防制劑在大田防治病害時，應進一步觀察其對煙株生長的影響，達到既不影響煙株生長，又可防治病害的目的。

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